分子生物學平臺上的食品微生物快速檢測及鑒定技術(shù)-PPT精選課件

1、分子生物學平臺上的食品微生物快速檢測及鑒定技術(shù)在分子生物學技術(shù)上引領(lǐng)前行7/24/20227/24/2022Life Technologies Profile美國生命技術(shù)公司營業(yè)收入$3.2B產(chǎn)品種類50,000國家160員工數(shù)量9,600客戶數(shù)量75,000專利許可3,600Note: LTM revenue as of September 30, 2009; does not include Mass Spec JV revenue臨床分子診斷基因治療藥物再生醫(yī)學工業(yè)生物制藥法醫(yī)食品安全動物健康科研PCR技術(shù)測序技術(shù)細胞(分離, 操作，分析)“Tools Provider” 提供工具“So

2、lutions Provider”提供解決方案Applied Biosystems 分子生物學技術(shù)的領(lǐng)導者超過25年的分子生物學產(chǎn)品開發(fā)歷程1982年, 全球第一臺蛋白質(zhì)測序儀；1986年，全球第一臺核酸測序儀1986年，全球第一個實時熒光定量技術(shù)和TaqMan技術(shù)全球30,000 個實驗室的220,000 儀器正在被使用7/24/2022Life Technology 食品微生物系統(tǒng)解決方案樣品前處理Dynabead磁珠富集MagMAX Express核酸自動提取快速檢測RapidFinder常規(guī)qPCR檢測超高通量的篩查OpenArray芯片鑒定與分型MicroSEQ ID 基因分析靈活的

3、組合方案，滿足不同層次的應(yīng)用需求7/24/2022病原微生物樣品制備PrepSEQ 快速離心核酸提取試劑盒AB專利的離心柱材料較化學法，更加有效去除PCR抑制劑步驟少、操作簡單可處理多達750uL的樣品無需額外的設(shè)備適合少量樣品采用PrepSEQ快速離心試劑盒，結(jié)果明顯優(yōu)于普通直接裂解；尤其對于存在PCR抑制劑的樣品，普通裂解法可能無法檢出， 而PrepSEQ快速離心法可以得到一致的結(jié)果樣品：巧克力檢測項目：沙門氏菌樣品：布里奶酪檢測項目：李斯特菌*標注的是因PCR抑制劑的存在導致樣品中待測菌無法檢出7/24/2022SamplePCR compatibleNA solutionLysisMa

4、gnetic Particles +BindingSolutionWash2XMagneticSeparationMagneticSeparationElutionMME-96 核酸提取儀自動化高通量自動化的理想選擇PrepSEQ 核酸提取試劑盒提高核酸回收率有效去除抑制劑食品，環(huán)境及臨床樣品病原微生物樣品制備+自動化的核酸提取流程，一次最多處理96個樣品7/24/2022樣品制備軟件 RapidFinder Express 軟件PrepSEQ RapidSpin樣品制備系統(tǒng)檢測試劑MicroSEQ 食品致病菌檢測試劑盒儀器7500 快速實時熒光定量PCR儀器PrepSEQ NA Extrac

5、tion 樣品制備系統(tǒng)食品致病菌檢測解決方案7/24/2022食品及環(huán)境病原微生物檢測致病菌系列沙門氏菌 （AOAC certificated）單增李斯特菌（AOAC certificated）李斯特菌屬 （AOAC certificated）大腸桿菌O157:H7 （AOAC certificated）阪崎腸桿菌空腸彎曲桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌彎曲桿菌多重檢測：空腸/大腸/紅嘴鷗金黃色葡萄球菌創(chuàng)傷、霍亂和副溶血性弧菌的多重檢測定制設(shè)計環(huán)境和生物安全系列軍團菌屬定量檢測試劑盒嗜肺軍團菌定量檢測試劑盒土拉弗朗西斯菌檢測試劑盒炭疽芽孢桿菌檢測試劑盒布魯氏菌屬檢測試劑盒鼠疫耶爾森菌檢測試劑盒7

6、/24/2022最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性引物、探針設(shè)計：基于 SOLiD 測序技術(shù)分析結(jié)果新的設(shè)計，針對O157:H7特有的序列，避免O55:H7被測出- 雙重目標基因設(shè)計，提高特異性- 將O55 全基因組測序，并與 O157相比較ORFs(both strands)GC content per 1000 bpO157:H7 (EDL933) reference sequenceO157:H7 SOLiDcoverageO55:H7 SOLiDcoverageO157:H7 unique sequences7/24/2022TaqMan 實驗數(shù)據(jù)驗證：包括低濃度的O157:H7

