全基因組關(guān)聯(lián)分析的原理和方法題庫(kù)

1、全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study;GWAS）是應(yīng)用基因組中 數(shù)以百萬計(jì)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide ploymorphism，SNP）為分子 遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組水平上的對(duì)照分析或相關(guān)性分析，通過比較發(fā)現(xiàn)影響復(fù) 雜性狀的基因變異的一種新策略。隨著基因組學(xué)研究以及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，人們已通過GWAS方法發(fā)現(xiàn)并 鑒定了大量與復(fù)雜性狀相關(guān)聯(lián)的遺傳變異。近年來，這種方法在農(nóng)業(yè)動(dòng)物重要經(jīng) 濟(jì)性狀主效基因的篩查和鑒定中得到了應(yīng)用。全基因組關(guān)聯(lián)方法首先在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究中得到了極大的重視和應(yīng)用， 尤其是其在復(fù)雜疾病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，使

2、許多重要的復(fù)雜疾病的研究取得了突 破性進(jìn)展，因而，全基因組關(guān)聯(lián)分析研究方法的設(shè)計(jì)原理得到重視。人類的疾病分為單基因疾病和復(fù)雜性疾病。單基因疾病是指由于單個(gè)基因的 突變導(dǎo)致的疾病，通過家系連鎖分析的定位克隆方法，人們已發(fā)現(xiàn)了囊性纖維化、 亨廷頓病等大量單基因疾病的致病基因，這些單基因的突變改變了相應(yīng)的編碼蛋 白氨基酸序列或者產(chǎn)量，從而產(chǎn)生了符合孟德爾遺傳方式的疾病表型。復(fù)雜性疾 病是指由于遺傳和環(huán)境因素的共同作用引起的疾病。目前已經(jīng)鑒定出的與人類復(fù) 雜性疾病相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)有439個(gè)。全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)的重大革新及其應(yīng) 用，極大地推動(dòng)了基因組醫(yī)學(xué)的發(fā)展。（2005年，Science雜志首次報(bào)

3、道了年齡相關(guān) 性視網(wǎng)膜黃斑變性GWAS結(jié)果，在醫(yī)學(xué)界和遺傳學(xué)界引起了極大的轟動(dòng),此后一系列GWAS陸 續(xù)展開。2006年，波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合哈佛大學(xué)等多個(gè)研究機(jī)構(gòu)報(bào)道了基于佛明翰心臟 研究樣本關(guān)于肥胖的GWAS結(jié)果（Herbert等.2006）;2007年，Saxena等多個(gè)研究組聯(lián)合報(bào) 道了與2型糖尿病（T2D ）關(guān)聯(lián)的多個(gè)位點(diǎn)，Samani等則發(fā)表了冠心病GWAS結(jié)果（Samani 等.2007）; 2008年，Barrett 等通過 GWAS 發(fā)現(xiàn)了 30 個(gè)與克羅恩?。–rohns disrease） 相關(guān)的易感位點(diǎn)；2009年，W e is s等通過GWAS發(fā)現(xiàn)了與具有高度遺傳性的

4、神經(jīng)發(fā)育疾 病一一自閉癥關(guān)聯(lián)的染色體區(qū)域。我國(guó)學(xué)者則通過對(duì)12 000多名漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者 以及健康對(duì)照者的GWAS發(fā)現(xiàn)了 5個(gè)紅斑狼瘡易感基因，并確定了 4個(gè)新的易感位點(diǎn)（Han 等.2009）。截至2009年10月，已經(jīng)陸續(xù)報(bào)道了關(guān)于人類身高、體重、血壓等主要性狀, 以及視網(wǎng)膜黃斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖癥、糖尿病、精神分 裂癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等幾十種威脅人類健康的常見疾病的GWAS結(jié)果，累計(jì)發(fā)表了近萬篇 論文，確定了一系列疾病發(fā)病的致病基因、相關(guān)基因、易感區(qū)域和SNP變異。）標(biāo)記基因的選擇:Hap Map是展示人類常見遺傳變異的一個(gè)圖譜，第1階段完成后提供了 4 個(gè)人

