現(xiàn)代生物技術(shù)動(dòng)物基因工程

1、現(xiàn)代生物技術(shù)動(dòng)物基因工程概況1、1982年，美國華盛頓大學(xué)等采用顯微注射法，將大鼠生長基因?qū)胄∈笫芫训男墼藘?nèi)，得到轉(zhuǎn)基因小鼠以來，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物種系內(nèi)和種系間細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移，構(gòu)建了各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用：研究基因的表達(dá)與功能，生產(chǎn)生物大分子；生產(chǎn)人體蛋白；改良動(dòng)物；醫(yī)用轉(zhuǎn)動(dòng)物模型。例如研究哺乳動(dòng)物的基因表達(dá)和發(fā)育、人類疾病的動(dòng)物模型系統(tǒng)的建立，在動(dòng)物乳汁中生產(chǎn)重要的醫(yī)用蛋白等等。3、轉(zhuǎn)基因人的研究只能限于體細(xì)胞的基因治療，具有遺傳特征修飾的轉(zhuǎn)基因人的研究，可否邁出歷史的一步？問題多多。4、動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移無論用何技術(shù)，轉(zhuǎn)移效率極低。第一節(jié) 基本概念1、定義：基因轉(zhuǎn)動(dòng)物（

2、transgenic animal)：指基因組中整合有用轉(zhuǎn)基因技術(shù)所導(dǎo)入的外源基因（或特定的DNA片段），整個(gè)技術(shù)則稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)(transgenic technology或transgenesis)。 理論上講任何動(dòng)物都可以通過性系基因操作成相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（如：魚、鼠、羊、牛等）2、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)程序?qū)⒖寺〉耐庠椿蜃⑸涞揭粋€(gè)受精卵的細(xì)胞核中；接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發(fā)育；移植后的受精卵發(fā)育生長為后代，其中的部分后代其細(xì)胞中都攜帶有轉(zhuǎn)入的外源基因；利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物作為種畜或種禽，培育新的純合系。3、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的效率 動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)和終點(diǎn)分別為受

3、精卵和含有整合轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物子代。在這個(gè)過程中，轉(zhuǎn)基因的效率極低。以小鼠轉(zhuǎn)基因?yàn)槔?以小鼠轉(zhuǎn)基因?yàn)槔?注射外源基因后受精卵的存活率為86； 將受精卵移殖到母鼠子宮內(nèi)后受精卵的存活 率為25 母鼠的懷孕率為80 轉(zhuǎn)基因在基因組上的整合率為24 因此小鼠轉(zhuǎn)基因的總有效率約為44、動(dòng)物基因的結(jié)構(gòu)1）基因組片段：分子較大，保持較完整的基因結(jié)構(gòu)。2）融合基因：將不同來源的結(jié)構(gòu)基因、非編碼序列、表達(dá)調(diào)控序列重組成雜合單元。3）小基因：分別取同一基因的某一區(qū)域或若干區(qū)域組成轉(zhuǎn)基因。4）靶基因：結(jié)構(gòu)基因或調(diào)控序列經(jīng)誘變或定向突變處理后，重新輸回動(dòng)物體內(nèi)。5）插入基因：含有在動(dòng)物染色體上隨機(jī)或特異性插入位點(diǎn)，

4、可裝標(biāo)記基因。6）置換基因：兩側(cè)含動(dòng)物基因或其他DNA區(qū)域的同源序列。 5、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特性1.轉(zhuǎn)基因的時(shí)空特異性表達(dá) 動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控的顯著特性：時(shí)空特異性，特別是在發(fā)育過程中，相關(guān)基因的時(shí)序特異性和組織特異性表達(dá)更為嚴(yán)格。2.轉(zhuǎn)基因的可控表達(dá) 誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因，對其穩(wěn)定高效表達(dá)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)條件取決于受體細(xì)胞的性質(zhì)和啟動(dòng)子的類型。3.轉(zhuǎn)基因的共抑制效應(yīng) 在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)常會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)基因的失活，也稱為轉(zhuǎn)基因沉默。共抑制效應(yīng)特征1）共抑制只發(fā)生在轉(zhuǎn)基因與同源的內(nèi)源性基因之間，對其他的基因表達(dá)不產(chǎn)生影響；2）如果轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因發(fā)生體內(nèi)重組，則共抑制效應(yīng)隨之消失，基

