課題2　多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片段 (2)

1、5.2多聚酶鏈式反應(yīng)擴增DNA片斷一、基礎(chǔ)知識（一）DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1、組成元素脫氧核苷酸2、基本單位胞嘧啶脫氧核苷酸C3、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5端3端5端3端 識別 ： DNA分子-OH端為3端; 磷酸基團的末端為5端。解旋酶催化（氫鍵斷裂）解旋：模板（在DNA聚合酶的催化下，利用游離的脫氧核苷酸進行）以母鏈為模板進行堿基配對母鏈（舊鏈）子鏈（新鏈）形成兩個子代DNA:邊解旋邊復(fù)制組成半保留復(fù)制DNA復(fù)制的過程1、概念：2、場所：3、時期：4、條件5、復(fù)制過程：6、復(fù)制特點7、準確復(fù)制原因8、復(fù)制的生物學(xué)意義：有絲分裂間期、減數(shù)分裂第一次分裂的間期模板：

2、 原料： 能量： 酶： DNA的兩條母鏈游離的脫氧核苷酸 ATP解旋酶、DNA聚合酶等 DNA雙鏈提供精確的模板（1）邊解旋邊復(fù)制（2）半保留復(fù)制細胞核（主要）、線粒體、葉綠體解旋合成互補子鏈形成子代DNA堿基互補配對原則將遺傳信息從親代傳給子代，保持了遺傳信息的穩(wěn)定性、連續(xù)性DNA分子復(fù)制的過程DNA的復(fù)制就是指以親代DNA為模板合成子代DNA的過程（二） PCR(多聚酶鏈式反應(yīng)）1、 DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此， DNA復(fù)制需要引物2、 DNA聚合酶作用過程當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后， DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DN

3、A鏈， DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸3、 PCR原理在80100C的溫度范圍內(nèi)， DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈。 PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化。4、 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用5、 緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種

4、引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出特點 。6、 PCR技術(shù)的特點7、PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別： 1. PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要； 2. PCR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性； 3. PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。 區(qū)別酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐熱的DNA聚合酶溫度細胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需9095高溫結(jié)果合

5、成DNA分子合成DNA片段或基因聯(lián)系(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3端開始連接脫氧核苷酸比較項目DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所細胞內(nèi)(主要在細胞核內(nèi))細胞外(主要在PCR擴增儀中)1、PCR儀（一）設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實驗操作2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。1.準備2.移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方

6、將所需用的試劑擺放在實驗桌上。用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑?；旌虾笊w嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4.離心離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。（三） PCR的反應(yīng)過程1、PCR的反應(yīng)步驟PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復(fù)性和延伸變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備2、循環(huán)過程靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步 ：加熱變性復(fù)性（

7、退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火延伸DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸靶序列 靶序列第1個 PCR 循環(huán)完成后 ：得到兩個拷貝的靶序列循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量4、PCR 循環(huán)

8、的結(jié)果 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會與引物結(jié)合，進行DNA的延伸1、準備2、移液（二）實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑過程：蓋嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁注意：3、混合B、手指輕輕彈擊微量離心管的管壁，目的是使反應(yīng)液混合均勻A、離心管口的蓋子一定蓋嚴，防止實驗中脫落或液體外溢將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序過程：將微量離心管放在離

9、心機上,離心約10s4、離心5、反應(yīng)離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6、注意事項隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭利用PCR技術(shù)擴增目的基因（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算三、課題成果評價1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實驗中DNA含量的測定1 、原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰

10、值的大小與DNA的含量有關(guān)2 、過程稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值計算光吸收波長nm2602402202800.10.2計算DNA含量（ g ）50 x (260nm的讀數(shù)） x 稀釋倍數(shù)50：1 g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02比色杯四、實驗小結(jié) PCR儀加熱使（ ）變性, 復(fù)性使引物與模板DNA（ ）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( ),在（ ）的作用下,以 （ ）為原料,以（ ）為復(fù)制的起點

11、,合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（ ）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72五.課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出特點DNA母鏈：提供復(fù)制的模板解旋酶： 打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶： 催化合成DNA子鏈ATP：為復(fù)制過程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3端開始連接脫氧核苷酸PCR反應(yīng)的條件80100耐熱的DNA聚合酶當堂檢測(4)過程：第一步：加熱至9095,_ ;第二步：冷卻至_，引物