國家自然基金面上項目：移植

1、（一）立項依據(jù)與研究內(nèi)容（4000-8000字）1.項目的立項依據(jù)（研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及分析，附主要參考文獻目錄。）（基礎(chǔ)研究需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢來論述科學(xué)意義；應(yīng)用研究需結(jié)合國民經(jīng)濟和社會發(fā)展中迫切解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。）目前，移植排斥反應(yīng)仍然是制約肝移植療效的主要原因。雖然由于免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超過了80%。但是終生服用免疫抑制劑不僅成為患者沉重的經(jīng)濟負擔(dān)，而且造成機體的免疫功能低下，可能促進肝炎及腫瘤復(fù)發(fā)，誘發(fā)感染、腫瘤等疾病。因此，找尋誘導(dǎo)特異性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反應(yīng)的最佳途徑。特異性移植耐受是指在無需使用免疫抑

2、制藥物的情況下，受者的免疫系統(tǒng)對同種異體或異種供體抗原長期不發(fā)生免疫反應(yīng)，而對其它抗原可發(fā)生正常免疫應(yīng)答的狀態(tài)。目前認為，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽視四類機制1。根據(jù)以上誘導(dǎo)免疫耐受的機制，學(xué)者們發(fā)展出許多誘導(dǎo)移植耐受的新方法2：(1)在胸腺內(nèi)直接注射表達供體抗原的細胞，在胸腺內(nèi)通過克隆清除誘導(dǎo)免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血細胞嵌合體誘導(dǎo)耐受。(3)阻斷T細胞活化的共刺激信號通路。(4)輸注供體樹突狀細胞(Dentritic cell，DC)誘導(dǎo)耐受。(5)針對T細胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體：抗T細胞及T細胞亞群的單抗；抗粘附分子或細胞因子的單抗。

3、(6)其它特異性免疫抑制的方法：合成肽阻斷TCR對同種異體抗原的識別；合成肽阻斷趨化因子及其受體。以上方法均不同程度地誘導(dǎo)了對供體抗原的耐受，但它們存在如下不足：(1)成年人胸腺已經(jīng)萎縮，無法在胸腺內(nèi)直接注射表達供體抗原的細胞，故該方法適用范圍大大受限。(2)供體骨髓移植能誘導(dǎo)部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發(fā)生率大大增加。(3)DC誘導(dǎo)的淋巴細胞失能狀態(tài)可通過給予外源性IL-2而逆轉(zhuǎn)；感染或其它因素引起機體強烈的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的IL-2等細胞因子也可以通過旁效應(yīng)解除失能的細胞克??；失能狀態(tài)的維持需要抗原的持續(xù)存

4、在，抗原的去除也能逆轉(zhuǎn)失能。(4)阻斷協(xié)同刺激通路、應(yīng)用針對T細胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體、合成肽阻斷TCR對同種異體抗原的識別、阻斷趨化因子及其受體等方法能誘導(dǎo)出確切的免疫抑制，但是其作用范圍是全身性的、非特異性的，且一旦中止阻斷劑的供給，則移植耐受消失?？傊?， 目前誘導(dǎo)移植耐受的方法存在非特異性、容易逆轉(zhuǎn)、實際操作困難等缺陷。肝移植排斥反應(yīng)啟動時，首先表現(xiàn)為淋巴細胞對匯管區(qū)中央靜脈周圍的浸潤，隨著排斥反應(yīng)的進展，淋巴細胞的損傷導(dǎo)致小葉間膽管上皮細胞、中央靜脈內(nèi)皮細胞的炎癥，最后波及匯管區(qū)周圍的肝實質(zhì)細胞，造成廣泛的肝臟炎性反應(yīng)。因此肝移植排斥反應(yīng)的過程是從匯管區(qū)啟動，進而擴展至小葉間