5、因表達(dá)恢復(fù)正常；3）共抑制現(xiàn)象的發(fā)生與結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)有關(guān)，但不依賴于啟動(dòng)子的來源和性質(zhì)。4）兩個(gè)相同的轉(zhuǎn)基因之間也能發(fā)生共抑制效應(yīng)。造成轉(zhuǎn)基因共抑制效應(yīng)的原因1）轉(zhuǎn)基因與其同源的內(nèi)源性基因相互作用，形成某種狀態(tài)而影響兩者表達(dá)；2）轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因競爭性結(jié)合核基質(zhì)和核包膜上轉(zhuǎn)錄翻譯必須的非擴(kuò)散元件，導(dǎo)致相互抑制；3）兩者轉(zhuǎn)錄出互為反義的RNA結(jié)構(gòu)，使之失活并 迅速降解；4）由于轉(zhuǎn)基因的存在，受體細(xì)胞中mRNA的大量積累，并激活某些未知酶系的表達(dá)，導(dǎo)致mRNA降解。 轉(zhuǎn)基因表達(dá)單方面失活的原因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)單方面失活，而同源的內(nèi)源性基因卻表達(dá)正常。1）轉(zhuǎn)基因被受體細(xì)胞識(shí)別為異己DNA

6、，并將它甲基化修飾，使其失活；2）轉(zhuǎn)基因整合在不合適的染色體部位，受局部條件影響而不表達(dá)；3）轉(zhuǎn)基因本身的結(jié)構(gòu)不利于其表達(dá)。 6、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的生物學(xué)特性效應(yīng)1）應(yīng)用于動(dòng)物基因組結(jié)構(gòu)與功能的研究以報(bào)告基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因探測動(dòng)物或人基因組中時(shí)空特異性表達(dá)調(diào)控序列；以反義基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因滅活相關(guān)的內(nèi)源基因，構(gòu)建基因表達(dá)缺陷功能喪失的動(dòng)物模型，以篩選鑒定人類功能性基因，并為藥物提供實(shí)驗(yàn)實(shí)體；以同源基因?yàn)檗D(zhuǎn)基體內(nèi)檢測其表達(dá)特性及產(chǎn)物的生物效應(yīng)。 2）轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良動(dòng)物物種3）對人體中數(shù)千種分子病的基因治療4）利用此技術(shù)構(gòu)建優(yōu)異的動(dòng)物反應(yīng)器 為什么要選鼠作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型？1、人類與老鼠共享著80的遺傳物質(zhì)和99的基

7、因，人類和老鼠基因組同源度高，對它進(jìn)行比較研究可以得知很多關(guān)于人類疾病和生理機(jī)能的研究，因此了解老鼠非常有助于了解人類本身。2、由于鼠的生殖周期短，產(chǎn)仔數(shù)多，基因整合率較高。飼養(yǎng)成本較低，因此成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的首選動(dòng)物。 為什么要選擇乳腺來生產(chǎn)藥物蛋白?1, 奶汁可以由乳腺不斷地分泌，而且產(chǎn)量很高，長期收集也不會(huì)對動(dòng)物造成傷害；2，將新的藥物蛋白限制在乳腺內(nèi)生產(chǎn)，最后分泌到乳汁中，一般不易對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常生理活動(dòng)造成影響；3，乳腺分泌的蛋白質(zhì)是經(jīng)過正常的高等哺乳動(dòng)物的翻譯后加工的，這使得生產(chǎn)的藥物蛋白更接近于人類自身的蛋白質(zhì)；4，乳汁中蛋白純化起來相對較為容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白質(zhì)

8、也為數(shù)不多(表121)。 第二節(jié) 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的研究方法 最早發(fā)展并較為完善的系統(tǒng)是小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)從20世紀(jì)80年代初期到現(xiàn)在，人們已經(jīng)將上百種不同的基因轉(zhuǎn)人了小鼠，這些研究為進(jìn)一步了解高等動(dòng)物的基因表達(dá)調(diào)控、腫瘤的發(fā)生、免疫特異性、胚胎發(fā)生、發(fā)育過程以及分子遺傳學(xué)等基礎(chǔ)生物學(xué)過程做出了重要貢獻(xiàn)；同時(shí)，在判斷利用家畜生產(chǎn)人類藥物的可行性、構(gòu)建人類各種遺傳疾病的生物醫(yī)學(xué)模型方面，轉(zhuǎn)基因鼠也發(fā)揮了重要的作用。1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要方法一、利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源基因轉(zhuǎn)入胚胎早期細(xì)胞，然后移植到受體動(dòng)物中；二、利用顯微注射法將DNA直接注射入受精卵的精前核中；三、將基因工程改造過的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入早期

9、胚胎中。用該方法已成功地得到了豬、羊、雞、免、牛、魚等多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 2 、 反轉(zhuǎn)錄病毒法 在各種基因轉(zhuǎn)移方法中，通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體把外源基因整合到受體細(xì)胞核基因組中是目前最有效的方法之一(圖121)。圖12-1 通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體獲得轉(zhuǎn)基因小鼠反轉(zhuǎn)錄病毒法的缺陷1）反轉(zhuǎn)錄病毒載體容量有限，只能轉(zhuǎn)移小片段DNA(10kb)。轉(zhuǎn)入的基因易缺少其鄰近的調(diào)控序列。2）反轉(zhuǎn)錄病毒載體因缺失了復(fù)制功能序列，在復(fù)制載體DNA所用的輔助病毒(helper virus)基因組也可能與目的基因一起整合到同一細(xì)胞核中。另外轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自身也有可能產(chǎn)生輔助病毒株。這樣轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雖合成了人們所需的產(chǎn)品，但也有可能大量