7、/HM 不同菌株包括對非O157:H7的大腸桿菌菌株的檢測不含O157的真實牛肉樣品最新O157:H7檢測試劑盒：提升特異性7/24/2022O157:H7檢測試劑盒：8小時內(nèi)獲得結(jié)果6小時 BHI增菌60分鐘 DNA 提取40分鐘PCR25g 牛肉手工操作時間 1小時10 分鐘10 分鐘整個流程 8小時MicroSEQ 大腸桿菌 O157:H7 工作流程10分鐘樣品制備設(shè)置10 分鐘10分鐘 PCR 設(shè)置市場上最快的檢測方法已經(jīng)獲得 AOAC 及 AFNOR 的認可7/24/2022MicroSEQ 沙門氏菌檢測操作流程 快速獲得結(jié)果，最少的手工操作時間 18 小時獲得結(jié)果過夜增菌提取反應(yīng)設(shè)

8、置 運行及分析7/24/202216S rDNA雙氮養(yǎng)弧菌與創(chuàng)傷弧菌，解蛋白弧菌與副溶血性弧菌，最小弧菌與霍亂弧菌的親緣關(guān)系很近基于公共數(shù)據(jù)庫， AB自有數(shù)據(jù)庫，特定基因測序分析，篩選出針對三個目標菌種的8個不同基因的19個AssayMicroSEQ 微生物鑒定系統(tǒng)快速同時檢測創(chuàng)傷弧菌，副溶血性弧菌，霍亂弧菌7/24/2022弧菌多重PCR設(shè)計考慮到多重檢測在一起的相互影響，三個不同的種分別設(shè)計了1-2套不同的Assay7/24/2022優(yōu)化配方， 最終實現(xiàn)弧菌的多重檢測通過不同的熒光標記，將副弧、霍亂、創(chuàng)傷這三個不同種的弧菌區(qū)分開來7/24/2022開放的系統(tǒng):滿足不同的食品檢測需求 致病菌

9、檢測試劑盒沙門氏菌，單增李斯特菌大腸桿菌O157:H7空腸彎曲桿菌，金葡菌綠膿桿菌，副弧/霍亂/創(chuàng)傷軍團菌,坂崎桿菌個性化訂制引物、探針合成服務(wù) 轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒玉米轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒大豆轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒 動物健康檢測試劑盒禽流感，新城疫藍耳病，豬胎毛滴蟲豬肺炎支原體，豬瘟藍舌病，副結(jié)核牛病毒性腹瀉病毒 牛呼吸道合胞體病毒 客戶實驗室設(shè)計合成實驗室設(shè)計 人類傳染病檢測試劑盒甲型H1N1檢測甲型流感通用型流感亞型 H5/H7/N1炭疽芽孢桿菌/布魯氏菌鼠疫耶爾森土拉弗朗西斯菌 肉類ID鑒定試劑盒豬肉ID鑒定牛肉ID鑒定雞肉ID鑒定7/24/20227/24/2022OpenArray定量PCR微流

10、體芯片 HydrophilicHydrophobicData Points per day with OpenArray基因分型基因表達70,000 32,000 OpenArray Plate Layout子陣48 (12 x 4)通孔 : 33nl64 通孔/子陣 (8 x 8)SPATIAL MULTIPLEXING3072 個通孔：相當于 32 x 96孔板或者 8 x 384微孔板7/24/2022TaqMan OpenArray 玻片: 格式SNP位點數(shù)163212864192256樣本數(shù)1449648241612XXXXXXOpenArray SNP芯片：格式7/24/2022為

11、什么使用 OpenArray 做病原體檢測一次實驗，檢測并定量多種病原體生物 一次檢測多樣本 快速出結(jié)果 靈敏度和準確性優(yōu)于標準的培養(yǎng)法和免疫法Life Tech 可以幫助用戶設(shè)計所需的芯片7/24/2022應(yīng)用案例：人類病原體檢測來自Robert Slinger 小組在加拿大安大略省兒童醫(yī)院的實驗結(jié)果從臨床樣品(咽喉拭子棒）快速檢測多種呼吸道病毒或病菌. 驗證 在OpenArray 平臺上檢測納升級別的qPCR反應(yīng)的適用性“We wanted to see if we could use qPCR to figure out the cause of infections, and thou

12、ght the OpenArray platform had the most potential because we could do thousands of reactions at once,” Robert Slinger, CHEO7/24/2022Viral Influenza A-pan Influenza A H3, H1 & H5 Influenza A H1 Swine 2009 strain Influenza A N1 oseltamivir-resistance mutation Influenza B Respiratory syncytial virus A

13、and B Parainfluenza virus 1-4 Rhinovirus Enterovirus Coronavirus OC43, NL63, HKU1, 229E Human metapneumovirus Bocavirus Adenovirus一張芯片整合多種呼吸道病原體檢測BacterialMycoplasma pneumoniaeChlamydophila pneumoniaeLegionella pneumophilaMycobacterium tuberculosisStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pyogenesStaphy

