sd大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離課件

1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外分離培養(yǎng)的實驗研究第一組：演講人：實驗目的：建立一種簡便有效的體外分離純化及培養(yǎng)擴增大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的方法，研究BMSCs的生物學特性，為后續(xù)細胞移植和基因治療提供理想的種子細胞。實驗結(jié)果：大鼠BMSCs體外培養(yǎng)生長狀況良好，可見BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式細胞儀檢測顯示BMSCs表達CD29、CD90，不表達CD34、CD45。經(jīng)體外誘導后具有多向分化潛能。試驗方法：全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離大鼠BMSCs，體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代，在倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細胞的形態(tài)變化，利用MTT法測定其生長曲線，流式細胞儀鑒定其表面抗原，成骨、成脂肪誘導分化鑒

2、定其多向分化潛能。結(jié)論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法適合體外分離、擴增和純化大鼠BMSCs，培養(yǎng)的大鼠BMSCs具有間充質(zhì)干細胞的一般生物學特性，為后續(xù)基因修飾BMSCs及其體內(nèi)移植實驗奠定良好的基礎。實驗材料：68 周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量80100 g，清潔級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司許可證號為SC-XK(滬)20192-005。胎牛血清(美國Hyclone 公司)，L-DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胰酶( 美國Gibco 公司)，CD34-FITC 抗體、CD45-FITC 抗體、CD90-FITC 抗體(英國AbD Serotec公司)，CD29-FITC抗體(美國Bioleg

3、end公司)前言：骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)作為一種組織特異性干細胞，具有高度增殖能力和多向分化潛能，其作為種子細胞在干細胞移植和基因治療等方面的研究倍受關注。2019年9月至2019年8月我們開展了體外分離純化及培養(yǎng)擴增大鼠BMSCs 的實驗，為進行基因修飾BMSCs及其體內(nèi)移植的后續(xù)實驗奠定良好的基礎。試驗方法：1、鼠原代BMSCs的分離培養(yǎng)抽取10%水合氯醛0.2 ml腹腔注射麻醉大鼠后，用75%酒精浸泡大鼠雙下肢5min，無菌條件下分離出大鼠雙側(cè)的股骨和脛骨，將離體的骨干放入滅菌PBS緩沖液中沖洗

4、后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。剪去兩側(cè)干骺端，暴露骨髓腔，用無菌注射器抽取5ml含10%胎牛血清的低糖型DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔內(nèi)所有骨髓液沖凈。反復吹打骨髓沖洗液制成單細胞懸液，將此懸液接種于25cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，置于37、5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3d后首次換液，以后每3d換液1次。倒置顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)。2、大鼠BMSCs的傳代與純化通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法，每次換液棄除懸浮細胞。貼壁細胞主要是BMSCs，但可能混有淋巴細胞、單核細胞等造血細胞，710d原代細胞生長融合達80%90%，以0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶消化后按

5、1:2的比例傳代培養(yǎng)。原代細胞傳代后的細胞標記為P1 (Passage 1)，反復傳代擴增，并依次遞增標記。每次傳代時用0.25% EDTA-胰蛋白酶(0.04 ml/cm2)消化12 min，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。嚴格控制胰酶的用量和消化時間，利用BMSCs較易脫落的特點，保證BMSCs在較短的時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細胞、單核細胞則因貼壁性強仍貼附于培養(yǎng)瓶底，從而使BMSCs得到純化。大鼠BMSCs生長曲線測定：為了定量測定大鼠BMSCs的生長狀況，對來源于同一動物的原代細胞進行連續(xù)培養(yǎng)，分別選取生長良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制備成細胞懸液，

6、調(diào)整細胞密度為5104/ml。接種于96孔板，每孔接種200 l 細胞懸液進行培養(yǎng)(每孔1104細胞)。次日起每天選擇6個培養(yǎng)孔各自加入MTT溶液(5 mg/ml)20l，37繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)，吸出孔內(nèi)上清，每孔加入150l二甲基亞砜(DMSO)，室溫振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。與實驗孔平行設不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照1孔。在酶標儀上選擇570nm波長，以空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度(A)值，連續(xù)測7d，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞生長曲線。2、大鼠BMSCs P4細胞成骨、成脂誘導分化鑒定(1)向成骨細胞誘導分化：待培養(yǎng)的BMSCs P3細胞生長至80%90%的融合，加入0.