10、復(fù)制病毒。3）目前的技術(shù)水平要完全杜絕反轉(zhuǎn)錄病毒在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物商品中的污染是很難做到的。因此一般人們很少用反轉(zhuǎn)錄病毒載體來制造商業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 3、 DNA顯微注射法（1） 用顯微注射器把DNA直接注射到動(dòng)物的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中（直接注射和穿刺導(dǎo)入法）。受體細(xì)胞： 1）多為沿培養(yǎng)皿壁生長的單層細(xì)胞； 2）動(dòng)物的卵細(xì)胞。轉(zhuǎn)化效率：取決于注射DNA性質(zhì)和注射技巧。 3 、 DNA顯微注射法（2） 向供體雌鼠注射懷孕母馬的血清，48h后再注射人的絨毛膜促性腺激素，使其超量排卵，經(jīng)處理的雌鼠可以產(chǎn)約35個(gè)卵細(xì)胞/次、正常雌鼠只能產(chǎn)510個(gè)卵細(xì)胞/次。然后，從這些交配后的雌鼠的輸卵管中取出受精卵。隨后

11、將外源基因注射進(jìn)受精卵中。 微注射的轉(zhuǎn)入基因常要?jiǎng)h除原核載體序列的線性DNA。在哺乳動(dòng)物中，精于進(jìn)入卵細(xì)胞后的l h內(nèi)，精前核和卵細(xì)胞的核都是分開的。等到卵細(xì)胞核完成減數(shù)分裂，成為卵前核時(shí)，核融合才進(jìn)行，這又稱為核配。DNA微注射要在精前核時(shí)注射才能有效。精前核比卵前核更大，因此可在顯微鏡下找到處在精前核狀態(tài)下的受精卵。并對受精卵進(jìn)行取向和固定，然后進(jìn)行DNA微注射(圖122)。 圖122 DNA顯微注射示意圖3、DNA顯微注射法(3) 注射完成后，用顯微外科手術(shù)將2540個(gè)受精卵移植到假孕雌鼠的子宮內(nèi)，制造雌鼠假孕（可以讓它與切除了輸精管的不育雄鼠交配），將受精卵移入代孕母鼠子宮中大約3周后

12、，接受過注射的受精卵發(fā)育生長為幼鼠，由代孕母鼠產(chǎn)下(圖12-3)。圖12-33、DNA顯微注射法(4)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行檢測：1）取一小截幼鼠的尾巴，提取DNA進(jìn)行Southern雜交或PCR檢測，看是否存在轉(zhuǎn)入基因。2）將它與另一只鼠進(jìn)行交配來確定轉(zhuǎn)入基因是否存在其生殖系中。3）通過對子代進(jìn)行雜交產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因鼠(圖124)。 圖124 顯微注射法獲得的轉(zhuǎn)基因鼠的純合鼠系，轉(zhuǎn)基因雜合鼠； 口，未轉(zhuǎn)基因鼠DNA顯微注射法的評價(jià)(1) 技術(shù)性很強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率低，通常發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的受精卵一般占注射受精卵的5，而每1000個(gè)接受微注射的受精卵里能產(chǎn)生3050只轉(zhuǎn)基因幼鼠。大多數(shù)情況下通過微

13、注射法獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率只有l(wèi)/1000。有人用增大微注射受精卵的數(shù)目來彌補(bǔ)缺陷。 對于顯微注射用的DNA的要求高：1）轉(zhuǎn)入的外源基因要能夠高效表達(dá)，2）可以誘導(dǎo)表達(dá)。3）具有幫助提高整合效率的序列。在注射的載體中加上MAR序列(matrix attach region)，這種序列位于染色體的基部，具有隔離作用，可以幫助基因高效表達(dá)。4） ，在外源基因兩端可加入微衛(wèi)星序列，因在染色體上也有微衛(wèi)星序列，兩個(gè)微衛(wèi)星序列可以幫助發(fā)生同源重組，提高整合效率。圖125 用顯微注射法獲得的幾種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成活率 圖126 轉(zhuǎn)入基因的結(jié)構(gòu)示意圖。DNA顯微注射法的評價(jià)(2) 由于微注射法所注射的DNA在

