5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA詳解課件

1、DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷課題21、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的概念一 、課題背景2、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的應(yīng)用： 的診斷、 、 、 和DNA 等各方面。遺傳疾病刑偵破案古生物學(xué)基因克隆序列測(cè)定1、DNA分子的組成成分和結(jié)構(gòu)DNA 分子的基本組成單位是 .共有 種,每個(gè)基本單位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 構(gòu)成。脫氧核甘酸4磷酸堿基脫氧核糖？那么DNA分子的平面結(jié)構(gòu)怎樣呢？二 、基礎(chǔ)知識(shí)2、DNA分子復(fù)制的過(guò)程參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3 端開(kāi)始連接脫氧

2、核苷酸解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打開(kāi)DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3端開(kāi)始連接脫氧核苷酸 思考：3、體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？ 體外擴(kuò)增DNA 如何提供相似環(huán)境？ 變性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高溫）2030個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNADNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA 分子的熱變性原理：變性的目的：復(fù)性的目的：解開(kāi)雙鏈有利于引物和引物與兩條單鏈的結(jié)合（一） 、PCR技術(shù)的原理利用DNA分子的熱變性原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。體外DNA復(fù)制的條件：

3、 四種脫氧核苷酸、耐高溫的聚合酶、引物、 模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5端向 3端延伸。（一）、PCR技術(shù)原理PCR參與的組分在DNA復(fù)制中的作用高溫變性解旋酶打開(kāi)DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料Taq酶（耐高溫）DNA聚合酶催化合成DNA子鏈20-30個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA單鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3端開(kāi)始連接脫氧核苷酸（二）、PCR的反應(yīng)過(guò)程每個(gè)循環(huán)包括：變性 復(fù)性延伸 從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特

4、異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。DNA雙鏈反向平行35531、DNA分子的3 端與5 端-OH端為3 ; 磷酸基團(tuán)的末端為5。2、DNA分子由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成氫鍵連接而成。基本單位ATGCATGC3355實(shí)驗(yàn)操作步驟：（準(zhǔn)備）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（移液）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（混合）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（離心）將微量離心管放在離心機(jī)上（反應(yīng)）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序 反應(yīng)周期高溫變性低溫復(fù)性(退火)適溫延伸反應(yīng)循環(huán)數(shù)：擴(kuò)增倍數(shù)：109以上30多次

5、以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率（二）、PCR的反應(yīng)過(guò)程1、循環(huán)之前的一次預(yù)變性2、PCR 一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)5/3/GGTC3/5/GACC5/3/AG引物5/3/GG引物變性復(fù)性延伸復(fù)制過(guò)程5/3/GGTC5/3/GGTC5/3/GA引物5/3/GA引物5/3/GG引物5/3/GA引物3/ 3/5/GACC3/5/GACC5/3/GG引物5/3/GG引物5/3/GG引物3/5/3/GA引物（1）變性：當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。（2）復(fù)性：溫度下降到50 左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。（3）延伸：溫度上升到72左右，溶液中的四種脫氧核苷酸

6、(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。（二）、PCR的反應(yīng)過(guò)程3、每個(gè)循環(huán)包括：變性 復(fù)性延伸（1）PCR循環(huán)-變性95變性（1）PCR循環(huán)-變性95變性（1）PCR循環(huán)-變性95變性（2）PCR循環(huán)復(fù)性55復(fù)性（3）PCR循環(huán)延伸（3）PCR循環(huán)延伸（3）PCR循環(huán)延伸（3）PCR循環(huán)延伸4、循環(huán)特點(diǎn)：上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板 結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無(wú)引物存在于兩個(gè)子代DNA分子中 其它子代DNA分子都為雙引物分子式 處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)12N三、實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)體系的配方用微量移液器按配方在往微量離心管中加

7、入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合反應(yīng)液離心10S將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)四、操作提示： 操作提示 1為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。 2PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。 3在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

8、目的：避免外源性DNA大量擴(kuò)增造成假陽(yáng)性反應(yīng)。五、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、原理：DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰(圖5-11)?？梢岳肈NA的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)定。注意事項(xiàng)：詳見(jiàn)操作提示 五、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA 含量的測(cè)定：稀釋對(duì)照調(diào)零測(cè)定計(jì)算（公式見(jiàn)P63）波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)蒸餾水做對(duì)照50倍實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析DNA含量(ug/mI)=50 （260nm的讀數(shù)） 稀釋倍數(shù)六、課題延伸1、PCR優(yōu)點(diǎn)：2、PCR技術(shù)的應(yīng)用P58原理雖然復(fù)雜，但操作卻十分簡(jiǎn)單。快速、高效、靈活和易于操作 PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制的區(qū)別： 1. PCR不需要解旋酶；體內(nèi)DNA復(fù)制需要； 2. P

9、CR需要耐熱的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而其他生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時(shí)會(huì)變性； 3. PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。 練習(xí) (課堂檢測(cè))1、DNA單鏈的_末端為3端, _末端為5端,在DNA復(fù)制時(shí),引物從模板鏈的_端配對(duì)結(jié)合.在_酶的作用下,從引物的_端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為_(kāi)這三個(gè)過(guò)程,對(duì)應(yīng)溫度分別為_(kāi).磷酸基團(tuán)羥基羥基DNA聚合3/變性、復(fù)性、延伸95、55 、72 90以上、50左右 、72 左右練習(xí) (教材P63)1、一個(gè)DNA片段經(jīng)過(guò)30次循環(huán)后能形成_個(gè)這樣的片段.2、依據(jù)DNA吸收紫外光的情況,用紫外分光光度計(jì)測(cè)得DNA=_23050 x(260nm的讀數(shù))x稀釋倍數(shù)練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A 古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)