5、膽管上皮細胞、中央靜脈內(nèi)皮細胞、匯管區(qū)周圍的肝實質(zhì)細胞。移植排斥反應(yīng)發(fā)生時，CTL細胞在活化后可以通過以下兩條途徑殺傷靶細胞：(1)穿孔素/顆粒酶途徑。(2)Fas/FasL途徑：在CTL細胞識別靶細胞后，細胞表面表達的高水平FasL與靶細胞表面的Fas相互識別，通過Fas觸發(fā)靶細胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細胞發(fā)生程序性死亡。體外實驗證實兩條途徑相互獨立。然而體內(nèi)實驗證實單一阻斷Fas/FasL途徑即可抑制CTL對靶細胞的殺傷，其原因可能與體內(nèi)環(huán)境有關(guān)28. 誘騙受體3(Decoy receptor 3，DcR3)是一種新發(fā)現(xiàn)的可結(jié)合FasL的可溶性TNFR超家庭成員，RNA印跡表明DcR3 mR

6、NA 表達于胎肺、腦、肝及成人脾、結(jié)腸和肺，特別是在肺癌和結(jié)腸癌細胞系的表達很高，也可由T細胞絲裂原激活的外周血單核細胞分泌。DcR3 分子質(zhì)量為35kDa，肽鏈長300個氨基酸殘基。DcR3 的配體是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)與Fas競爭性結(jié)合FasL，阻斷FasL所誘導(dǎo)的細胞凋亡，這一作用可以減弱CTL和NK細胞對靶細胞的殺傷14。(2)通過抑制LIGHT與HveA 或TR2之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、TL1A至DcR3的單向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制T細胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基質(zhì)細胞來源的因子1(SDF-1) 、FasL對T細胞的趨化作用，從而減少CD4+和CD8+T

7、細胞對腫瘤的浸潤。25. 27(4)通過調(diào)節(jié)DC分化和成熟從而抑制CD4+ T細胞增生。20(5)抑制T細胞偽足形成，阻止它們形成不可分離的細胞簇從而調(diào)節(jié)T細胞與其它細胞如APC的相互作用。7因此根據(jù)其作用機理，人們推測其可能有以下四方面的作用(1)腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）誘導(dǎo)移植耐受。目前的研究工作已經(jīng)肯定DcR3基因?qū)δ[瘤細胞逃避免疫監(jiān)視、抑制炎癥反應(yīng)的作用，但DcR3基因的高表達與細胞癌變無相關(guān)性，不是癌基因。Wu等證實DcR3減少了FasL、IFN-誘導(dǎo)的胰島細胞凋亡及胰島素釋放，可防止同種異基因胰島移植時的胰島原發(fā)性無功能。2Zhang等于心臟移植

8、術(shù)前一天開始連續(xù)7天靜脈注射DcR3，小鼠心臟存活時間比對照組延長3.3天，提示DcR3可以減弱T細胞對同種異體抗原的反應(yīng)。24我們利用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV HelperFree System, Stratagene 公司）作為DcR3基因的載體，將AAV病毒顆粒從門靜脈、肝動脈、膽管注入冷保存時的供肝，成功實現(xiàn)了DcR3基因在供肝的表達，在沒有使用免疫抑制劑的情況下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，繼續(xù)觀察中），而對照組僅存活了15天（見研究工作基礎(chǔ)）。AAV HelperFree System的特點有：病毒載體產(chǎn)生、效價滴定階段

9、均不需野生型腺病毒共感染，因此有極高的生物安全性、宿主的免疫反應(yīng)極??；AAV可感染的細胞類型廣泛，感染不依賴于活躍的細胞分裂；AAV病毒滴度高，常規(guī)可達107病毒顆粒/ml，經(jīng)濃縮可達1012病毒顆粒/ml；AAV在允許復(fù)制的條件下可在染色體外復(fù)制，在不能復(fù)制的條件下可以5-10%的效率定點整合入宿主19號染色體的一個2-4kb的區(qū)域，因此AAV被證明有應(yīng)用于基因長期表達的價值。我們目前的研究工作的特色有：（1）證明了腺相關(guān)病毒攜帶的DcR3基因可以誘導(dǎo)肝移植耐受。(2)采用AAV HelperFree System克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、隨機整合入受者染色體中而致腫瘤的危險的缺點1以