14、宿主基因組中是隨機(jī)整合的，并且有可能發(fā)生多個(gè)拷貝插入同一位點(diǎn)的情況，因此轉(zhuǎn)入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，從而干擾該基因的正常表達(dá)，影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的正常發(fā)育和代謝；另外，有的外源基因的表達(dá)具有時(shí)間性，得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能只在一段時(shí)期內(nèi)表達(dá)外源基因；有些個(gè)體可能因基因插入位點(diǎn)不合適而無法表達(dá)產(chǎn)物；還有些個(gè)體基因拷貝數(shù)過多導(dǎo)致表達(dá)過量，干擾自身的正常生理活動(dòng)。 因此，并不是所有的轉(zhuǎn)基因小鼠都能產(chǎn)生預(yù)期的性狀。由于這些原因，DNA微注射法的總效率還是比較低，但是這種方法仍然是目前獲得轉(zhuǎn)基因鼠的常規(guī)方法。4 、 胚胎干細(xì)胞方法 多能胚胎干細(xì)胞：動(dòng)物胚泡發(fā)育期的胚細(xì)胞重新導(dǎo)入另一胚泡期的胚

15、之后，它仍然保持著分化成其他類型細(xì)胞的能力，這種細(xì)胞叫做多能胚胎干細(xì)胞。 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，簡稱ES細(xì)胞)的獲得：分離胚泡的內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)進(jìn)行培養(yǎng)。ES細(xì)胞在無飼養(yǎng)層的平板中培養(yǎng)時(shí)會(huì)持續(xù)分化為肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種功能細(xì)胞，只有在含有成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層或白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)的飼養(yǎng)層上生長時(shí)，才能保持其未分化狀態(tài)，保持ES細(xì)胞的潛在分化能力(圖127)。圖127 從鼠的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞法 在ES細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，可通過基因工程操作，利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體、電擊法等多種方

16、法將外源基因?qū)薊S細(xì)胞，而不改變它的分化能力。 將有功能的轉(zhuǎn)入基因整合到ES細(xì)胞基因組內(nèi)的某一非必需基因位點(diǎn)上，然后對這些細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(圖128)。這種方法避免了在DNA微注射法與反轉(zhuǎn)錄病毒載體方法中存在的基因隨機(jī)整合的問題。圖128 通過胚胎干細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因小鼠示意圖 圖128圖1210 PCR法檢測是否特異整合同源重組示意圖遺傳學(xué)分析 正確整合的轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞系經(jīng)培養(yǎng)后就可以移入胚泡期的胚胎了。將這些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內(nèi)，這樣產(chǎn)生的子代其部分生殖系細(xì)胞就是由轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞形成的。然后在得到的轉(zhuǎn)基因鼠間進(jìn)行雜交，子代再配對雜交。 根據(jù)孟德爾遺傳定律，將

17、有14的可能獲得純合的轉(zhuǎn)基因鼠(圖1211)，即轉(zhuǎn)入基因可以和正?；蛞粯臃蛛x。ES方法評價(jià) 目前，利用ES細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠主要是用于基礎(chǔ)研究。從原理上講，胚胎干細(xì)胞法應(yīng)當(dāng)也適用于獲得其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但遺憾的是，這種方法目前還沒有在牛、羊、豬及雞等家畜、家禽的研究中使用；利用ES細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法還有一個(gè)缺點(diǎn)，就是需要經(jīng)過多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這對飼養(yǎng)成本高，產(chǎn)仔數(shù)較少的大型哺乳動(dòng)物來說，如牛、羊等，要獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是一件需要大量資金投入的事情。第三節(jié) 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因載體一、SV40病毒載體 1. SV40病毒的基本生物學(xué)特征 2.取代型重組病毒載體 3.重組的病毒質(zhì)粒載體二、反

18、轉(zhuǎn)錄病毒載體 1.一般生物學(xué)特性 2.主要類型三、其他病毒載體動(dòng)物病毒的特點(diǎn)1、有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子；2、能夠持續(xù)地復(fù)制使基因 達(dá)到相當(dāng)高濃度，并實(shí)現(xiàn)有效的表達(dá)；3、能有效控制自己的作用因子，長時(shí)間的保持高拷貝的外源基因；4、能高效穩(wěn)定地整合到染色體；5、病毒外殼蛋白能夠識(shí)別細(xì)胞接受器，能夠?qū)⑼庠吹鞍赘咝У貙?dǎo)入宿主細(xì)胞。SV40病毒1、小型20面體蛋白質(zhì)顆粒，3種病毒外殼包裝一條環(huán)型的病毒基因組DNA ；2、它的DNA剪輯模型相當(dāng)復(fù)雜；3、SV40基因組中存在一個(gè)增強(qiáng)子序列，它的功能是促進(jìn)病毒有效的早期轉(zhuǎn)錄，能夠促進(jìn)激發(fā)或增強(qiáng)位于鄰近的任何啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。反轉(zhuǎn)錄病毒載體類型1、

