激光掃描共聚焦顯微鏡(研究生)1講解課件

1、生物物理教研室陳麗娜 激光掃描共聚焦顯微鏡 （LSCM） 授課內(nèi)容 一、LSCM的發(fā)展與現(xiàn)狀 二、LSCM的成像原理及組成 三、LSCM的使用步驟四、LSCM的基本功能 五、LSCM在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用 1957年，Marvin Minsky提出共聚焦原理； 1978年，Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡； 1982年，BIO-RAD公司第一個(gè)推出商品化激光掃描共聚焦顯微鏡； 1985年，Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章； 1987年，發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微

2、鏡。一、激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)展與現(xiàn)狀儀器名稱生產(chǎn)商型號(hào)BD高通量活細(xì)胞共聚焦分析系統(tǒng)400系列美國(guó)BD公司Pathway415、Pathway435BD 高通量活細(xì)胞共聚焦分析系統(tǒng)800系列美國(guó)BD公司800系列BD全光譜活細(xì)胞共聚焦高速掃描系統(tǒng)美國(guó)BD公司CARV尼康共焦顯微鏡尼康（Nikon)C1共焦激光掃描顯微鏡徠卡儀器有限公司 LeicaTCS-SP2OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡OLYMPUSFV300OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡OLYMPUSFV1000NIKON共聚焦顯微鏡尼康（nikon)尼康（nikon）C1-plusUltraView高速掃描型激光共聚集系統(tǒng)Perkin

3、ElmerUltraView高通量共聚焦顯徽細(xì)胞圖像分析測(cè)定系統(tǒng)GE HealthcareIN Cell Analyzer 3000時(shí)間分辨激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)德國(guó)耶萊公司TauMap德國(guó)ZEISS激光共聚焦顯微鏡德國(guó) ZEISSLSM 510 SYSTEM德國(guó)ZEISS激光共聚焦顯微鏡德國(guó)ZEISSLSM 510 PASCAL SYSTEMFluoView FV1000共聚焦顯微鏡 FV1000系統(tǒng)完美地整合了兩套相互獨(dú)立的掃描模塊在一套系統(tǒng)內(nèi)，在一束激光進(jìn)行實(shí)驗(yàn)刺激的同時(shí)，另一束激光實(shí)時(shí)地對(duì)樣品進(jìn)行掃描，從而記錄完整的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。 美國(guó)Meridian公司的ACAS uLTIMA312

4、為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器。 它能達(dá)到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實(shí)時(shí)，真彩色的激光共聚焦原色圖象。 BIO-RAD公司第七代Radiance2100型激光掃描共聚焦顯微鏡是全世界唯一無(wú)需人工調(diào)整的激光掃描共聚焦掃描顯微鏡 1）激光光源 2）計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 3）共聚焦系統(tǒng) 4）光學(xué)探測(cè)系統(tǒng) 5）圖像分辨率 6）掃描方式激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統(tǒng)硬件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)1）、Image Analyze2）、Ratio Analysis和 Kinetics3）、Cell Cell Communication and FRAP4）、Cell List5）、Cell So

5、rting 6）、Confocal ImagingMitotic cells, multiple fluorescence (NCI Maryland) 激光掃描共聚焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy ，簡(jiǎn)稱LSCM）是近代生物醫(yī)學(xué)圖象儀器的最重要發(fā)展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見(jiàn)光激發(fā)熒光探針，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，以及在亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化等。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)

6、等領(lǐng)域，對(duì)生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時(shí)和定位研究具有很大的優(yōu)越性，成為這些領(lǐng)域新一代強(qiáng)有力的研究工具。 二、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成1、LSCM的基本結(jié)構(gòu) 熒光顯微鏡系統(tǒng)及樣品臺(tái) 激光光源 掃描器 圖象存儲(chǔ)及處理系統(tǒng) LSCM各部分相互關(guān)系示意圖 計(jì) 算 機(jī) 控 制 系 統(tǒng) 控制 共聚焦顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的比較 計(jì)算機(jī)數(shù)字圖象處理分析系統(tǒng) 普通光學(xué)顯微鏡場(chǎng)光源干擾激光掃描共聚焦顯微鏡激光光源共軛聚焦原理和裝置照相Light Microscopy A C. elegans EmbryoG at pro-nuclei meetingG stage (before dividing i