5、類種族 Yoruban ,Northern and Western European , and Asian (Chinese and Japanese) 共 269個(gè)個(gè)體基因組，超過100萬個(gè)SNP (約 1 SNP / 3kb )及連鎖不平衡區(qū)域(linkage disequilibrium, LD )關(guān) 系的圖譜。第二階段增加了其它的人類種族數(shù)據(jù)。基于Hap Map可以選 擇500 000到1 000 000個(gè)覆蓋全基因組的SNP?；蚪M拷貝數(shù)變異(copy number variations ,CNV )是20世紀(jì)80 年代發(fā)現(xiàn)的在人類基因組中存在的多種類型的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異。 是

6、指與參考序列相比，基因組中1 kb的DNA 片段插入、缺失和/或 擴(kuò)增，及其互相組合衍生的復(fù)雜染色體結(jié)構(gòu)變異。與SNP相似，部分CNV 在不同人群中以不同頻率分離并具有顯著性差異，并可能影響基因表達(dá) 和表型改變，因此CNV也是一種引起疾病或增加復(fù)雜疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的重 要遺傳變異。GWAS采用的研究方式與傳統(tǒng)的候選基因病例一對(duì)照(case-control)關(guān)聯(lián)分 析一致，即如果人群基因組中一些SNP與某種疾病相關(guān)聯(lián)，理論上這些疾病相 關(guān)SNP等位基因頻率在某種疾病患者中應(yīng)高于未患病對(duì)照人群。動(dòng)物重要經(jīng)濟(jì)性狀即復(fù)雜性狀GWAS分析方法的原理是，借助于SNP分子遺 傳標(biāo)記，進(jìn)行總體關(guān)聯(lián)分析，在全基因組

7、范圍內(nèi)選擇遺傳變異進(jìn)行基因分型，比 較異常和對(duì)照組之間每個(gè)遺傳變異及其頻率的差異，統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)變異與目標(biāo)性 狀之間的關(guān)聯(lián)性大小，選出最相關(guān)的遺傳變異進(jìn)行驗(yàn)證，并根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果最終確 認(rèn)其與目標(biāo)性狀之間的相關(guān)性。GWAS的具體研究方法與傳統(tǒng)的候選基因法相類似：?jiǎn)坞A段方法，即選擇足夠多的樣本，一次性地在所有研究對(duì)象中對(duì)目標(biāo) SNP進(jìn)行基因分型，然后分析每個(gè)SNP與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)，統(tǒng)計(jì)分析關(guān)聯(lián)強(qiáng)度和 OR值(計(jì)算出的OR值等于1時(shí)，則該因素的疾病發(fā)生不起任何作用；大于1時(shí)， 該因素為危險(xiǎn)因素；小于1時(shí)，該因素為保護(hù)因素。)。目前GWAS研究主要采用兩階段方法/多階段方法。第一階段用覆蓋全基因組范圍的S

8、NP進(jìn)行對(duì)照分析，統(tǒng)計(jì)分析后篩選出較少 數(shù)量的陽(yáng)，性SNP進(jìn)行?？梢砸詡€(gè)體為單位，也可以采用DNA pooling的方法(后 者可大大降低及基因分型的成本和工作量)。但是DNA pooling的基因分型 結(jié)果與對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行基因分型的結(jié)果仍有一定差異，DNA pooling估計(jì)的等位 基因頻率標(biāo)準(zhǔn)差在1 % 4%的范圍，因而若單獨(dú)以DNApooling來估計(jì)等位基 因頻率，那么這種誤差對(duì)全基因組的病例一對(duì)照研究的檢驗(yàn)效能(power of test )有重要影響。第二階段或隨后的多階段中采用更大樣本的對(duì)照樣本群進(jìn)行基因分型，然后 結(jié)合兩階段或多階段的結(jié)果進(jìn)行分析。這種設(shè)計(jì)需要保證第一階段篩選與