19、輔助病毒互補(bǔ)的重組的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體；2、無需輔助病毒互補(bǔ)的重組的反轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體；3、廣寄主范圍的反轉(zhuǎn)錄病毒載體；4、反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體、第四節(jié) 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用 人們對于鼠的發(fā)育和遺傳過程有了比較清晰的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也形成了一整套比較成熟和完善的技術(shù)。因此，有人把鼠稱為哺乳動(dòng)物中的“大腸桿菌”和“酵母”，是人們研究高等哺乳動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控和發(fā)育的重要工具。轉(zhuǎn)基因鼠還可為研究人類的各種疾病，包括遺傳疾病、癌癥等疑難病癥建立模型系統(tǒng)。1、人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 完整的動(dòng)物模型可以模擬人類疾病的起始和發(fā)展，并為測試各種可能的治療方案提供一個(gè)統(tǒng)一有效的系統(tǒng)。幫助了解疾病的病因和發(fā)展過程。各種人類

20、遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimersdisease)、關(guān)節(jié)炎(arthritis)、肌肉營養(yǎng)缺乏癥(muscular distrophy)、腫瘤發(fā)生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經(jīng)衰變癥(neurodegenenerative disorder)、內(nèi)分泌功能障礙(endocrinological disfunction)、動(dòng)脈硬化癥及其他很多疾病。老年性癡呆癥研究模型 是一種大腦功能衰退疾病，特點(diǎn)是抽象思維能力和記憶力逐漸減退，并常伴隨性格改變、語言障礙、動(dòng)作遲緩等癥狀。約有1的60一65歲間的老人，30的80歲以上的老人都可能患這種病

21、，可惜這種病很難進(jìn)行臨床診斷。 研究發(fā)現(xiàn)在老年性癡呆癥患者大腦的新皮質(zhì)(neocortex)和海馬區(qū)(hippocampus)，神經(jīng)纖維糾結(jié)成團(tuán)在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)積累，并在軸突末端形成了濃密的胞外聚集體，稱為老年斑(senile plaque)，同時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞減少。另外，在患者的腦血管中發(fā)現(xiàn)了一種名為類淀粉小體(amyloid body)的聚集體。遺傳疾病的其它轉(zhuǎn)基因小鼠模型除了像老年性癡呆癥這樣的特殊遺傳疾病以外，人們還建立了大量一般性遺傳疾病的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，如I型糖尿病模型NOD小鼠、X染色體連鎖杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy)模型mdx小鼠、地中海

22、貧血癥模型地中海貧血小鼠等。這些模型都成功地模擬了人類疾病的表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)理，為相應(yīng)的人的疾病的研究和治療提供了有力的依據(jù)。 唐氏綜合癥是一種由于人的2l號染色體三體而造成的遺傳疾病，使用目前的技術(shù)手段還難以將全長的染色體轉(zhuǎn)入模型鼠，因此現(xiàn)在人們建立的部分三體轉(zhuǎn)基因鼠模型實(shí)際上是將21號染色體上的銅鋅超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因轉(zhuǎn)入鼠體內(nèi)而建成的。結(jié)果人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠腦中的CuZnSOD活性增加了1.66倍，鼠的肌肉接頭發(fā)生了類似過度老化的變化，并且伴有肌肉萎縮、變性、退化和末端軸突的破壞，巨線粒體、脂肪滴及脂褐質(zhì)體的增加等唐氏綜合癥的癥狀。遺傳疾病的其它轉(zhuǎn)基因小鼠模型(續(xù))II型成骨不

23、全癥(osteogenesis imperfecta type II)患者的胞外基質(zhì)發(fā)育不正常，往往是胎兒未出生就死亡或是新生兒夭折。造成胞外基質(zhì)發(fā)育異常的主要原因是患者體內(nèi)形成了異常的I型膠原。正常的I型膠原是由兩條l(I)鏈和一條1(II)鏈組成的三股螺旋，而成骨不全癥患者的1(1)鏈上發(fā)生了突變，導(dǎo)致無法形成正常的I型膠原。有人將人的編碼突變的1(1)鏈的基因通過微注射法轉(zhuǎn)入小鼠后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠在出生前后即全部死亡。 進(jìn)一步的研究表明，由突變的1(I)鏈基因編碼的l(1)鏈蛋白只占形成I型膠原的前體1(1)鏈的10，但是在這些天折的轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)異常的I型膠原卻占全部I型膠原的54。 由

24、此，科學(xué)家們推測，異常I型膠原不僅會(huì)干擾正常的胞外基質(zhì)的形成，而且可能會(huì)促進(jìn)正常I型膠原的降解，導(dǎo)致正常構(gòu)象的I型膠原在體內(nèi)急劇減少，這就使人們對于成骨不全癥的發(fā)病機(jī)制有了更進(jìn)一步的了解。遺傳疾病的其它轉(zhuǎn)基因小鼠模型(續(xù)) 人們還建立了另一種常在童年發(fā)病的遺傳疾病視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。在這個(gè)模型中，轉(zhuǎn)入基因是黃體生成素(luteinizing hormone)亞基的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的SV40病毒的大T抗原。 人們觀察到，在5個(gè)月之后，轉(zhuǎn)基因鼠開始出現(xiàn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，在轉(zhuǎn)基因鼠中腫瘤的發(fā)生機(jī)制與在人體內(nèi)的發(fā)生機(jī)制并不相同；對于人的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的研究表明，人的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是由于兩個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞

25、瘤敏感基因均發(fā)生突變而造成的，但是在轉(zhuǎn)基因鼠中，這兩個(gè)敏感基因并未突變。 后來人們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入基因中的SV40病毒的大T抗原可以與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤敏感基因編碼的蛋白p105Rb相結(jié)合，從而大大降低了p105Rb在細(xì)胞中的水平，導(dǎo)致視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。盡管如此，由于在轉(zhuǎn)基因鼠中腫瘤的癥狀與在人類中十分相似，這一模型仍可用來研究腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移特性。遺傳疾病的其它轉(zhuǎn)基因小鼠模型(續(xù))由于鼠和人在代謝途徑上存在一定的差異，所以有時(shí)同樣的突變可能導(dǎo)致不同的癥狀。例如人類的自毀容貌綜合癥(Lesch-Nyhan syndrome)是由于位于X染色體上的編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-

26、guanine phosphori-bosyl transferase，HGPRT)的基因發(fā)生了突變，導(dǎo)致HGPRT失活。HGPRT失活造成次黃嘌呤合成和鳥嘌呤合成的補(bǔ)救途徑被阻。 顧名思義，自毀容貌綜合癥患者的主要癥狀是思維障礙和行為怪異，患者常常自殘肢體。但是HGPRT基因缺失的鼠其行為完全正常，究其原因是由于鼠類能夠利用尿酸氧化酶(urate oxidase)來代替HGPRT完成次黃漂吟和鳥漂吟的補(bǔ)救途徑。只有先將尿酸氧化酶基因缺失，再引入突變的HGPRT基因，才能得到具有與人的癥狀類似的鼠模型。 隨著人類基因組計(jì)劃研究的日益深入，關(guān)于人類自身遺傳信息的知識(shí)變得越來越多，相信不久的將來會(huì)

27、有更多的人類疾病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型問世。用于人類病毒病的研究除了用于由基因突變而造成的人類遺傳疾病的研究外，人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型還可用于人類病毒病的研究。病毒具有一定的宿主特異性，因此很多用作模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根本不能被人類病毒所侵染，這就給這類病毒病的研究帶來了很大的困難。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)恰恰提供了解決這一難題的方法，即可將病毒的基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)進(jìn)行研究。 例如，一種稱為JC的人類乳多空病毒可以引起人的多病灶腦病，其主要原因是由于產(chǎn)生髓鞘質(zhì)細(xì)胞的解體，造成髓鞘質(zhì)不足，導(dǎo)致多種中樞神經(jīng)病變。 將JC病毒基因序列轉(zhuǎn)入鼠以后，轉(zhuǎn)基因鼠會(huì)產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，隨著年齡的增長，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變

28、引起的震顫日益嚴(yán)重，同時(shí)人們發(fā)現(xiàn)這些鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘也在不斷減少，由此研究人員推斷JC病毒侵入人體后可以破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘生成細(xì)胞，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。這種轉(zhuǎn)基因鼠就成了人類病毒病研究的動(dòng)物模型。2 、 利用轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn) 基因敲除(gene knock out)是在研究基因的結(jié)構(gòu)和功能常用的方法之一。由于轉(zhuǎn)入基因插入染色體之后，可能會(huì)導(dǎo)致插入的某一內(nèi)源基因而破壞該基因的功能，形成某一基因功能缺失的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。利用這種基因定向插入某一內(nèi)源基因而破壞其功能的方法，來研究某一特定基因在發(fā)育過程中的功能. 人們利用胚胎干細(xì)胞法把轉(zhuǎn)入基因定點(diǎn)整合到鼠基因組的某一位置，可以得到敲除

29、了某一特定功能基因的轉(zhuǎn)基因鼠，為這一基因的功能進(jìn)行深入的研究打下了基礎(chǔ)。3、轉(zhuǎn)基因鼠克隆在發(fā)育中起重要作用的基因 轉(zhuǎn)基因的插入可破壞被插入基因的正常表達(dá)，如果該基因是發(fā)育過程中具有重要作用的基因，那么相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就會(huì)出現(xiàn)畸形，因此用轉(zhuǎn)基因作為探針把這一在發(fā)育過程中起重要作用的基因克隆出來。 例如：有人把鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammany tumor virus，MMTV)的LTR序列與鼠的c-myc基因構(gòu)建成轉(zhuǎn)基因(圖1213)。將這轉(zhuǎn)基因通過顯微注射轉(zhuǎn)入小鼠后，一些純合的轉(zhuǎn)基因鼠出現(xiàn)了四肢異常，在尺骨、撓骨或胚骨、腓骨的部位只有一根骨頭，而且沒有關(guān)節(jié)，并且雜交實(shí)驗(yàn)證明LTR-c-

