DB33_T 2272-2020杭白菊脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程(高清正版）

1、ICS 65.020.20B 05DB33浙江省地方標準DB33/T 22722020杭白菊脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程Technical regulations for virus-free plantlets of Chrysanthemum morifolium2020 - 08 - 26 發(fā)布2020 - 09 - 26 實施浙江省市場監(jiān)督管理局 發(fā) 布DB33/T 22722020DB33/T 22722020 PAGE 13 PAGE 12前 言本標準依據(jù)GB/T 1.1-2009 給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標準由浙江省

2、農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標準由浙江省種植業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準起草單位：浙江大學(xué)、浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心、浙江省中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會、嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院桐鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。本標準主要起草人：毛碧增、顏克如、何伯偉、馬常念、謝禮、張亞惠、馮明慧、陸中華、繆悅嘯、朱衛(wèi)東、周建松、戴德江、沈子堯、劉輝輝、楊傳寶、何家浩。杭白菊脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程范圍本標準規(guī)定了杭白菊脫毒苗的定義、生產(chǎn)技術(shù)、分級與質(zhì)量要求、檢測方法和包裝、標志、運輸與貯存。本標準適用于不攜帶菊花 B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、煙草花葉病

3、毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y， PVY）等的脫毒組培瓶苗、脫毒原種苗及脫毒生產(chǎn)用苗。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 191 包裝儲運圖示標志GB/T 18862 地理標志產(chǎn)品 杭白菊NY/T 401 脫毒馬鈴薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程NY 525 有機肥料SN/T 2122-2015 進出境植物及植物產(chǎn)品檢

4、疫抽樣方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1杭白菊系菊科植物菊 (Chrysanthemum morifolium Ramat.) 產(chǎn)于浙江省的藥用栽培杭菊，以干燥頭狀花序入藥。3.2脫毒苗經(jīng)植物脫病毒方法獲得或引進，經(jīng)檢測后確認不攜帶本標準規(guī)定檢測病毒的種苗。3.2脫毒組培瓶苗通過植物脫病毒方法獲得的不攜帶本標準規(guī)定檢測病毒的組織培養(yǎng)瓶苗。3.3脫毒原種苗脫毒組培瓶苗移栽于無病原、蟲源的種苗圃內(nèi)存活的植株。3.4脫毒生產(chǎn)用苗由脫毒原種苗定植于無病原、蟲源的種苗圃內(nèi)通過扦插或壓條繁殖的植株。3.5脫毒率不攜帶本標準規(guī)定檢測病毒的植株數(shù)占所檢測植株總數(shù)的百分比。生產(chǎn)技術(shù)脫毒組培瓶苗外植

5、體選擇選擇品種特性純正、品質(zhì)優(yōu)良、豐產(chǎn)性能好、無病蟲害的植株。采樣最佳時間為10月11月晴天的10:0016:00，切取帶生長點的2 cm3 cm莖段。無菌苗繁育莖段經(jīng)無菌水清洗后置于超凈工作臺，切取帶生長點的莖段1 cm2 cm，用70%75%的乙醇沖洗表面1 min后，經(jīng)次氯酸鹽和Tween-20消毒8 min10 min，并不斷搖動，最后用無菌水沖洗5次8次，用無菌濾紙吸干水分，剝?nèi)?.3 mm0.5 mm的莖尖分生組織，接種于生長培養(yǎng)基中。脫毒苗培育無菌植株培養(yǎng)至1.5 cm2.0 cm時，置于解剖鏡下挑取0.3 mm0.5 mm的莖尖分生組織，接種于莖尖培養(yǎng)基中，植株長到3 cm6

6、cm時接種于生根培養(yǎng)基。脫毒苗快繁經(jīng)病毒檢測合格的試管苗，植株長至6 cm8 cm時，切取含有1個2個節(jié)間的莖段進行擴繁。接種到增殖培養(yǎng)基中，每20 d30 d繼代1次。繼代控制在4代6代。培養(yǎng)條件光照強度30 molm-2s-160 molm-2s-1，白天溫度252，晚上溫度182（黑暗培養(yǎng)）。每天照光12 h14 h。脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗脫毒原種苗生產(chǎn)基質(zhì)準備建議基質(zhì)栽培?；|(zhì)配比為泥炭:珍珠巖:蛭石=3:1:1（體積比）。定植方式打開脫毒瓶苗的瓶蓋，置于太陽光非直射處，常溫馴化 1 d2 d 后洗凈瓊脂，種植于苗床、營養(yǎng)缽或穴盤中，栽后澆透水，第 1 周用遮光率為 50%的遮陽網(wǎng)遮