10、及腺病毒載體雖然有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率,但因不能在染色體外復(fù)制或整合入受者染色體中,目的基因只能一過性表達的缺點2。我們目前研究工作的缺陷有：（1）DcR3基因僅在肝臟血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞表達，而急性排斥反應(yīng)啟動時CTL細胞首先浸潤的是匯管區(qū)的中央靜脈周圍，因此它尚不能阻止急性排斥反應(yīng)的啟動，僅能阻止CTL細胞血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞的攻擊。（2）DcR3基因轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞是成熟的細胞。雖然攜帶DcR3基因的AAV可在染色體外復(fù)制或整合入宿主基因組而使DcR3基因存在長期表達的可能，但是成熟細胞存在新老交替，DcR3基因的表達隨著細胞的死亡而消失。因此為了完善我們目前的研究工

11、作，我們需要作以下的改進：（1）將DcR3基因的表達定位于匯管區(qū)中央靜脈周圍，抑制排斥反應(yīng)的啟動。如能進一步將DcR3基因表達于血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞，則更能防止個別活化的CTL細胞對它們的攻擊，從而形成抑制排斥反應(yīng)的“雙保險”。（2）實現(xiàn)DcR3基因的持續(xù)表達。肝干細胞（Hepatic Stem Cell，HSC）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝細胞與膽管細胞潛能的原始細胞。最近有人證實它尚可分化為血管內(nèi)皮細胞(Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-

12、derived cells. Lancet. 2001 Mar 24;357(9260):932-3.) 11。肝干細胞的基本特征可概括為兩點：具有多向分化能力，可向肝細胞、膽管上皮細胞、肝臟血管內(nèi)皮細胞分化。具有自我更新與自我維持能力，對肝臟損傷或疾病產(chǎn)生反應(yīng)并進行修復(fù)。其形態(tài)特點是細胞體積小、核大而胞質(zhì)少、呈卵圓形、具有特殊的表面標志如AFP、肝細胞標志（白蛋白）、膽管上皮細胞標志（CK7、CK19）以及肝細胞、膽管上皮細胞共有的標志(CK8、CK18)。目前有人證實其尚有血管內(nèi)皮細胞的標志。該類細胞不僅在胚胎肝組織中存在，而且在成年肝組織中也存在。肝內(nèi)的肝干細胞稱為卵圓細胞(Hepati

13、c Oval Cell，HOC)或小肝細胞。它們在正常情況下位于肝臟匯管區(qū)的Hering小管D，當(dāng)肝臟受到損傷（肝毒性藥物、手術(shù)、創(chuàng)傷、缺血再灌注等）時，它們迅速增生分化，補充受損的肝細胞、膽管上皮細胞、肝臟血管內(nèi)皮細胞分化，因而被稱為肝干細胞池A。目前大量文獻證實，肝臟損傷時，肝臟有三個水平的細胞修復(fù)：肝細胞、Hering 小管的雙向干細胞、Hering小管周圍的來自骨髓的肝干細胞。骨髓來源的干細胞可定居于Hering小管周圍，在肝臟損傷時發(fā)揮修復(fù)作用K。Theise ND等通過三維觀測得出Hering 小管、匯管區(qū)周圍是肝干細胞存在的場所的結(jié)論G。Petersen 證實肝內(nèi)存在骨髓來源的干

