第七章之細(xì)胞破碎

1、第七章之細(xì)胞破碎生物分離過(guò)程的一般流程不同類型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類型：動(dòng)物細(xì)胞：大多無(wú)細(xì)胞壁，其培養(yǎng)產(chǎn)物大多分泌 在培養(yǎng)液中。植物細(xì)胞：多為胞內(nèi)產(chǎn)物。微生物：大多數(shù)小分子代謝產(chǎn)物分泌在胞外； 大多數(shù)大分子產(chǎn)物和基因重組產(chǎn)物為 胞內(nèi)產(chǎn)物，如胰島素、干擾素、白細(xì) 胞介素-2等均為胞內(nèi)產(chǎn)物。 對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先必須將細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進(jìn)一步提取。 細(xì)胞破碎的意義細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎(chǔ)。有效的細(xì)胞破碎對(duì)分離和純化任何細(xì)胞內(nèi)活性藥物成分都是必要的。細(xì)胞破碎與上游和下游工藝設(shè)計(jì)的關(guān)系 上游通過(guò)細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)細(xì)胞破碎效果產(chǎn)生影響；而下游則要考慮去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞

2、蛋白質(zhì)的污染等對(duì)產(chǎn)品活性的影響。細(xì)胞破碎過(guò)程中必須考慮的因素 細(xì)胞壁的堅(jiān)韌程度 、目標(biāo)產(chǎn)品的性質(zhì) 、破碎的規(guī)模、方法 、費(fèi)用等 .細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對(duì)破碎的影響微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來(lái)自于細(xì)胞壁。不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。細(xì)胞破碎是為了破壞細(xì)胞外圍使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來(lái)。生物的細(xì)胞外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。 細(xì)胞膜使細(xì)胞內(nèi)外保持一定的濃度差，它主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，強(qiáng)度比較差，易受滲透壓沖擊而破碎。植物

3、和微生物細(xì)胞有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁維持細(xì)胞堅(jiān)固。細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁。細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)微生物細(xì)胞的外圍通常包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。 細(xì)胞壁（外壁）：具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷的功能； 細(xì)胞膜（內(nèi)壁）：具有高度選擇性的半透膜，控制胞內(nèi)外一些物質(zhì)的交換滲透作用。細(xì)胞破碎的主要阻力來(lái)自于細(xì)胞壁，不同類型的微生物其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特性是不同的，取決于遺傳和環(huán)境因素。 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 革蘭氏陰性細(xì)菌 酵 母 霉 菌 植物細(xì)胞壁厚(nm) 2080 1013 100300 100250 27 m層次 單層多層多層多層多層主要組成 肽聚糖多 糖磷壁酸蛋白質(zhì)脂多糖肽聚糖脂蛋白脂多糖磷 脂蛋白質(zhì) 葡聚

4、糖 甘露聚糖 蛋白質(zhì) 脂 類多聚糖脂 類蛋白質(zhì) 纖維素半纖維素果膠物質(zhì)木質(zhì)素蛋白質(zhì)破碎難易程度較難破碎較易破碎較難破碎難破碎很難破碎研 磨細(xì)胞破碎技術(shù)破碎方式機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切作用液體剪切作用干燥處理溶胞作用磨珠法高壓勻漿超聲破碎酶溶法化學(xué)法物理法機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法 物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而

5、達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理影響破碎難易程度的重要因素：機(jī)械法細(xì)胞的大小和形狀、細(xì)胞壁厚度、聚合物交聯(lián)程度。顯然，細(xì)胞個(gè)體小、球形、壁厚、聚合物交聯(lián)程度高是最難破碎的。（破碎細(xì)胞） 非機(jī)械法細(xì)胞壁、膜的組成和結(jié)構(gòu)。了解細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，就可選擇合適的溶菌酶和化學(xué)試劑，以及在使用多種酶或化學(xué)試劑相結(jié)合時(shí)確定其使用的順序 。（溶解壁膜上的某些組成打洞）機(jī) 械 法方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)胞研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過(guò)的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破

6、碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理組織勻漿機(jī)高速組織搗碎機(jī)采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）。1.高壓勻漿法（High-pressure homogenization）細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細(xì)胞破碎。高壓勻漿閥結(jié)構(gòu)示意圖進(jìn)液口出液口閥座碰撞環(huán)閥桿高壓勻漿器19.6-25.4MPa 適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎大、中、小型高壓勻漿器實(shí)驗(yàn)室級(jí)高壓均質(zhì)儀 高壓細(xì)胞破碎機(jī)高

