工作報告之對流免疫電泳實驗報告

1、對流免疫電泳實驗報告【篇一：實驗十一免疫電泳】免疫電泳技術抗原與抗體的結合在沉淀反應中，呈一定的分子比例。不同抗原和 抗體之間的分子比例是不同的，但只有在分子比例合適時，才出現(xiàn) 可見的沉淀。所以沉淀能否出現(xiàn)并不完全反映抗原和抗體是否存在 和發(fā)生結合?？乖Y合多個抗體分子，稱抗原為多價；抗體一般只 能結合兩個抗原分子（igm類抗體分子通常可以結合5個抗原分子） 的抗原決定法簇，故為二價。只有在彼此的結合價飽和時，才出現(xiàn) 大量的抗原-抗體復合物沉淀。當抗原與抗體的比例合適時，即二者結合價彼此飽和，就可形成網(wǎng) 狀結構的大分子抗原-抗體復合物沉淀，稱為等價帶。若比例不合適 時，抗體或抗原過量，則雖有抗

2、原、抗體的結合，但不能大量形成 網(wǎng)狀結構的大分子復合物，沉淀量很少，甚至不出現(xiàn)沉淀。在抗原、 抗體數(shù)量關系曲線中，抗體過剩區(qū)域稱為抗體過剩帶，抗原過剩區(qū) 域稱為抗原過剩帶。如圖1所示，在等價帶的反應液中加入過量的 抗原或抗體，沉淀復合物就會有部分溶解，甚至全部溶解的現(xiàn)象。 這是由于新加入的抗原或抗體競爭地結合相應的抗體或抗原，使網(wǎng) 狀大分子結構破壞，形成小分子復合物，致使沉淀出現(xiàn)溶解，沉淀 量減少甚至完全消失。在沉淀反應中，由于抗原過量而不出現(xiàn)沉淀 的現(xiàn)象，稱為前帶現(xiàn)象。此時不能誤認為無沉淀就是無抗原存在， 為了檢測就必須稀釋抗原。抗體過量時，稱為后帶現(xiàn)象，同理需要 稀釋抗體進行檢測。圖1的位

3、置抗原與抗體的結合是依賴于兩者分子結構的互補性，故其特異性高。 這種結合也是相當穩(wěn)定的。在一定條件下（過酸、過堿或濃鹽存在 下），二者可以分開，即結合是可逆的。解離后的抗原、抗體的活 性一般保持不變。雙向免疫擴散測定法原理雙向擴散法（double diffusion）又稱瓊脂擴散法，是利用瓊脂凝膠為 介質的一種沉淀反應。瓊脂或瓊脂糖凝膠是多孔的網(wǎng)狀結構，大分 子物質可以自由通過，這種分子的擴散作用可使分別處于兩處的抗原和相應的抗體通過擴散相遇，形成抗原-抗體復 合物，比例合適時出現(xiàn)沉淀。由于凝膠透明度高，可直接觀察到復 合物的沉淀線（弧）。沉淀線（弧）的特征與位置取決于抗原相對 分子質量的大小

4、，分子結構、擴散系數(shù)和濃度等因素。當抗原、抗 體存在多種系統(tǒng)時，會出現(xiàn)多種沉淀線（弧）。依據(jù)沉淀線（弧） 可以定性抗原，診斷疾病。此法操作簡單，靈敏度高，是最為常用的免疫學測定抗原和抗血清效價的方法。 操作方法（一）制備離子瓊脂板用10ml量筒，量取4ml融化的巴比妥離子瓊脂，倒在玻璃片上， 待瓊脂凝固后，按圖2所示的方法打孔。圖2的位置打空后用注射器針頭將孔內瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊 脂與玻璃板貼緊。（二）稀釋抗原和抗體 采用2倍連續(xù)稀釋法。將抗原與抗體按2的等比級數(shù)即20、21、22、23?方式連續(xù)稀釋。方法是取試管數(shù)支，各加入稀釋液（生理鹽水）一份，在于第一管中加入抗原或抗體一

5、份，用吹吸法混勻后，吸出，目一份加入第二管中，如此依次稀釋到最后一管。其稀釋倍數(shù)依次是：2,4, 8?。（三）加樣將稀釋好的抗原或抗體依次加入外周孔中，中心孔加入相應的抗體 或抗原，加入的量以平瓊脂表面為度或用微量進樣器定量加入。加 樣后置大培養(yǎng)皿內（皿內放有濕濾紙或濕紗布以維持濕度）。蓋好 皿蓋，于2437C溫箱內保溫2448小時。擴散后可出現(xiàn)清晰的 沉淀線，以出現(xiàn)沉淀線的抗體稀釋倍數(shù)最高的一孔為被測抗體的效 價。（四）染色及保存經(jīng)染色后可提高沉淀線的可見度。漂洗瓊脂板：將瓊脂板置生理鹽水中浸泡兩天，每天更換生理鹽 水2次以洗去未結合的抗原或抗體。生理鹽水浸泡后，更換蒸餾水 浸泡1天，換水2