14、細胞，Theise 大鼠2%，人4-40%。Alison0.5-2%(hsc8,78,79)。Lagasse 30%.認為Hering管可能是人肝干細胞起源分化及滯留場所(TheiseND,SaxenaR,PortmannBC,etal.ThecanalsofheringandhepaticstemcellsinhumansJ.Hepa-tology,1999,30:1425-1433.)肝干細胞的肝外來源包括胰腺的上皮細胞、胰島前體細胞、骨髓造血干細胞3,4。自1999年P(guān)etersen等發(fā)現(xiàn)肝卵圓細胞可來源于骨髓后,從骨髓細胞中鑒定肝干細胞成為近年研究的熱點。目前研究證實從骨髓中分離純化的

15、造血干細胞的多個亞群在一定的微環(huán)境或細胞因子的誘導(dǎo)下可分化為肝干細胞B。目前,在骨髓中已發(fā)現(xiàn)多種細胞亞群具有分化為肝細胞的潛能,如KTLS細胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)H、2-m-Thy-1+細胞12、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成體前體細胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)I及C1qRp+細胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)J等。這些細胞均涉及多個不同的表面標志,可能代表著骨髓干細胞的不同發(fā)育階段或譜系中的不同分支。這些細胞因子肯定存在于細胞的微環(huán)境中，包括細胞外基質(zhì)中參與粘附過程的

16、信號分子以及參與正常細胞發(fā)育、分化、成熟的細胞因子B E。Petersen 等L、Theise等M,N和Alison等O的研究相繼指出,骨髓干細胞或造血干細胞能夠在鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)化成為肝卵圓細胞甚至成熟的肝細胞和膽管細胞,并同時證明這種現(xiàn)象也存在于人類體內(nèi)。用高濃度的肝細胞生長因子(HGF)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓細胞,RT-PCR檢測到白蛋白及AFP的表達,免疫細胞化學(xué)也證實了經(jīng)誘導(dǎo)的細胞出現(xiàn)了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前體細胞的特征性表達。應(yīng)用磁株細胞篩選法分離人或大鼠骨髓細胞中的2m-Thy-1+細胞,能夠表達肝細胞的特征P。這些骨髓來源的肝干細胞(BDHSC)肝內(nèi)移植后很快就整合入肝板,

17、并且分化為成熟的肝細胞,而在體外培養(yǎng)的過程中加入膽汁化血清可促進它們向肝細胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分離出骨髓干細胞的多個亞群，并證明大鼠骨髓內(nèi)2微球蛋白陰性(2 m- ) 細胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)后呈多角形細胞表現(xiàn), 白蛋白、AFP、 CK8 / 1 8表達陽性，其他干細胞類型未見類似變化。提示該亞群骨髓干細胞有向肝干細胞分化的能力。我們參照他們介紹的方法成功分離了1.5105數(shù)量級的肝干細胞純度為95%，培養(yǎng)7天后可達2106數(shù)量級。經(jīng)免疫組化染色證明其有肝細胞、膽管上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的特異性標志，因此推測其可能分化為以上3種細胞（見研究工作基礎(chǔ)）。這些研究結(jié)果都說明骨髓細胞中存在

18、有能分化為肝細胞的干細胞群。肝臟基因治療的一大難題是被用作基因修飾的成熟肝細胞在體外不易擴增和傳代，肝干細胞具有強大的增殖能力，即使經(jīng)過基因修飾仍有可能傳代，這為克服目前基因治療中的主要問題開辟了新的途徑。以肝干細胞作為載體具有一次性介入，永久性治療的特點，且永生化的肝干細胞無致癌的危險性F?；谝陨涎芯砍晒?，我們設(shè)想利用肝干細胞在肝臟匯管區(qū)中央靜脈周圍的靶向定植并在必要時分化補充受損或衰老的血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞的生物學(xué)特性，以腺相關(guān)病毒為載體將DcR3基因轉(zhuǎn)入從雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分離純化的肝干細胞，將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時

19、將轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟。DcR3基因隨著肝干細胞的定植主要在匯管區(qū)持續(xù)表達，必要時部分隨著肝干細胞的進一步分化而表達在血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞、肝細胞，從而在啟動（主要）、攻擊（次要）兩個環(huán)節(jié)抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生。DcR3基因強大的免疫抑制作用被局限在肝臟之中，從而誘導(dǎo)出特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。參考文獻1. Arnold B. Levels of peripheral T cell tolerance. Transplantation Immunology. 2002,10(2-3):109-1142. Goddard S, Adams DH. New app