7、蔭，并保持相對濕度 75%90%。宜使用防蟲網(wǎng)隔離。脫毒生產(chǎn)用苗繁殖苗床準備定植前施足基肥，每667 m2 （畝）施入有機肥200 kg300 kg，有機肥應(yīng)符合NY 525標準，高濃度三元復(fù)合肥15 kg。按畦寬1.2 m1.5 m，溝寬30 cm35 cm，溝深25 cm35 cm，整地作畦。繁殖方式生產(chǎn)用苗的繁殖可以采用扦插繁殖或壓條繁殖。扦插繁殖：脫毒原種苗株高30 cm以上時，用消毒刀具剪取帶有3個5個節(jié)的8 cm10 cm 莖段，莖段基部扦插于苗床、營養(yǎng)缽或穴盤，栽后澆透水，用遮光率為50%的遮陽網(wǎng)遮蔭，相對濕度保持75%90%，等莖段基部發(fā)出根，掀開遮陽網(wǎng)。壓條繁殖：苗床上的脫毒

8、原種苗株高40 cm50 cm時，用土塊進行“壓條”,將枝條平放于畦面，每隔20 cm25 cm用土塊壓住枝條，節(jié)間萌發(fā)不定根和不定芽。脫毒種苗繁育脫毒生產(chǎn)用苗，繁殖年限控制在3年4年。分級與質(zhì)量要求脫毒苗按繁育過程可分為脫毒組培瓶苗、脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗三類。脫毒組培瓶苗按質(zhì)量要求分為優(yōu)質(zhì)苗和合格苗。脫毒組培瓶苗、脫毒種苗的質(zhì)量等級指標、檢驗方法、檢驗規(guī)則參見附錄 A。抽樣與檢測方法抽樣脫毒組培瓶苗抽樣按 NY/T 401 規(guī)定執(zhí)行，脫毒原種苗和脫毒生產(chǎn)用苗的抽樣按 SN/T 2122-2015 中的 5.2 執(zhí)行。檢測方法病毒檢測方法參見附錄B。包裝、標志、運輸與貯存包裝組培瓶苗和脫毒

9、種苗宜用塑料箱或紙板箱包裝。標志包裝箱內(nèi)附脫毒苗出廠（圃）合格證，病毒檢測報告參見附錄C；外面應(yīng)注明標準號、生產(chǎn)單位的地址和聯(lián)系電話，其他按GB/T 191的規(guī)定執(zhí)行。運輸運輸過程中應(yīng)控溫控濕，溫度以1525為宜，相對濕度以60%90%為宜。貯存組培瓶苗常溫弱光照條件下可以貯存7 d10 d，脫毒種苗出圃后3 d內(nèi)定植。標準化生產(chǎn)模式圖杭白菊標準化生產(chǎn)模式圖參見附錄D。附 錄 A（資料性附錄）脫毒組培瓶苗、脫毒種苗的質(zhì)量要求、檢驗方法、檢驗規(guī)則質(zhì)量要求脫毒組培瓶苗質(zhì)量等級指標脫毒組培瓶苗質(zhì)量等級指標見表 A.1。表 A.1 脫毒組培瓶苗質(zhì)量等級指標項目指標優(yōu)質(zhì)苗合格苗株高，cm6.010.04

10、.06.0莖粗，mm3.01.03.0脫毒率，%100100外觀要求生長健壯、根系發(fā)達、無污染、無病斑脫毒種苗質(zhì)量等級指標脫毒種苗質(zhì)量等級指標見表 A.2。表 A.2 脫毒種苗質(zhì)量等級指標項目指標脫毒原種苗脫毒生產(chǎn)用苗脫毒率，%10095外觀要求種苗生長健壯、根系發(fā)達、無外源病害、莖粗 3 mm檢驗方法株高用分度值1 mm的直尺測量，莖粗用游標卡尺測量。檢驗規(guī)則組批規(guī)則同一時間，同一地點，取得同一品種不同單株的外植體經(jīng)過組織培養(yǎng)培育的脫毒苗為同一檢驗批次。檢驗分類出廠（圃）檢驗由廠家執(zhí)行檢驗組培瓶苗和脫毒種苗的株高和莖粗。并附有菊花脫毒苗出廠（圃）合格證。型式檢驗型式檢驗是對本標準所規(guī)定的全部