9、目標(biāo)性 狀相關(guān)SNP的敏感性和特異，性，盡量減少分析的假陽(yáng)性或假陰，性，并在第二階段 應(yīng)用大量樣本群進(jìn)行基因分型驗(yàn)證。結(jié)果的統(tǒng)計(jì)和分析：在GWAS用于病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)時(shí)，比較病例和對(duì)照組中每個(gè)SNP等位 基因頻率差別多采用4格表的卡方檢驗(yàn)(chi-square test )并計(jì)算 OR及其95%的可信區(qū)間(confidence interval , CI)，歸因分?jǐn)?shù)(attributable fraction , AF)和歸因危險(xiǎn)度(attributable risk , AR);同時(shí)需對(duì)如年齡、性別等主要混雜因素采用Logistic回歸分析, 以基因型和混雜因素作為自變量，研究對(duì)象患病狀態(tài)

10、為因變量進(jìn)行分析。GWAS用于研究隨機(jī)人群的SNP與某一數(shù)量性狀關(guān)聯(lián)時(shí)(如身高、體重、 血壓等)，主要應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA )比較SNP位點(diǎn)3 種基因型與所研究的數(shù)量性狀水平的關(guān)系,需要調(diào)整混雜因素時(shí)則采用 協(xié)方差分析(analysis o f covariance)或線性回歸引起結(jié)果誤差的主要原因有人群分層和多重假設(shè)檢驗(yàn)調(diào)整。無論是GWAS兩階段 /多階段設(shè)計(jì)，還是采用Bonferroni校正等遺傳統(tǒng)計(jì)方法，都難以解決人群分 層及多重比較導(dǎo)致的假陽(yáng)性或假陰性問題。GWAS不能僅憑P值判斷某個(gè)SNP 是否與疾病真正關(guān)聯(lián)，多種族、多群體、大樣本的重復(fù)驗(yàn)證研究(repli

11、cation) 才是提高檢驗(yàn)效能、確保發(fā)現(xiàn)真正疾病關(guān)聯(lián)SNP的關(guān)鍵。【例】全基因組關(guān)聯(lián)分析在乳腺癌易感位點(diǎn)篩選的應(yīng)用2007 年 6 月，乳腺癌關(guān)聯(lián)協(xié)作組(Breast Cancer Association Consortium BCAC)首先報(bào)告了乳腺癌GWAS的結(jié)果，該研究共包括三個(gè)階段：第一階段：408例家族性乳腺癌患者和400名對(duì)照，266 722個(gè)SNP;第二階段：3990例乳腺癌患者和3916名對(duì)照，12 711個(gè)SNP;第三階段：22例病例-對(duì)照研究，合計(jì)21 860例患者和22 578名對(duì)照， 30個(gè)SNP。研究結(jié)果最終發(fā)現(xiàn)了5個(gè)乳腺癌的易感性位點(diǎn)，4個(gè) 位于已知基因：FGFR

12、2 ( rs2981582)、TNRC9 /LOC643714(rsl2443621 )、MAP3K1( rs889312)和 LSPl (rs3817198) 而rsl3281615位于染色體8q24。雖然GWAS結(jié)果在很大程度上增加了對(duì)復(fù)雜性狀分子遺傳機(jī)制的理解，但也 顯現(xiàn)出很大的局限，性。首先，通過統(tǒng)計(jì)分析遺傳因素和復(fù)雜性狀的關(guān)系,確定與 特定復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)的功能性位點(diǎn)存在一定難度。通過GWAS發(fā)現(xiàn)的許多SNP位點(diǎn) 并不影響蛋白質(zhì)中的氨基酸，甚至許多SNP位點(diǎn)不在蛋白編碼開放閱讀框(open reading frame ,ORF)內(nèi)，這為解釋SNP位點(diǎn)與復(fù)雜性狀之間的關(guān)系造成了困難。 而且