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31、4根據(jù)Y染色體及AAV病毒載體自帶的綠色熒光蛋白（GFP）標志確定轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的定植、分布情況。2.1.5檢測轉(zhuǎn)入肝干細胞的DcR3基因在供肝中的表達情況。2.1.6觀測肝移植術(shù)后移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。2.2研究目標：本課題擬構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒，將其轉(zhuǎn)染雄性近交系Wistar大鼠骨髓來源的肝干細胞；將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時將轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟；使DcR3基因在供肝中長期表達，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。探討：(1)轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的定植、分布情況。(2)轉(zhuǎn)入肝干細胞的DcR3基因在

32、供肝中的表達情況。(3)轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝中的分布及其基因表達與移植耐受的關(guān)系。2.3擬解決的關(guān)鍵問題2.3.1腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染肝干細胞的效率：干細胞的基因轉(zhuǎn)染難度較大，是本課題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本課題成員（刪去）于2001年用腺病毒成功感染了神經(jīng)干細胞，成功率約 80%90%，且經(jīng)傳代培養(yǎng) 12代后仍具干細胞特性。腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率高于腺病毒，轉(zhuǎn)染的細胞類型較腺病毒更廣泛。因此本課題組有能力完成腺相關(guān)病毒對肝干細胞的轉(zhuǎn)染。2.3.2轉(zhuǎn)基因肝干細胞在供肝匯管區(qū)中定植的數(shù)量：肝干細胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量與肝臟受到的損傷程度有關(guān)。損傷越重，肝干細胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量越多，反之亦然。肝移植時肝臟缺血再灌

33、注對肝臟已是一種損傷，為了進一步提高肝干細胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量，可在冷保存時切除大鼠肝臟的一葉，然后完成肝移植。3.擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）3.1研究方案3.1.1 DcR3基因的克隆，參照Pitti RM等介紹的方法進行。3.1.2構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒載體，并用其感染AAV293細胞進行體外表達鑒定、收集AAV病毒顆粒備用。3.1.3從雄性近交系Wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離肝干細胞并進行純化、鑒定，參照Itzhak Avital等介紹的方法進行。3.1.4腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染肝干細胞，采用直接感染方法。3.1.5

34、體外試驗：表達DcR3基因的肝干細胞抑制FasL誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡試驗；表達DcR3基因的肝干細胞抑制FasL誘導(dǎo)的淋巴細胞趨化試驗3.1.6動物實驗：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成時將轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細胞經(jīng)門靜脈注入肝臟；分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標本，采用常規(guī)生化法檢測肝功能，Northern blot、Western blot檢測DcR3基因在肝臟中的表達情況，免疫組化法檢測受體CD4+、CD8+淋巴細胞在供肝中的浸潤情況，TUNEL法檢測供肝中細胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片HE染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。3.2技術(shù)路線構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒載

35、體載體體外表達鑒定、收集AAV病毒顆粒轉(zhuǎn)染從雄性近交系Wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離、純化HSC體外試驗：表達DcR3基因的肝干細胞抑制FasL誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡試驗、抑制FasL誘導(dǎo)的淋巴細胞趨化試驗植入雌性近交系Lewis大鼠 動物實驗：分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標本，采用常規(guī)生化法檢測肝功能，Northern blot、Western blot檢測DcR3基因在肝臟中的表達情況，免疫組化法檢測受體CD4+、CD8+淋巴細胞在供肝中的浸潤情況，TUNEL法檢測供肝中細胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片HE染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況切取雌性近交系Wistar大鼠 肝臟經(jīng)門靜脈注入供肝3.3可行性分析3.3.1理論上，骨髓來源的肝干細胞