7、25%EDTA-胰酶消化后，以2104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)1d后，誘導分化培養(yǎng)組(實驗組)加入2 ml成骨誘導分化培養(yǎng)液，基礎培養(yǎng)組(對照組)加入等量基礎培養(yǎng)液，每3d換液1次。成骨誘導21d后，進行茜素紅染色檢測，確定細胞外基質(zhì)的礦化。(2)茜素紅染色：兩組細胞分別用PBS沖洗2次，95%乙醇固定5 min，茜素紅染液染色5 min，蒸餾水沖洗3 次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和染色結(jié)果。(3)向成脂肪細胞誘導分化：待培養(yǎng)的BMSCs P3細胞生長至80%90%的融合，加入0.25% EDTA-胰酶消化后，以2104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)1d后，誘導分化培養(yǎng)

8、組(實驗組)加入2ml成脂肪誘導分化培養(yǎng)液，基礎培養(yǎng)組(對照組)加入等量基礎培養(yǎng)液，每3d換液1次。成脂肪誘導10d后進行油紅O染色。(4)油紅O染色：兩組細胞分別用PBS沖洗3次，10%中性甲醛固定10min，油紅O染液浸染10min，60%異丙醇洗去多余染液，PBS沖洗3次，蘇木精復染35min，1%鹽酸分色及返藍后，PBS漂洗10min，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和染色結(jié)果。大鼠BMSCs的鑒定：1、流式細胞儀鑒定采用流式細胞儀對大鼠BMSCs進行鑒定。待25cm2塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)P3細胞長至融合至90%左右，吸去培養(yǎng)基，以1PBS洗滌細胞一次，加入0.25%EDTA-胰酶室溫消化后加入

9、新鮮含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，并輕輕吹打數(shù)次制成單細胞懸液，收集細胞于15ml離心管中1 000 r/min室溫離心5 min，棄上清，PBS洗滌兩遍并于相同條件下離心，棄上清，于待檢測的樣本中各加入100 lPBS，輕輕混勻，分別加入CD29-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC抗體各10l，37避光孵育30min后上機檢測。結(jié)果：1、大鼠原代BMSCs的分離培養(yǎng)經(jīng)全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離得到的骨髓單個核細胞在倒置相差顯微鏡下呈圓形、透亮、漂浮、折光性強，單個分布。接種1d后，輕晃培養(yǎng)瓶可見大部分細胞隨培養(yǎng)液晃動，僅少部分細胞貼壁，可見大部分細

10、胞呈圓形，少量呈不規(guī)則形，折光性強。3d后，貼壁細胞逐漸增加，少許伸出偽足呈梭形或三角形，并開始分裂增殖，可見一些小的細胞集落形成(圖1A)。45d后，貼壁細胞多呈梭形或多角形，形成不同大小、分散的細胞集落，集落逐漸擴散并相互交連呈網(wǎng)狀(圖1B)；以后細胞增殖迅速，至接種后第7天，細胞形似短棒狀或纖維樣，細胞集落數(shù)量明顯增加，呈放射狀或漩渦狀排列，集落間漸融合成單層(圖1C)；傳代至P5以備實驗用時細胞形態(tài)未見明顯變化(圖1D圖1H)。2、大鼠BMSCs的傳代與純化傳代細胞呈圓形，很快開始貼壁，36h后基本完成貼壁。貼壁細胞初期伸出偽足呈梭形或多角形，少部分圓形細胞懸浮，折光性差，隨換液除去。

11、傳代12d后貼壁細胞分布均勻，細胞形態(tài)逐漸趨于一致，以梭形為主，胞體飽滿，增殖迅速，34d后即可長滿培養(yǎng)瓶底。多次傳代的BMSCs達融合生長時，細胞形態(tài)更趨一致，形成更均勻有序的放射狀或漩渦狀排列，說明BMSCs得到進一步純化。3、大鼠BMSCs生長曲線測定P1、P3細胞生長曲線基本相同，經(jīng)過12d的潛伏適應期，第3天開始大量增殖進入對數(shù)生長期，P1和P3細胞維持3d左右對數(shù)生長期，此后進入平臺期。P5細胞生長趨勢不同于P1、P3細胞，增殖速度減慢，較之前兩者其潛伏適應期延長，而對數(shù)生長期縮短。見圖2。4、大鼠BMSCs的鑒定1、流式細胞儀鑒定大鼠BMSCs P3細胞表面標記流式細胞儀檢測顯示

12、CD29、CD90陽性率均達97%以上，CD34、CD45陰性率達95%以上(圖3)。2、大鼠BMSCs P4細胞成骨、成脂誘導分化鑒定成骨誘導分化鑒定：實驗組誘導后第21天茜素紅染色顯示大量橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成(圖4A)；對照組染色陰性。成脂誘導分化鑒定：實驗組誘導后第10天油紅O染色可見胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的橙紅色脂滴(圖4B)；對照組染色陰性。討論：1968年Fridenstein等首次對BMSCs進行了描述，提出了在骨髓中存在能貼附塑料培養(yǎng)皿，呈長梭形成纖維細胞樣，培養(yǎng)時呈克隆樣生長的細胞，將這類細胞稱為骨髓間充質(zhì)干細胞。傳統(tǒng)認為BMSCs的主要功能是參與構(gòu)成造血干細胞生存和分化的微環(huán)境。近