13、，就目前來說GWAS難以檢測(cè)的部分可能主要集中在最小等位基因頻(minor allele frequency ,MAF)介于 0 . 5 % 5 %之間的少見變異，或者 MAF 0.5% 的罕見變異，現(xiàn)有的基因分型芯片較難有效地發(fā)現(xiàn)這些遺傳變異但是，由于復(fù)雜性狀很大程度上是由數(shù)量性狀的微效多基因決定的,SNP位 點(diǎn)可能通過影響基因表達(dá)量對(duì)這些數(shù)量性狀產(chǎn)生輕微的作用，它們?cè)赗NA的轉(zhuǎn)錄 或翻譯效率上發(fā)揮作用，可能在基因表達(dá)上產(chǎn)生短暫的或依賴時(shí)空的多種影響， 刺激調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)或影響其RNA剪接方式。因此，在找尋相關(guān)變異時(shí)應(yīng)同 時(shí)注意到編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)位點(diǎn)變異的重要性。其次，等位基因結(jié)構(gòu)(數(shù)量、

14、類型、 作用大小和易感性變異頻率)在不同性狀中可能具有不同的特征。在GWAS研究后要確定一個(gè)基因型-表型因果關(guān)系還有許多困難，由于連鎖不 平衡的原因，相鄰的SNP之間會(huì)有連鎖現(xiàn)象發(fā)生。同樣，在測(cè)序時(shí)同樣存在連鎖 不平衡現(xiàn)象，而且即使測(cè)序的費(fèi)用降到非常低的水平，要想如GWAS研究一般地 獲得大量樣本的基因組數(shù)據(jù)還是非常困難的。*llumina宣布HiSeq X Ten測(cè)序系統(tǒng)將會(huì)于1月份重磅回歸，該技術(shù)的早期運(yùn)用還需要等 待一段時(shí)間，然而GEN預(yù)測(cè)了 I lluminaXTen在2015年可能會(huì)實(shí)現(xiàn)的6大應(yīng)用。Illumina XTen的測(cè)序功能非常強(qiáng)大，一臺(tái)機(jī)器一年能完成18000個(gè)人類基因組

15、測(cè)序，盡管大規(guī)?；?因組測(cè)序還會(huì)面臨一系列挑戰(zhàn)，但是現(xiàn)在可以將這些顧慮暫時(shí)擱置，思考一下科學(xué)家們可以 利用該技術(shù)完成哪些有趣的工作呢？下面就是GEN預(yù)測(cè)的6大應(yīng)用。1新生兒與兒科疾病預(yù)測(cè)新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房和兒童醫(yī)院每年都會(huì)收治大量患有嚴(yán)重疾病的患兒，而其中很多致命的 疾病都存在其遺傳基礎(chǔ)。其中有一些是已知的遺傳疾病，能夠通過臨床基因檢測(cè)確診。然而 還有大量的疾病無法通過基因檢測(cè)查出來，卻嚴(yán)重地影響兒童健康。目前有很多試點(diǎn)計(jì)劃， 像是NIH的“未確診疾病計(jì)劃”就是通過外顯子測(cè)序來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，外顯子測(cè)序平均能揭示 25-30%的病理性突變。然而，全基因組測(cè)序能夠發(fā)現(xiàn)難以捕捉的外顯子區(qū)域，還能夠發(fā)現(xiàn)結(jié)