11、要求進行檢驗。在正常生產(chǎn)時，每年進行一次。新建廠家和改變工藝程序時也應(yīng)進行型式檢驗。判定原則檢驗結(jié)果全部符合本標準的，則判定該批次為合格種苗或優(yōu)質(zhì)苗。否則，則判定該批次種苗為不合格。附 錄 B（資料性附錄）杭白菊脫毒種苗規(guī)定檢測的病毒種類和檢測方法檢測病毒種類菊花 B 病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）、番茄不孕病毒（Tomato aspermy virus，TAV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和馬鈴薯 Y 病毒（Potato virus Y， PVY）。病毒檢測方

12、法采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(DAS-ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和電鏡觀察等方法檢測，在生產(chǎn)上只需采用其中一種。仲裁時采用聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)檢測法。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附(DAS-ELISA)檢測法檢測方法按NY/T 401-2000中附錄A的方法執(zhí)行。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 檢測法菊花B病毒菊花B病毒是單分體線形正義ssRNA病毒。取各編號植株的葉片，提取總RNA，利用寡聚胸腺嘧啶T 引物 oligo-dT 將 RNA 反 轉(zhuǎn) 錄 為 cDNA ， 用菊花 B 病 毒 的 特 異 引 物 （ 上 游 引 物 5 -ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3和下

13、游引物5-TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3）進行聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction, PCR）。PCR反應(yīng)條件如下：94 預(yù)變性5 min后進入循環(huán)：94 變性30 s，52 退火30 s，72 延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 延伸10 min，擴增得到650 bp的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用T4 DNA連接酶與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒測序，序列與CVB一致的為陽性。番茄不孕病毒番茄不孕病毒是三分體線形正義 ssRNA 病毒。取各編號植株的葉片，提取總 RNA，利用寡聚胸腺嘧啶 T

14、 引物 oligo-dT 將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA ，用番茄不孕病毒的特異引物（ 上游引物 5 -CCATCCCTTCAACATCCGAC-3和下游引物 5-GTTGAAGCGGAAGGAATACG-3）行 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件如下：94 預(yù)變性 5 min 后進入循環(huán)：94 變性 30 s，52 退火 30 s，72 延伸 1 min，35 個循環(huán)，最后 72 延伸 10 min，擴增得到 494 bp 的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用 T4 DNA 連接酶與 pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒測序，序列與 TAV 一致的為陽性。煙草花葉

15、病毒煙草花葉病毒是單分體線形正義 ssRNA 病毒。取各編號植株的葉片，提取總 RNA，利用寡聚胸腺嘧啶 T 引物 oligo-dT 將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA ， 用煙草花葉病毒的特異引物（ 上游引物5-ACTCCATCTCAGTTCGTGTTCTTG-3和下游引物 5-GAGCTCTCGAAAGAGCTCCGATTA-3）進行 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件如下：94 預(yù)變性 5 min 后進入循環(huán)：94 變性 40 s，50 退火 35 s，72 延伸 40 s， 30 個循環(huán)，最后 72 延伸 10 min，擴增得到 425 bp 的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用 T4 DNA 連

16、接酶與 pGEM-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒測序，序列與 TAV 一致的為陽性。黃瓜花葉病毒黃瓜花葉病毒是三分體線形正義 ssRNA 病毒。取各編號植株的葉片，提取總 RNA，利用寡聚胸腺嘧啶 T 引物 oligo-dT 將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA ， 用黃瓜花葉病毒的特異引物（ 上游引物5-GCCACCAAAAATAGACCG-3和下游引物 5-ATCTGCTGGCGTGGATTTCT-3）進行 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件如下：94 預(yù)變性 5 min，94 45 s，54 1 min，72 45 s，35 個循環(huán)，最后 72 延伸 10 min

17、，擴增得到 593 bp 的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用 T4 DNA 連接酶與 pGEM-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒測序，序列與 CMV 一致的為陽性。馬鈴薯 Y 病毒馬鈴薯 Y 病毒是單分體線形正義 ssRNA 病毒。取各編號植株的葉片，提取總 RNA，利用寡聚胸腺嘧啶 T 引物 oligo-dT 將 RNA 反轉(zhuǎn) 錄為 cDNA, 用 馬鈴 薯 Y 病毒 的特 異 引物 （ 上 游引 物5-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3和下游引物 5-TGG TGTTCGTGATGTGACCT-3）進行 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件如下：94 預(yù)變