13、年研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有跨系統(tǒng)、跨胚層的多向分化潛能，在不同誘導條件下可分化為中胚層及神經(jīng)外胚層組織細胞，如心肌細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)組織細胞等。BMSCs具有來源充足、取材方便、免疫原性低、易于轉(zhuǎn)入外源基因進行表達等諸多優(yōu)勢，不僅是組織工程的重要種子細胞，還是進行基因治療的重要載體細胞，在器官移植和一些終末期疾病中亦有廣泛的應用前景。但是骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓中含量極少，約占骨髓有核細胞的十萬分之一。因此建立一種簡便有效的體外分離純化、培養(yǎng)擴增大鼠BMSCs的方法以供研究及應用顯得尤為重要。目前分離BMSCs的方法主要有全骨髓貼壁培養(yǎng)法、

14、密度梯度離心法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法。盡管利用流式細胞儀和免疫磁珠進行分選可獲得高純度的BMSCs，但對細胞的活性影響較大，加之成本較高和技術難度大，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應用。 采用密度梯度離心法對細胞活性影響較小，卻破壞了BMSCs生長的骨髓微環(huán)境，導致細胞增殖能力下降。桂莉等采用Percoll淋巴細胞分離液獲得骨髓中的單個核細胞，并結(jié)合BMSCs的貼壁特性，獲得大鼠BMSCs，雖然細胞均一性更高，但增殖速度較慢。高建鵬等比較貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法培養(yǎng)大鼠BMSCs的效果，發(fā)現(xiàn)貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法都可以得到純度較高的MSCs，兩種培養(yǎng)方法的效果無明顯差異。全

15、骨髓貼壁培養(yǎng)法是根據(jù)BMSCs貼壁生長而造血細胞懸浮生長的特性對兩者進行分離，由于保存了BMSCs生長所需的骨髓微環(huán)境，細胞經(jīng)換液傳代后得到純化且能保持旺盛的增殖能力。本實驗采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)出了純度較高的BMSCs。每次換液去除懸浮生長的造血細胞；傳代時利用BMSCs較淋巴細胞、單核細胞易脫落的特點，嚴格控制胰酶的用量和消化時間，使BMSCs在較短的時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開，淋巴細胞、單核細胞則因貼壁性強仍貼附于培養(yǎng)瓶底，從而使BMSCs得到進一步純化。隨著換液傳代次數(shù)的增加，BMSCs的純度也不斷增加。在體外分離培養(yǎng)BMSCs的過程中我們也體會到，造血系細胞對骨髓間充質(zhì)干細胞的生

16、物學特性影響很小，而且全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作簡單快速，造成污染的環(huán)節(jié)和機會較少，不需離心，可以更好的保持細胞活性。同時將全骨髓貼壁培養(yǎng)法作為其他培養(yǎng)方法的基礎，為后續(xù)實驗進一步富集BMSCs和進行單克隆培養(yǎng)提供良好的細胞來源。BMSCs原代細胞對于細胞的接種密度依賴性很強，接種密度過稀，則細胞不能形成有效的相互作用而導致細胞增殖緩慢甚至完全停止生長。因此采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法在原代接種時應盡可能獲得足夠多的骨髓液沖洗以達到BMSCs的良好增殖，我們的體會是將大鼠雙側(cè)股骨和脛骨的骨髓液一同沖洗后接種入一個25cm2的塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)以保證接種細胞的密度，與陳凱等報道一致。而趙玉金等則報道采用全骨髓培養(yǎng)獲

17、得原代大鼠BMSCs，傳代后低密度接種結(jié)合機械擦除對所培養(yǎng)細胞進行純化，可以獲得高純度大鼠BMSCs，且具有更佳的生物學特性。周麗娜等通過對照研究發(fā)現(xiàn)采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)基內(nèi)添加表皮生長因子后能夠穩(wěn)定、簡便、快速獲取大量高純度大鼠BMSCs。本研究針對性地觀察了P1至P5BMSCs的生長特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P5BMSCs增殖速度明顯減慢，其細胞倍增時間也明顯延長，提示大鼠BMSCs似乎不能在體外無限擴增。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs隨著傳代次數(shù)的增加，逐漸出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，傳到第10代以后，細胞逐漸出現(xiàn)空泡或者折光性降低等改變，其體外增殖的能力也逐漸下降，表現(xiàn)在形態(tài)上從梭形或多角形逐漸變得寬大扁平，傳代時間延長。而李寧等通過觀察不同氧濃度微環(huán)境對間充質(zhì)干細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)適宜的高濃度氧微環(huán)境可以促進大鼠BMSCs的增殖。迄今為止，仍然沒有發(fā)現(xiàn)BMSCs公認的獨特的抗原表型，一般采用聯(lián)合的抗原表型來鑒定BMSCs。BMSCs不表達造血細胞表面抗原，如造血干細胞標志抗原CD34、白細胞標志抗原CD45等，而表達CD29、CD90等間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和表皮細胞的表面標志物。本研究分離到的細胞絕大部分表達CD29和CD90，不表達CD34和CD45，表明本實驗獲得的細胞為純度較高的