7、nto 2-cell embryo) Differential Interference Contrast(DIC; Nomarski) Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) Multiphoton Fluorescence Excitation Microscopy (MPFE) 2、LSCM的工作原理 激光束 掃描器 接收器 計(jì)算機(jī) 載物臺(tái)的升降 “光學(xué)切片” “細(xì)胞CT” LSCM組成光路的示意圖 Beam path in the confocal laser scanning microscope 共聚焦原理示意圖（一）激光光源 （1）、激

8、光譜線（2）、激光器開(kāi)閉和電壓調(diào)節(jié)（3）、激光強(qiáng)度回饋穩(wěn)定電路設(shè)計(jì)（4）、輔助設(shè)備波長(zhǎng)（nm） 功率(mW) 激光器類型 325 1030 氦鎘(He-Cd)激光 351 300 帶紫外的水冷式氬離子激光 364 20 風(fēng)冷氬離子激光（Ar-ion） 442 11 氦鎘激光 457514 25 小型氬離子激光 543 1.25 綠氦氖(He-Ne)激光 630 33 外諧振器半導(dǎo)體激光 630 3 碰撞脈沖染料激光 632 3.5 氦氖激光 7001100 2 000 藍(lán)寶石激光 1 152 1 氦氖激光 （二）掃描器 掃描器針孔光欄（pinhole）分光鏡發(fā)射熒光分色鏡檢測(cè)器1）針孔光欄 2

9、）分光鏡 作用 位置 位置 作用 3）發(fā)射熒光分色鏡 4）檢測(cè)器 位置 作用 位置 作用 掃描裝置光束掃描 臺(tái)階掃描 掃描方式 原 理優(yōu)缺點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)掃描系統(tǒng) （1）、激光掃描系統(tǒng)通過(guò)照相通道或熒光通道和顯微鏡相連，與所接顯微鏡一體化設(shè)計(jì)（2）、檢測(cè)器數(shù)量 （3）、共聚焦針孔 （4）、掃描分辨率及灰度級(jí) （5）、連續(xù)分光設(shè)計(jì)系統(tǒng)（或其它光譜分離系統(tǒng)）50-300微米 （6）、光譜掃描功能 （7）、掃描速度及速度調(diào)節(jié) （8）、掃描方式 XYZt任意組合 點(diǎn)掃描 線掃描 X掃描 平面掃描 XY、XZ掃描 xyz, xyzt掃描 局部放大掃描 光譜模式下，多通道同時(shí)掃描。（9）、掃描

10、旋轉(zhuǎn)、光學(xué)放大（變倍）（10）、可即時(shí)或延時(shí)進(jìn)行掃描 （11）、有線和幀方式的多重掃描功能ROI(region of interesting，感興趣區(qū)域） 實(shí)時(shí)（real time）顯示（12）、在改變掃描分辨率及掃描速度等后，無(wú)須很復(fù)雜地對(duì)儀器參數(shù)重新設(shè)置（13）、有記憶功能 （14）、有專用的圖象數(shù)據(jù)庫(kù) （15）、系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計(jì)，便于整個(gè)系統(tǒng)的擴(kuò)展和升級(jí)換代Drosophila embryo, brain, 3D Projection - extended depthoffocus“ (Prof. Reichert, Labor Neurobiologie University of