18、性 5 min 后進入循環(huán)：94 變性 45 s，57 退火 45 s，72 延伸 30 s，35 個循環(huán)，最后 72 延伸 10 min，擴增得到 480 bp 的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，用 T4 DNA 連接酶與 pGEM-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，獲得重組質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒測序，序列與 PVY 一致的為陽性。電鏡檢測法檢測程序電鏡檢測法主要用于檢測菊花 B 病毒、番茄不孕病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒和馬鈴薯 Y 病毒。病葉浸蘸負染色法：用研缽將病葉組織充分研磨，組織汁液經(jīng)1%的磷鎢酸（pH值6.8）負染色，在透射電鏡下觀察病毒顆粒。病葉組織超薄切片法觀察：將病葉片切成

19、1 mm22 mm2小塊，用2.5%戊二醛及2%四氧化鋨固定，乙醇系列脫水，Epon 812環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，以2%醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察細胞內(nèi)病毒顆粒及細胞病理變化。病毒顆粒特征菊花 B 病毒屬于乙型線狀病毒科（Betaflexiviridae）、麝香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，病毒顆粒線狀，略彎曲的，直徑為12 nm15 nm，長度為610 nm700 nm，通常分散分布在寄主組織的細胞質(zhì)中，或以膜包裹的束狀或帶狀聚集體形式存在。番茄不孕病毒屬于雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）、黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus），病毒顆粒為等軸對稱

20、的二十面體，直徑約29 nm，負染可見一個直徑約12 nm的電子致密中心，呈“中心孔”樣結(jié)構(gòu)，主要分散在細胞質(zhì)和液泡中。煙草花葉病毒屬于植物桿狀病毒科（Virgaviridae）、煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒顆粒呈剛直的長桿狀，直徑約為18 nm，長度為300 nm310 nm，主要分布在感病植株細胞質(zhì)及液泡中。黃瓜花葉病毒屬于雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）、黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus），病毒顆粒為等軸對稱的二十面體，直徑約29 nm，負染可見一個直徑約12 nm的電子致密中心，呈“中心孔”樣結(jié)構(gòu)，主要分散在感病植株的細胞質(zhì)和液泡中。馬鈴薯Y病毒屬于馬

21、鈴薯Y病毒科（Potyviridae）、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），為彎曲線狀病毒顆粒，直徑11 nm13 nm，長度為680 nm900 nm，分布在感病植株的細胞質(zhì)內(nèi)，產(chǎn)生細胞質(zhì)柱狀內(nèi)含體。附 錄 C（資料性附錄）杭白菊脫毒苗出廠（圃）合格證、杭白菊脫毒苗病毒檢驗報告杭白菊脫毒苗出廠（圃）合格證菊花脫毒苗出廠（圃）合格證樣式見表 C.1。表 C.1 菊花脫毒苗出廠（圃）合格證編號：品種名稱等級原種采集地病毒檢測單位繁殖代數(shù)種苗數(shù)量購苗單位質(zhì)檢員生產(chǎn)單位出廠（圃）日期杭白菊脫毒苗病毒檢測報告菊花脫毒苗病毒檢測報告樣式見表 C.2。表 C.2 杭白菊脫毒苗病毒檢驗報告送樣單位：品種名

22、稱：原種采集地：送樣時間：原種數(shù)量：編號：編號菊花 B 病毒(CVB)番茄不孕病毒(TAV)煙草花葉病毒(TMV)黃瓜花葉病毒(CMV)馬鈴薯 Y 病毒(PVY)DGHILM12DB33/T 22722020附 錄 D（資料性附錄）杭白菊脫毒種苗標準化生產(chǎn)模式圖杭白菊脫毒種苗標準化生產(chǎn)模式圖見圖D.1。脫毒組培瓶苗脫毒原種苗脫毒生產(chǎn)用苗外植體采樣無菌苗繁育脫毒苗培育脫毒苗快繁選擇品種特性純正、品質(zhì)優(yōu)良、豐產(chǎn)性能好、無病蟲害的植株。采樣最佳時間為10月11月晴天的 10:00 16:00，切取帶生長點的2 cm 3 cm莖段。莖段經(jīng)無菌水清洗后置于超凈工作臺，切取帶生長點的莖段1 cm2 cm，用70%75%的乙醇沖洗表面1 min后，經(jīng)次氯酸鹽和Tween-20 消毒8 min 10 min，并不斷搖動，最后用無菌水沖洗5次8次，用無菌濾紙吸干水分，