16、構(gòu)性變異。隨著XTen system的應(yīng)用，全基因組測(cè)序只是下面要做工作的第一步。它的運(yùn)轉(zhuǎn)速度更快，不需要雜 化反應(yīng)，檢測(cè)范圍能從單一核苷酸變異到大片段丟失。如果可行的話，患者及其父母，甚至 是兄弟姐妹都可以進(jìn)行全基因組測(cè)序。藥物試驗(yàn)和藥物基因組學(xué)基因研究的一個(gè)巨大前景就是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療：把治療疾病具體到每個(gè)個(gè)體的基因組成上 來。實(shí)現(xiàn)個(gè)體化醫(yī)療需要研究疾病預(yù)后和藥物反應(yīng)的個(gè)體基因差異，目前許多藥物基因組計(jì) 劃正在進(jìn)行，而很多都是運(yùn)用SNP分析和靶向測(cè)序技術(shù)。全基因組測(cè)序能夠更好地促進(jìn)這些 工作，因?yàn)槿蚪M測(cè)序能夠捕獲范圍更廣的變異。全基因組測(cè)序還能夠運(yùn)用到臨床試驗(yàn)的 前沿，它可以將病人按反應(yīng)

17、分成很多群體進(jìn)行研究?？刂谱儺惡捅磉_(dá)數(shù)量性狀基因座（eQTLs）國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃（HapMap Project）的一項(xiàng)重要開支就是從成纖維細(xì)胞系中鑒 定出基因變異，該項(xiàng)工作由Coriell領(lǐng)頭。獲得所有SNP基因型后，研究人員可以分析基因 表達(dá)，最初是通過芯片分析，后來通過RNA-seq技術(shù)，最終將這些結(jié)果與變異聯(lián)系起來。這 些分析結(jié)果產(chǎn)生了成千上萬的表達(dá)數(shù)量性狀基因座（eQTLs）,分析這些數(shù)據(jù)可以了解基因變 異影響轉(zhuǎn)錄的方式?？梢韵胂笥米钕冗M(jìn)的RNA-Seq和WGS （全基因組測(cè)序）技術(shù)對(duì)同一樣本進(jìn)行分析后會(huì)得到怎 樣強(qiáng)大的數(shù)據(jù)（RNA-seq是在另外一些平臺(tái)上做的，比如Hise

18、q2000，因?yàn)閄 Ten只能進(jìn)行 全基因組測(cè)序）。ENCODE Project Consortium和其他幾個(gè)團(tuán)隊(duì)揭示了轉(zhuǎn)錄廣泛發(fā)生的方式， 毫無疑問，僅僅利用過去的SNP芯片分析是無法得出這些結(jié)論的。罕見腫瘤研究癌癥基因組圖譜（TCGA）和國(guó)際癌癥基因組計(jì)劃（ICGC）等工作鑒定出大量癌癥類型的體細(xì) 胞突變。大多數(shù)工作是通過外顯子測(cè)序和全基因組測(cè)序完成的，而鑒于成本考慮，主要是外 顯子測(cè)序。盡管如此，這些工作極為有效地揭示出反復(fù)出現(xiàn)的變異和通路。然而，這些工作主要是基于那些常見的腫瘤類型。不過隨著全基因組測(cè)序的普及，那些罕見 的腫瘤類型也可以通過同樣的手段進(jìn)行研究。通過把TCGA、ICGC和其他數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本作為 比對(duì)參照，我們可以獲得許多罕見腫瘤的體細(xì)胞變異數(shù)據(jù)。這不僅可以幫助那些患罕見瘤的 病人，而且可以幫助深入理解生物學(xué)中的特異性。全基因組測(cè)序是研究這些罕見腫瘤的極為有效的工具，基于我們對(duì)這些腫瘤了解甚少，通過 全基因組測(cè)序可以捕獲到所有的變異，在一次測(cè)序中小到可以獲知單核苷酸位點(diǎn)的變異，大 到染色體重排。將全基因測(cè)序大規(guī)模應(yīng)用在腫瘤研究中，也是理所當(dāng)然了。家族性疾病基因組學(xué)研究這一點(diǎn)和第一條應(yīng)用（新生兒與兒科疾病預(yù)測(cè)）看起來可能很相似，但其實(shí)是另一種研究， 需要挖掘受家族性遺傳疾病影響的多譜系病因。家族性研究和病