6、次以除去鹽分。瓊脂板較脆易破，操作需小心。干燥：取出瓊脂板，覆蓋濾紙片，于室溫自然干燥或吹干、烘干。染色：將瓊脂板置于染色劑（0.05%氨基黑10b）中浸泡，約5 分鐘（*注意觀察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脫去背景顏色為度。脫色后滴加少量5%的甘油至瓊脂板上，置室溫干燥保存。如 欲取下瓊脂薄膜，則需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色劑、 脫色劑中加10%甘油），烘干后輕輕去下薄膜。本實驗用瓊脂糖效果最好，瓊脂粉次之，瓊脂所含雜質較多時，制 出的瓊脂凝膠板透明度較差，影響沉淀線的觀測、且重復性差，必 須做凈化處理后方可使用。瓊脂凝膠和玻璃片結合不緊密，樣品可從樣品孔下泄漏；在觀察、 漂

7、洗時凝膠易于脫落。為防止上述現(xiàn)象，可將玻璃板進行處理，方法是用01%02%瓊脂均勻 涂布在玻璃板上，自然干燥后再進行雙向擴散實驗。在抗原、抗體單一體系中，抗原濃度不同，沉淀線特征不同。如圖3所示圖3的位置抗原與抗體之間相對濃度不同，出現(xiàn)的沉淀線特征亦不同，如圖4 所示在抗原、抗體多種體系中，抗原與相應抗體出現(xiàn)的沉淀線有多條， 彼此互部干擾，如圖5所示圖4圖5試劑和器材1. 1.5%離子瓊脂（1）瓊脂的凈化：高度凈化的瓊脂，買來即可使用，如果不純則 需要凈化處理。取30克優(yōu)質瓊脂加970ml h2o，加熱至瓊脂全部融化，即成3%的 瓊脂。用三、四層紗布熱過濾，濾液流入一個搪瓷盤內，凝固后，切成1

8、cm 見方的小塊，放在大容器中，將自來水同到容器底部，流水沖洗3 天。沖洗時于容器上捆好一層紗布，以防瓊脂塊順水沖走。然后用 蒸餾水浸泡23天，每天換水23次。瓊脂塊凈化后即浸沒于蒸餾 水中，加萬分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。（2）巴比妥離子瓊脂的制備：離子強度0.06, ph8.6緩沖液：稱 取10.3g巴比妥取凈化的3%的瓊脂塊，加熱融化后加入等體積的離子強度0.06， ph8.6的巴比妥緩沖液，加熱混勻，即成為離子強度0.03, ph8.6, 1.5%巴比妥離子瓊脂。在制備離子瓊脂時，可在瓊脂中加入萬分之一的硫柳汞防 腐。瓊脂中的緩沖液，其離子強度最好比電極槽中的低1/2,這樣可

9、以避 免在電泳時因電流過大引起瓊脂變形（凸凹不平）。2.3.4.器材1.2.3.4.5.6.微量免疫電泳原理免疫電泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白質電泳分離技術（瓊脂電泳）和免疫學檢測方法（雙向擴散）結合起來的檢測方法。它提高了分辨率和靈敏度，是很理想的分離和鑒定蛋白質混合物的 方法。微量免疫電泳所用的樣品和抗血清較少，而且測定時間短， 靈敏度高，因此應用比較廣泛。在倒有離子瓊脂的餓玻璃片的中心挖一長槽，槽的兩側個挖一個 孔，孔內加入待測樣品，如圖6a所示。電泳時，樣品中各蛋白質的等電點不同，其帶電性質各異，因而 被分離成幾個區(qū)帶（如圖6b所示）。電泳后在中央槽中加入

10、相應抗 血清，置37C擴散。被分離的蛋白質與相應抗體形成大小不同、深淺 各異的沉淀?。ㄈ鐖D6c、d所示）。一般情況下，每一沉淀弧即代表 蛋白質混合液中的一種成分，以此定性或半定量。圖6操作方法（一）制備離子瓊脂板將前述實驗的離子瓊脂加熱融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后 按圖7所示打孔和打槽，用注射器針頭將孔內瓊脂挑出。槽內瓊脂 在電泳分離以后在挑出，以免電泳時橫槽變形影響雙向擴散。圖7（二）電泳 于兩個電泳槽中防入離子強度為0.06, ph8.6的巴比妥緩沖液。將 瓊脂板平置于兩個電極槽之間，為使電路連通，于緩沖液的液面到 瓊脂板之間，用單層濾紙或紗布搭橋形成通路，接通電源加10v電 壓，用