11、Basel)（三）光學(xué)系統(tǒng)（顯微鏡） 、倒置熒光萬(wàn)能顯微鏡 、顯微鏡上的外接接口 、熒光顯微鏡的載物臺(tái)上裝有微量步進(jìn)馬達(dá) 、熒光鏡座要裝有防振動(dòng)裝置 、裝有光路轉(zhuǎn)換裝置 、配備高數(shù)值孔徑的油浸或水浸物鏡 、載物臺(tái)支架和附件的配置 (10)、4位顯微鏡熒光濾色片組，置換方便，覆蓋紫外和可見(jiàn)光波長(zhǎng)、熒光顯微鏡的參數(shù)要與光路系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)控制軟件系統(tǒng)相匹配、汞燈光線的強(qiáng)度可調(diào) 熒光源 單光子激勵(lì)（左），多光子激勵(lì)（右）激發(fā)熒光能量圖 單光子（1）單光子（2）雙光子（2）單、雙光子激發(fā)產(chǎn)生熒光過(guò)程的示意圖 熒光熒光 熒光光譜 分隔發(fā)射的熒光 Separation of fluorescence emis

12、sions by means of dichroic filters（四）計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 控制硬件的軟件功能： 控制電動(dòng)顯微鏡； 選擇激光波長(zhǎng)，調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度； 拍攝2-5維圖像； 選擇光譜拍攝范圍，分辨率，激發(fā)光擋片位置。 應(yīng)用軟件功能（圖象處理、數(shù)據(jù)分析、生物學(xué)應(yīng)用等）： 多通道疊加，三維重建，旋轉(zhuǎn)，生成AVI文件，Average拍攝模式提高信噪比；熒光強(qiáng)度動(dòng)態(tài)分析，動(dòng)態(tài)顯示，Ratio值測(cè)量（鈣離子等）；FRAP/FLIP；線性光譜拆分，自定義染料光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，背景扣除；圖像調(diào)節(jié) 亮度，對(duì)比度，Gamma；單個(gè)通道分別調(diào)節(jié)或多個(gè)通道同時(shí)調(diào)節(jié)；圖像處理：旋轉(zhuǎn)，裁剪，多種濾鏡（Kirsh/Lapla

13、ce/Low pass/Median），添加標(biāo)尺，箭頭，文字等；圖像分析：直方圖，距離，強(qiáng)度，強(qiáng)度斷面分布；VBA模塊：宏功能，可以錄制，編輯，回放，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操作；多種視圖：1D，2D，正交視圖，圖片疊加等；光譜分析具有多種方式選擇，支持盲法拆分，方便用戶使用；具有專業(yè)的FRAP（熒光漂白），F(xiàn)RET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移）軟件包。 三、激光掃描共聚焦顯微鏡的使用步驟（一）樣品制備1組織切片標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標(biāo)本無(wú)論是石蠟切片還是冰凍切片，均為越薄越好。2細(xì)胞標(biāo)本 細(xì)胞種類和純度，細(xì)胞密度和形態(tài)。3承載細(xì)胞的器皿 Petri皿和玻片。（二）熒光探針的選擇標(biāo)

14、記生物樣品的探針大約分為：1）蛋白質(zhì)、單糖和多糖探針；2）細(xì)胞器探針；3）核酸探針；4）細(xì)胞活性探針；5）膜和受體探針；6）細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)pH探針；7）金屬探針；8）分子的特殊基團(tuán)結(jié)合探針；9）其他（4）、按軟件要求設(shè)置有關(guān)參數(shù)，進(jìn)行觀察和分析。（三）儀器使用步驟（1）、選擇激光器類型 （2）、選擇相應(yīng)的濾片 （3）、根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)軟件 Xy觀察模式的圖象獲得設(shè)置染色方法顯微鏡和掃描的配置設(shè)置物鏡放大率設(shè)置變焦率為1x設(shè)置所需通道設(shè)置最高掃描速度設(shè)置xy觀察模式執(zhí)行重復(fù)掃描校正對(duì)于確定z位置觀察所需復(fù)合的各部分條件設(shè)置觀察范圍校正圖象亮度設(shè)置較低的掃描速度重新校正圖象亮度停止重復(fù)掃描