14、lococcus aureusMethicillin-resistant Staphylococcus aureusStreptococcus dysgalactiae subsp. Equisimilis (Group C and G streptococci)Streptococcus agalactiae (Group B streptococcus)Haemophilus influenzaeMoraxella cararrhalisBordetella pertussisBordetella parapertussisOne sample 每個樣本檢測22種呼吸道病毒和 16種呼吸道

15、 細菌 每張芯片檢測12個樣本 每個檢測3重復 每個病毒檢測3個target 每個和樣品8個空白對照內(nèi)參人工合成對照qPCR Assays7/24/2022MicroSEQ 微生物鑒定系統(tǒng)7/24/2022微生物鑒定分型發(fā)展的三個階段 第一階段：依據(jù)表型鑒定分型培養(yǎng)、格蘭氏染色、生理生化、形態(tài)學等黃金時代：上世紀80年代- 本世紀初 第二階段：片段長度多態(tài)性分析 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、細菌的核糖體基因分型(Ribotyping)、多位點序列分析(MLST)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP) 、重復序列擴增(rep-PCR

16、)黃金時代：本世紀初-至今 第三階段：基因序列分析（分子生物學的方法）采用測序技術(shù)，確定目標基因的每個堿基黃金時代：現(xiàn)在- 未來5-10年/下一代單分子測序技術(shù)產(chǎn)生7/24/2022 基于16S核糖體基因測序的鑒定方法 伯杰氏手冊推薦細菌命名學的新標準 伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊采用16S rDNA 測序提供更高的分類學信息 快速準確提供鑒定結(jié)果客觀性，重現(xiàn)性好方便不同團體、實驗室間信息共享和交流正在成為微生物鑒定的金標準7/24/2022MicroSEQTM 微生物鑒定系統(tǒng)不需要事前掌握微生物的信息 微小的可見的單菌落即可無需革蘭氏染色無需生化試驗無需鑒定的經(jīng)驗Easy 5-step Workfl

17、ow7/24/2022結(jié)果 數(shù)據(jù)比對結(jié)果 種最高匹配同源性 遺傳進化樹差異 7/24/2022 MicroSEQ ID 經(jīng)過驗證的強大數(shù)據(jù)庫全部經(jīng)過驗證 16S 500:2020 entries16S 全基因:1261 entriesD2 (真菌):1113 entries每隔一年半定期更新新增加的菌 最新的命名原則包括諸多環(huán)境分離菌的信息使用者可以登錄公司網(wǎng)站提供建議 microseq最大，最全面且經(jīng)過驗證的細菌和真菌數(shù)據(jù)庫7/24/2022MicroSEQ ID 鑒定技術(shù)的特點MicroSEQ ID 的方法準確重現(xiàn)性好 穩(wěn)定簡單 將不能或難以鑒定的微生物種類從20 下降到2！7/24/20

18、22微生物鑒定及菌株分子分型滿足不同層次的應(yīng)用需求MicroSEQ微生物鑒定系統(tǒng)基于16S rRNA 序列測定實現(xiàn)細菌在種水平的鑒定 基于核糖體大亞基 (LSU) 序列測定實現(xiàn)真菌在種水平的鑒定菌株分型的分子平臺測序檢測MLST片段分析AFLPMLVA微生物耐藥機理的研究SNaPshot MultiplexSSCP7/24/2022遺傳分析儀在MLVA研究中的應(yīng)用多重 PCR選擇正確的擴增引物是取得成功的關(guān)鍵16 個甚至更多的 STR 位點同時被擴增7 repeats8 repeatsSTR 位點由特定引物延伸的旁側(cè)序列具有保守性不同菌株的串聯(lián)重復序列拷貝數(shù)存在差異AMELD3TH01TPOX

19、Penta DPenta EFGAD21D18CSFD16D7D13D5VWAD8由遺傳分析儀電泳分離PCR擴增產(chǎn)物/片段結(jié)合不同的熒光染料標記和遷移率的修飾技術(shù)，實現(xiàn)多重分析7/24/2022STEC O157/ Salmonella Typhimurium ProtocolMLVA 是食源性微生物分型國際組織Pulsenet推薦的食品微生物分型方法，中國CDC及各省級CDC均設(shè)立相關(guān)機構(gòu)參與其中. 7/24/2022大腸桿菌7個位點的 MLVA， 實現(xiàn)對O157:H7 的分型Lindstedt, et al. (2019) Ann. Clin. Microbiol. Antimicr.,

20、2, 12.Seven locus MLVA scheme in a single dye channelIdentified 47 distinct MLVA patterns among 73 O157:H7 strainsSequence alignment of the Vhec4 VNTR loci from isolates G5300 and IHE5344. The results from the sequencing show that the electrophoretic mobility shift between isolates IHE5344 (upper strand) and G5300 (lower strand) is caused by different numbers of AAATAG repeat units alone Escherichia coli O1