7、壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng)高壓勻漿器的操作溫度上升約-3/10MPa為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20左右。可以采用單次通過(guò)勻漿器或多次循環(huán)通過(guò)等方式。在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。高壓勻漿法適用的范圍大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，20%左右。不宜使用高壓勻漿法。易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素被破碎的細(xì)胞分率符合如下公式： ln1/(1-

8、R)=KNP 式中 R 破碎率，為N次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量Rn與最大釋放量Rm之比； K 與溫度有關(guān)的速度常數(shù)； P 操作壓力，MPa； 與微生物種類有關(guān)的常數(shù)。升高壓力有利于破碎減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過(guò)勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過(guò)小。但p大到一定值時(shí)對(duì)勻漿器的磨損增加，也有實(shí)驗(yàn)表明p超生一定值時(shí)，R增加但很慢。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為5570Mpa。破碎性能還隨菌體種類和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而不同大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素高壓勻漿法-X-擠壓器改進(jìn)的高壓方法

9、：將濃縮的菌體懸液冷卻至-25至-30形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體在受壓時(shí)的相變，包埋在冰中的細(xì)胞變形所引起的。主要用于實(shí)驗(yàn)室中。優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高對(duì)冷凍一融解敏感的生化物質(zhì)不適用。2、珠磨法 bead mill珠磨是常用的方法細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī)WSK臥式高效全能珠磨機(jī)高速珠磨機(jī)工作原理磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同

10、心軸上的園盤攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動(dòng)；細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動(dòng)引起在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。由于操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。玻璃珠氧化鋯幾種常見珠磨器珠磨式組織研磨器 利用微細(xì)玻璃珠，在高速運(yùn)轉(zhuǎn)下的相互碰撞，造成組織細(xì)胞的破裂與分散。適合珍貴樣品液的研磨，例如蛋白質(zhì)、酶及細(xì)胞液等。微細(xì)玻璃珠可回收使用。樣品處理量，含玻璃珠可達(dá)350ml。 樣品量可達(dá)80g小型珠磨器 密閉容器可容納1至的組織液或是一些細(xì)胞懸濁液，通過(guò)1至3分鐘的劇烈攪拌，能使細(xì)胞徹底的破裂，甚至一

11、些骨頭、微生物的孢子通過(guò)玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。 玻璃珠適用性： 細(xì)菌用的玻璃珠酵母、藻類和組織培養(yǎng)細(xì)胞用的玻璃珠動(dòng)植物的組織用1mm的玻璃珠WSK臥式高效全能珠磨機(jī)ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)Netzsch LM-20型珠磨機(jī)A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤C-環(huán)形震動(dòng)俠縫分離器D-變速馬達(dá)1和2料液進(jìn)出口3和4 攪拌冷卻劑進(jìn)出口5和6磨室冷卻劑進(jìn)出口園盤以兩種位置交錯(cuò)地安裝在軸上，一種處于徑向，一種與軸傾斜，徑向盤使磨料沿徑向運(yùn)動(dòng)，傾斜盤則產(chǎn)生軸向運(yùn)動(dòng)。由于交錯(cuò)的運(yùn)動(dòng)，提高了破碎效率。珠磨機(jī)破碎作用方程破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程

12、，符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2 R 破碎率；K一 一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；t一 時(shí)間。K與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。影響破碎效果的因素影響因素：珠體的直徑、進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞濃度、料液的流速、攪拌器的轉(zhuǎn)速和構(gòu)型、溫度等。 珠體的大?。簯?yīng)根據(jù)細(xì)胞大小和濃度以及在連續(xù)流動(dòng)的操作過(guò)程中不使珠體帶出來(lái)選擇。珠體的裝量：影響破碎程度和所需能量。攪拌速度：增加攪拌速度能提高破碎效率，但過(guò)高的速度反而會(huì)使破碎率

13、降低，能量消耗增大，所以攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)適當(dāng)。采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫控,效果較好;能耗與細(xì)胞破碎率成正比;問(wèn)題：高壓勻漿比珠磨法破碎細(xì)胞的效果好？溫控和能耗高壓勻漿法與高速珠磨法的比較項(xiàng)目高壓勻漿法高速珠磨法操作參數(shù)少多，液體損耗大連續(xù)操作時(shí)配備熱換器進(jìn)行級(jí)間冷卻兼具破碎和冷卻，減少產(chǎn)物失活達(dá)到較高破碎率需循環(huán)2-4次一次操作適用范圍團(tuán)狀、絲狀真菌、較小革蘭陽(yáng)性菌不宜，包含體不宜幾乎所有的微生物細(xì)胞，包括含有包含體的基因工程菌的破壁3、超聲破碎機(jī)理：聲頻高于1520kHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入時(shí)可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎機(jī)理尚未清楚，可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。破碎效率與聲頻、聲能、處理