15、獲得圖象儲(chǔ)存圖象1） DNA用Hoechst33342標(biāo)記（藍(lán)），2）細(xì)胞膜用 NBD-PC染色（綠），3）線粒體用Mitotracker標(biāo)記（紅）三重?zé)晒馊旧珗D譜：活HT細(xì)胞1、“更多信號(hào)！” 1）、 通過(guò)減慢掃描速度 2）、 使用“平均”方法 3）、 增加發(fā)射濾鏡的帶寬 4）、 加大針孔直徑； 注意：光學(xué)切片的厚度也會(huì)相應(yīng)地增大。 5）、 增大激發(fā)能（激光功率）； 注意：漂白效應(yīng)、飽和效應(yīng)和光毒效應(yīng)。如何改善圖像質(zhì)量3、“更可靠！” 1）、使用多軌 2）、提供預(yù)定義配置。 3）、可同時(shí)定義和使用任何形狀的多個(gè)研究區(qū)。2、“更多細(xì)節(jié)！” 1）、使用較高數(shù)值孔徑 (NA) 的物鏡 2）、增加“

16、幀大小” = 每條線的像素值 + 每幀的線條數(shù) 3）、優(yōu)化掃描焦距 (Z) 4）、增加動(dòng)態(tài)范圍Cultured cells, multiple fluorescence (Prof. Wunderli- Allenspach, ETH Zrich) Cell culture, 3D shadow projection (calculated by Imaris, Bitplane AG, Zrich) showing tight junctions (red) and cytoskeleton structures (green) (Prof. Wunderli- Allenspach, ET

17、H Zrich)四、激光掃描共聚焦顯微鏡的基本功能 主要功能 采集圖像 定量測(cè)定相關(guān)參數(shù)熒光信號(hào)定性定位觀察（一）采集和處理圖像 1、無(wú)損傷逐層掃描樣品采集二維及三維熒光圖像LSCM的成像特點(diǎn)：（1）、保持樣品的完整性。（2）、采集多重（波長(zhǎng)）熒光分解及合成（overlay）圖像。（3）、所采集的熒光圖像比普通熒光顯微鏡質(zhì)量好，更利于形態(tài)學(xué)觀察。（4）、可以只選擇出樣品中感興趣的區(qū)域（regions of interest，ROI）和深度進(jìn)行掃描。（5）、獲取三維重建圖像2、獲取透射光及反射光圖像有、無(wú)熒光的樣品均可以用LSCM采集到其透射光圖像。（二）熒光分子的定性及定位1、定性鑒定待測(cè)熒光

18、物質(zhì)2、熒光信號(hào)的定位（1）、單熒光定位（2）、多重?zé)晒鈽?biāo)記共定位（3）、熒光與透射光共定位Confocal micrograph of milk showing milk protein (green), fat (blue), sugar crystals (black) and cocoa solids (red). Bar = 25 mm （三）定量測(cè)定 LSCM將所采集的共聚焦圖像中的相關(guān)信息轉(zhuǎn)化為定量數(shù)據(jù)，即稱之為定量測(cè)定。（1）圖像中的任意區(qū)域（或線）的熒光強(qiáng)度。 （2）熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間、空間和波長(zhǎng)的變化曲線和數(shù)據(jù)。（1）圖像中的任意區(qū)域（或線）的熒光強(qiáng)度（3）圖像內(nèi)的幾何參數(shù)，包括面積、厚度、空間距離、體積等。 按照定量測(cè)定中是否含有時(shí)間控制程（t），將掃描模式分為動(dòng)態(tài)檢測(cè)和靜態(tài)測(cè)量。The figure shows Ca2+ response to NAADP uncaging in mature Asterina pectinifera oocytes measured with confocal microscope. （四）LSCM可獲取的圖像種類 LSCM將所采集的光學(xué)圖像分為兩種：熒光圖像和光鏡圖像。 1）單獨(dú)采集熒光和光鏡圖像； 2）分通道道同時(shí)采集多重?zé)晒鈭D像和透射光圖像，通過(guò)這些圖像相互組合，同時(shí)展示在一幅畫面上； 3）按照