11、小滴管取樣品注入瓊脂板孔內，假樣量與孔平或稍少，調電 壓至100150v，通電4060分鐘，當血清中色素泳動到距邊緣約 1.5cm時，斷電，取出瓊脂板，用注射器針頭將橫槽中的瓊脂挑出， 加抗血清，水平置于濕盒（或培養(yǎng)皿中），于37或24進行雙向擴 散24-48小時后，取出觀察實驗結果。（三）染色 參看雙向免疫擴散法實驗。在免疫電泳實驗中的瓊脂電泳分離法，可用其他蛋白電泳技術代 替， 如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點聚焦電泳法等。電泳后切下相應的 膠帶置于玻璃板上，倒上離子瓊脂。當凝膠與膠帶緊密帖在一起并凝固后，在距膠帶約0.5cm處打橫槽， 挑出瓊脂，加抗血清進行雙向擴散。由于不同電泳方法對蛋白質

12、抗 原的濃度要求不同，要根據(jù)抗原、抗體沉淀反應的合適比例稀釋抗 血清。沉淀弧的曲度大，說明該種蛋白質的含量較高，電泳時擴散也較為 嚴重之故。曲度對稱說明蛋白質分子均一，不對稱似直線或直線上 有小弧，說明蛋白質分子不均一。凹 1=電泳時一般穩(wěn)壓在100150v范圍，電流可用凝膠板兩側濾紙橋 的層數(shù)加以調節(jié)，一般一層濾紙即可，電流過大致使凝膠發(fā)熱，水 分蒸發(fā)快，影響電泳效果。凝膠中緩沖液濃度為電極緩沖液的一半， 這樣可減少電流的作用，也可增加蛋白質的泳動速度。要根據(jù)樣品鑒定的不同要求，選擇抗血清。檢測蛋白質混合液（如血清或組織粗提液）中所需成分的存在及多 寡，需用純樣品制備的抗血清和用混合液制備的

13、抗血清對照檢測， 如圖8?！酒好庖邔嶒灴荚噺土暋繉嶒瀼土曨}一、選擇題：夾心elisa法檢測hbsag時，用于包被固相載體的物質是：ca.純化的hbsag b.酶標記的hbsag c.純化的hbsabd.酶標記的hbsabe.辣根過氧化物酶間接elisa法檢測hbsab時，用于包被固相載體的物質是：aa.純化的hbsag b.酶標記的hbsag c.純化的hbsabd.酶標記的hbsabe.辣根過氧化物酶血型鑒定實驗時，待檢紅細胞懸液與抗a抗體混合發(fā)生凝集，與抗b抗體混合未發(fā)生凝集，則待檢血的血型是：aa. a型b. b型c. ab型年d. o型e.不能確定血型鑒定實驗時，待檢紅細胞懸液與抗

14、a抗體混合不發(fā)生凝集， 與抗b抗體混合發(fā)生凝集，則待檢血的血型是：ba. a型b. b型c. ab型年d. o型e.不能確定不屬于人工主動免疫制劑的是(c )a乙肝疫苗b.白喉類毒素c.破傷風抗毒素d,百日咳疫苗e,脊髓灰質 炎疫苗不屬于人工被動免疫制劑的是(e)a,破傷風抗毒素b血漿免疫球蛋白c,胎盤免疫球蛋白d靜脈注射用免疫球蛋白e白喉類毒素二、填空：對流免疫電泳實驗，電泳時抗原端接陰極，抗體端接陽極。三、名詞解釋沉淀反應(precipitation reaction)毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應抗體反應后， 出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。凝集反應(agglutination r

15、eaction)細菌、細胞等顆粒性抗原或表面包被抗原的顆粒狀物質與相應的抗體在電解質存在的條件下結合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。免疫標記技術(immunolabeling techniques)是將抗原抗體反應與標記技術相結合，以檢測抗原或抗體的一類試 驗方法。人工主動免疫(artificial active immunization)用疫苗接種機體，使之產(chǎn)生特異性免疫，從而預防干擾的措施。人工被動免疫(artificial passive immunization)是給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細胞因子等制劑，以治療 或緊急預防感染的 措施。四、問答題簡述e-花環(huán)試驗的基本原理。人T細

16、胞膜上具有能與綿羊紅細胞(srbc)上 lfa-3 (淋巴細胞功能相 關抗原一3)結合的受體(E受體，即cd2分子)。srbc與T細胞 在含有血清的平衡鹽水中結合，形成以T細胞為中心，四周環(huán)繞 srbc，狀如環(huán)瑰花環(huán)細胞集團，故稱E花環(huán)試驗。簡述cdc試驗的基本原理。細胞表面抗原與相應抗體特異結合所形成的免疫復合物，通過經(jīng)典 途徑激活補體而導致細胞膜穿孔。因此水溶性染料如臺盼藍進入受 損細胞，染成藍色，為陽性反應；不帶相應抗原的細胞。未受傷， 不染色，為陰性反應。3.簡述elisa的基本原理。先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗體；加入待檢標本， 充分作用后，標本中相應的抗原與固相上已知抗