30、myc轉(zhuǎn)入基因與這些四肢異常的性狀是緊密相關(guān)的，這表明轉(zhuǎn)基因破壞了某個(gè)對四肢形成有重要意義的內(nèi)源基因。 圖1213 LTR-c-myc轉(zhuǎn)入基因的結(jié)構(gòu)及其在轉(zhuǎn)基因鼠中的遺傳情況2 利用轉(zhuǎn)基因鼠研究細(xì)胞的功能 如用合適的啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)基因，可使轉(zhuǎn)基因只在特定類型的細(xì)胞中表達(dá)。因此設(shè)計(jì)將毒素基因置于細(xì)胞類型特異性的啟動(dòng)子之后，就可殺死某一類特殊的細(xì)胞，并可進(jìn)一步確定缺失這類細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因鼠在發(fā)育過程中是否有異常表現(xiàn)，從而確定該類細(xì)胞在發(fā)育過程中的作用. 例如，彈性蛋白酶1只在胰腺的外分泌部分表達(dá)，利用彈性蛋白酶I的啟動(dòng)子引導(dǎo)毒素蛋白僅在胰腺的外分泌部分表達(dá)。晶狀蛋白只在晶狀體中表達(dá)，其啟動(dòng)子也可用于引導(dǎo)

31、毒素基因在特異的細(xì)胞種類中表達(dá)。5 、 轉(zhuǎn)基因鼠作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因鼠可用于在乳汁中表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的表達(dá)模型系統(tǒng)。例如，用囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白CFTR)來研究其功能，以確定治療囊性纖維化(CF)的可能方案。囊性纖維化是一種遺傳疾病，在歐洲，大約每2 500人中就有一個(gè)人一出生即患有此病。而患有這種病的人大約只能活25年。 CF基因的異常首先會(huì)影響囊性纖維化跨膜蛋白，使氯離子通道功能發(fā)生改變。當(dāng)進(jìn)出細(xì)胞的正常氯離子流受到破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致在幾種器官，特別是在肺和胰腺中的導(dǎo)管中堆積粘液。粘液很容易成為細(xì)菌侵染的“攻擊目標(biāo)”，并且很難用抗生素來控制；細(xì)菌死后釋放的DNA會(huì)使粘液變得更粘稠，

32、逐漸阻塞導(dǎo)管，使器官正常的功能受到影響，從而加重囊性纖維化癥狀。圖1214 CFTR基因cDNA cDNA表達(dá)結(jié)構(gòu)CFTR基因表達(dá)分析 將酪蛋白基因啟動(dòng)子控制的CFTR基因轉(zhuǎn)入鼠后，構(gòu)建了攜帶這一基因的轉(zhuǎn)基因鼠系。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因雌鼠的乳汁中含有結(jié)合在脂肪球粒膜上的CFTR蛋白，而且轉(zhuǎn)基因的哺乳母鼠與其喂養(yǎng)的小鼠均無不良反應(yīng)。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的CFTR蛋白經(jīng)過了糖基化，并且很容易從乳汁中富含脂肪的部分抽提出來，奶中生產(chǎn)膜結(jié)合蛋白這一想法得到了科學(xué)家的肯定。 3 、 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)例 1、 轉(zhuǎn)基因牛 如要把哺乳動(dòng)物的乳腺用作生物反應(yīng)器，那么奶牛就是轉(zhuǎn)基因的首選動(dòng)物。每只奶牛每年能產(chǎn)1000L以

33、上的牛奶，平均每千克牛奶含35g蛋白質(zhì)，因此轉(zhuǎn)基因奶?？梢猿蔀樯a(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的經(jīng)濟(jì)有效的“工廠”(表123)。主要步驟：從屠宰場殺掉的奶牛體內(nèi)收集卵母細(xì)胞，并使之在體外成熟； 用公牛精液對成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精； 受精卵離心，濃縮卵黃； 將欲導(dǎo)入的DNA微注射到精前核當(dāng)中； 對胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)；利用非外科移植術(shù)將一個(gè)胚胎植入發(fā)情的代孕母牛子宮內(nèi)； 對子代進(jìn)行DNA檢測，確定是否存在轉(zhuǎn)入基因(圖1215)。轉(zhuǎn)基因牛技術(shù)評價(jià)盡管轉(zhuǎn)基因牛有很好的發(fā)展前途，然而轉(zhuǎn)基因牛的大量生產(chǎn)卻進(jìn)展緩慢，因?yàn)楂@得轉(zhuǎn)基因牛比獲得其他轉(zhuǎn)基因動(dòng)物要更加困難。一般來說，利用微注射法把外源基因注入精前核時(shí)，要利用微分干涉相