14、時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等因素有關(guān)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，液量損失少存在問(wèn)題：使敏感物質(zhì)變性失活，噪聲大，大容量時(shí)效率低，應(yīng)用潛力有限?？栈F(xiàn)象：在強(qiáng)聲波作用下，引起氣泡形成，脹大和破碎的現(xiàn)象。錫箔紙測(cè)試空化強(qiáng)度與空化密度看得到的空化現(xiàn)象JY92-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。46超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破

15、碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。實(shí)驗(yàn)室連續(xù)破碎池結(jié)構(gòu)示意圖 超聲波破碎儀大功率超聲波破碎儀非 機(jī) 械 法非機(jī)械破碎方法酶溶破碎法（enzyme lysis）化學(xué)破碎法（chemical treatment）去垢劑破碎法（detergents）滲透壓沖擊破碎法（osmotic shock）凍融破碎法（freezing and thawing）1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解

16、細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類外加酶法酶解法的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來(lái)選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽(yáng)性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無(wú)效果，必須與螯合劑EDTA一起使用。放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，所以

17、也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。外加酶法有時(shí)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果，加入時(shí)需確定相應(yīng)的次序。 對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。55酶解法的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)產(chǎn)物抑制的存在。利用溶

18、酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的次序。誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點(diǎn)是：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。 （2）自溶法（Autolysis）某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。2 化學(xué)滲透法（Chemical permeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。 酸處理可以

19、使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。（1）酸、堿處理法細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。（2）表面活性劑無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解 能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。 有機(jī)溶劑可采用

20、丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3）有機(jī)溶劑（4）EDTA螯合劑處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難， 并影響最終產(chǎn)物純度化學(xué)滲透法特點(diǎn)：缺點(diǎn)對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提

21、取。優(yōu)點(diǎn)3 物理法滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法干燥法1）滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。滲透壓細(xì)胞破碎 2）凍結(jié)-融化法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從

22、而增加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。 使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥機(jī)械破碎法與非機(jī)械破碎法的比較比較項(xiàng)目機(jī)械法非機(jī)械法破碎機(jī)理切碎細(xì)胞溶解局部壁膜碎片大小碎片細(xì)小細(xì)胞碎片較大內(nèi)含物釋放全部部分黏度高（核酸多）低（核酸少）時(shí)間，效率時(shí)間

23、短，效率高時(shí)間長(zhǎng)，效率低設(shè)備需專用設(shè)備不需專用設(shè)備通用性強(qiáng)差經(jīng)濟(jì)成本低成本高應(yīng)用范圍實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)范圍實(shí)驗(yàn)室范圍選擇破碎方法的依據(jù)：細(xì)胞處理量； 細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性； 破碎程度；目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放破碎率的測(cè)定細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。 直接測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破

24、碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。破碎技術(shù)的發(fā)展方向1 多種破碎方法相結(jié)合 機(jī)械法與非機(jī)械法 化學(xué)法與酶法 多種化學(xué)試劑處理 多種酶制劑處理2 與上游相結(jié)合（1）寄主細(xì)胞的選擇：選擇較易破壁的菌種作為寄主細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌。 （2）培養(yǎng)過(guò)程控制 ：在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)胞生長(zhǎng)的后期，加入某些能抑制或阻止細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑（如青霉素、環(huán)絲氨酸等），繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，新分裂的細(xì)胞其細(xì)胞壁存在缺陷，利于破碎，而有些胞內(nèi)產(chǎn)物不經(jīng)破碎即可直接滲透出來(lái)。 （3）克隆噬菌體溶解基因 ：在細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)噬菌體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細(xì)胞自內(nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。 （4）

25、耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá) ：如果產(chǎn)品能表達(dá)成耐高溫型，雜蛋白仍然保持原特性，那么就可在較高溫度下將產(chǎn)品與雜質(zhì)分開，這樣既節(jié)省了冷卻費(fèi)用，又簡(jiǎn)化了分離步驟。 破碎技術(shù)研究方向-與下游工程相結(jié)合舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶743 與下游相結(jié)合細(xì)胞破碎與固液分離和產(chǎn)品提取過(guò)程相結(jié)合，也即根據(jù)后處理過(guò)程的單元操作確定細(xì)胞破碎的方法和操作條件。包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形

26、成不溶物原因？蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài) 蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包含體的構(gòu)成基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。包涵體獲得幾種常見的工藝路線(一)機(jī)械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復(fù)性特點(diǎn):是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。優(yōu)點(diǎn)：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。缺點(diǎn):要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去