17、體結合，洗去未結 合的抗原成分；加入已知的酶標抗體，再洗去未結合的酶標抗體； 加底物后，酶分解底物后產(chǎn)生呈色反應?！酒撼Ｒ娒庖邔W試驗技術】免疫學實驗實驗一與免疫相關的細胞形態(tài)的觀察目的要求：觀察與免疫相關的幾種細胞的形態(tài)，了解它們在機體免疫反應中的作用。實驗器材：顯微鏡血液涂片(瑞氏染色)結締組織切片方法：油鏡觀察血涂片的觀察紅細胞：淡紅色，無核的圓形細胞，因紅血球為雙凹形，故 邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑78微米。顆粒白血球嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉狀， 可分15葉，核葉之間聯(lián)以染色質細絲，染色質染成粉色，其中充 滿細小的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。直徑

18、1012微米。嗜酸性顆粒白血球：略大于嗜中白血球，細胞核染成紫色，通常為2葉，胞質充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。直徑1015微米。 嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細胞質中有大小不 等被染成紫色顆粒，顆粒數(shù)目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為12 葉染成淡蘭色。直徑1011微米。1（c）無顆粒白血球淋巴細胞：涂片中可觀察到中、小型兩種。小淋巴細胞與紅血球大 小相似，圓形。其中含致密的核，染成深紫色。周圍僅有一薄層嗜 鹼性染成淡藍的細胞質。中淋巴細胞較大，有較寬層的細胞，核 形。6-8微米。單核細胞：體積最大，細胞圓形。胞質染成灰藍色。核呈腎形或馬 蹄形，染色略淺于淋巴細胞的核。直徑14

19、-20微米。肥大細胞的觀察（示教）胞體較大，呈卵圓形，胞質內充滿粗大均等的嗜鹼性顆粒。其中含 肝素、組織胺等物質。常成群地分布于血管的周圍。漿細胞的觀察（示教）細胞呈圓形或卵圓形，胞質豐富，呈嗜鹼性。核圓形，著色深，多 偏于細胞的一側，染色質核膜呈車輪分布。正常組織漿細胞少， 性炎癥時增多。漿細胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。巨噬細胞：又稱組織細胞，細胞形態(tài)不規(guī)則。常伸出短而鈍突 起，有很強的吞噬能力。附：瑞特氏染色：.染色液配置稱取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，過濾。貯褐色瓶中備用。（配置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得更好。）.瑞特氏染色法：取小鼠骨動

20、脈血，涂制玻片。干后用玻璃筆在涂處之兩側劃線（限 制染液流掉）。于劃線內部滴加染液3-4滴，經(jīng)3-5分鐘后，再滴加等量的蒸餾水，輕輕晃動混合。經(jīng)5分鐘后，用蒸餾水洗凈，待干 后用油鏡檢查。2實驗二沉淀反應可溶性抗原與相應的抗體混合，在電解質存在的條件下，兩者比例 適合，即可有沉淀物出現(xiàn)，叫沉淀反應（precipitation）,由于沉淀 反應抗原多系膠體溶液。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。為了求得抗原與抗體的適宜比例，保證有足夠的抗體，而且抗原分 子小，具有較大的反應面積，因此操作上通常是稀釋抗原，不稀釋 抗體。沉淀反應的種類有環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免 疫電泳等。此外還有放射

21、性同位素標記、酶標記等測定法。（一）環(huán)狀沉淀反應當抗原與相應抗體形成一個接觸面時，如二者比例適當，接觸面上 可形成一個乳白色的環(huán)狀物即為陽性沉淀反應。材料：1.2.免疫血清：免疫兔抗人血清抗原：人血清小沉淀管、毛細吸管、 橡皮頭、生理鹽水。方法：取小沉淀管2只，以毛細吸管吸取抗人血清約02毫升，加入第 一管，加時注意不能有氣泡。2.以毛細吸管吸取生理鹽水0.2毫升加入第二管。用毛細吸管吸入 血稀釋0.2毫升加入各管，加時應注意使抗原溶液緩緩由管壁流下， 輕浮于血清面上，使成一明顯界面，切勿使之相混。4.性。置室溫中10-20分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環(huán)，若有則 為陽3（二）.瓊脂擴散試驗瓊脂擴散是抗原抗體在凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應?？贵w在含有電解質的瓊脂凝膠中相遇時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線。 這種沉淀線是一組抗原抗體的特異性復合物。如果凝膠中有多種不 同抗原抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當部位形成獨立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴散試驗可根 據(jù)抗原抗體反