34、差顯微鏡differential interference contrast (DIC) microscopy才能分辨精前核；DIC顯微鏡能分辨羊和兔的精前核，但是難以分辨豬、牛等的精前核，還需對它們進(jìn)一步進(jìn)行超速離心才可能分辨出，這就增加了操作的難度。而且，從受精卵發(fā)育成小牛差不多要花費(fèi)兩年的時(shí)間，且牛每胎產(chǎn)仔的數(shù)目很少，這又進(jìn)一步提高了成本。2、 轉(zhuǎn)基因綿羊、山羊和豬 對綿羊、山羊的轉(zhuǎn)基因研究大多集中于利用其乳腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白。 雖然綿羊、山羊的產(chǎn)奶量比奶牛低，但它們每年也能生產(chǎn)幾百升，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因羊比轉(zhuǎn)基因牛更容易獲得。 有人采用與生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因鼠類似的方法，構(gòu)建了用乳腺特異性啟

35、動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼人類基因的載體(表124)，得到的轉(zhuǎn)基因綿羊和山羊，它們都能將表達(dá)的人類蛋白質(zhì)分泌到乳汁中(圖1216)。 轉(zhuǎn)基因羊表達(dá)的轉(zhuǎn)入基因編碼的蛋白質(zhì)是經(jīng)過糖基化的，理論上講應(yīng)該同從人體內(nèi)提取的蛋白質(zhì)一樣具有生物活性。但是，要確定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)與人的蛋白質(zhì)的天然形式是否完全相同，還需進(jìn)行更深入的研究。圖1216 12-17圖1217圖216轉(zhuǎn)基因豬豬的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，以轉(zhuǎn)化人的血紅蛋白基因最為成功。具體做法是：將人珠蛋白基因的調(diào)控區(qū)域與兩個(gè)人l珠蛋白，一個(gè)人a珠蛋白基因相連接，構(gòu)建載體。得到的轉(zhuǎn)基因豬在血液中表達(dá)了人的血紅蛋白，人們根據(jù)各種化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)現(xiàn)，它們與天然的人血紅蛋

36、白性質(zhì)完全相同。 也許在不遠(yuǎn)的將來人們就可以用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的人血紅蛋白來輔助輸血了。3、 轉(zhuǎn)基因魚 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變魚的遺傳品質(zhì)，作為重要的模式動(dòng)物用于研究脊椎動(dòng)物的發(fā)育、癌基因的功能及激素對脊椎動(dòng)物的生長發(fā)育的影響等基礎(chǔ)研究成為重要的研究目標(biāo)。 要獲得轉(zhuǎn)基因魚，首先要選擇適當(dāng)?shù)聂~類品種作為基因的受體。迄今為止，人們已經(jīng)運(yùn)用微注射法向很多種魚的受精卵中導(dǎo)入了外源基因，魚類品種包括鯉魚、鮑魚、蹲魚、鮭魚和羅非魚等。 轉(zhuǎn)基因魚類型 根據(jù)基因轉(zhuǎn)化的目的不同，轉(zhuǎn)基因可分為3類： 一、使魚獲得某種新的有用性狀； 二、使魚丟失某種有害性狀； 三、在魚體內(nèi)表達(dá)報(bào)道基因，檢測啟動(dòng)子的活性。 轉(zhuǎn)基因標(biāo)記對于

37、第一類基因而言，轉(zhuǎn)入基因載體應(yīng)當(dāng)含有選擇性標(biāo)記基因、目的基因、啟動(dòng)子或增強(qiáng)子及DNA復(fù)制起始位點(diǎn)；如果是用于第二種目的，可以轉(zhuǎn)入目的基因的反義基因，使某一特定的基因失活；用于第三種目的的轉(zhuǎn)基因魚中常轉(zhuǎn)入CAT基因和半乳糖苷酶基因等作為報(bào)道基因。4、 克隆動(dòng)物 1997年2月23日英國科學(xué)家Wilmut等人向全世界宣布，世界上第一只來源于體細(xì)胞的、通過克隆方式獲得的克隆羊多莉問世了。這條消息立即在生物學(xué)和非生物學(xué)界掀起了一場軒然大波，一時(shí)間“克隆”成為各媒體乃至全社會(huì)熱烈討論的焦點(diǎn)。 什么是“克隆”呢? 簡而言之克隆就是無性繁殖系。克隆動(dòng)物是指不經(jīng)過生殖細(xì)胞而直接由體細(xì)胞獲得新的個(gè)體。研究人員對克隆的具體定義仍然存在爭議，這場爭論還會(huì)持續(xù)相當(dāng)長一段時(shí)間。多莉羊的誕生以克隆羊多莉的誕生為例，介紹通過轉(zhuǎn)核法從體細(xì)胞獲得新個(gè)體的過程。由于體細(xì)胞和受精卵一樣都含有全部的遺傳信息，因此，從體細(xì)胞獲得完整的動(dòng)物個(gè)體是完全可行的。但是由于動(dòng)物細(xì)胞高度分化，它是否仍然保持發(fā)育的全能性一直是學(xué)術(shù)界長期爭論不休的問題。為了證明分