PCR技術(shù)原理及其應(yīng)用課件

1、PCR技術(shù)原理及PCR儀的應(yīng)用1 PCR技術(shù)原理2 PCR儀的技術(shù)應(yīng)用第一節(jié) PCR技術(shù)原理一、 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PC

2、R能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀一、 PCR技術(shù)簡(jiǎn)史Kary B. Mullis 1989年美國(guó)Science雜志列PCR 為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。二、PCR的基本原理DNA的復(fù)制又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)變成兩條單鏈DNA二、PCR的基本原理DNA的復(fù)制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5

3、3TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCGAUCGCG引物酶引物酶RNA引物RNA引物二、PCR的基本原理DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶二、PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制DNA的復(fù)制又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈將反應(yīng)混合物

4、冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。降溫升溫PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意圖模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered

5、(Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的堿基序列配對(duì)結(jié)合；PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarge

6、t SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（各種核苷酸）為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的DNA 鏈。End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因放大幾百萬倍。729455PCR循環(huán)No. ofNo. Amplicon CyclesC

7、opies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon高效的DNA分析技術(shù)PCR儀三、普通PCR反應(yīng)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）普通PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的

8、DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,

9、741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)溫度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20普通PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一

10、般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體積：50100l10X緩沖液 10 L4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5UMg2+ 1.5mmol/L普通PCR反應(yīng)（一）普通PCR反應(yīng)成分（1）模板 單、雙鏈DNA均可（cDNA，逆轉(zhuǎn)錄而來，自行得到)。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100L。 模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。（2）引物濃度 0.1-0.5 mol/L 濃度過低

11、影響產(chǎn)量，偏高引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物增加，且可增加引物二聚體的產(chǎn)生幾率。直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)。 如：/cgi-bin/SGD/web-primer; /引物設(shè)計(jì)軟件，其中以“Oligo 6”和“ Premier5.0”最為優(yōu)秀。首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同。（一）引物設(shè)計(jì)的方法PCR引物的設(shè)計(jì)（二）一般原則引物長(zhǎng)度在1530堿基。引物過短，會(huì)使特異性降低。過長(zhǎng)會(huì)提高相應(yīng)的退火溫度，且合成引物的成本增加。引物中堿基的分布是隨機(jī)的，避免4個(gè)以上的嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C含量宜在 4555左右。PCR引物的設(shè)計(jì)避免兩引物間的互補(bǔ)，特別是3端

12、互補(bǔ)，以免形成二聚體。引物自身不應(yīng)存在連續(xù)超過3bp的互補(bǔ)序列， 否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身變性。 引物的3端不能有任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，可根據(jù)產(chǎn)物的要求不同， 可以選用不同的引物修飾法。引物與非擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過70。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（4）dNTP (四種核苷酸，提供堿基） 20200mol/L dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過低則

13、降低反應(yīng)產(chǎn)量，但特異性增加 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。 1050mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72 時(shí)pH 7.2,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50 mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會(huì)抑制TaqDNA聚合

14、酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（6） PCR反應(yīng)的緩沖液（二）普通PCR的循環(huán)參數(shù)：（1）變性 94oC95oC，30-60 s 且最初在加Taq酶之前先于97oC充分變性510min（2）退火 50oC55oC，60-90 s 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸 70oC74oC，60-120 s 延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次 次數(shù)過多：非特異擴(kuò)增增加。最后，在72保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4保存產(chǎn)物。上述參數(shù)均在PCR儀上進(jìn)行設(shè)置 （三）PCR產(chǎn)物

15、 在PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過程遵循酶的催化動(dòng)力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。到達(dá)平臺(tái)期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺(tái)期在PCR反應(yīng)中不可避免。 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖30個(gè)循環(huán)最適宜 （四）普通PCR的產(chǎn)物的檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳 是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定最常用的方法。其分辨率很高，可測(cè)出1ng DNA

16、。一般800bp以上的片段用0.8%的膠，800bp以下的片段用1.0%2.0%的膠。PCR 產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳,凝膠分析成像系統(tǒng)照相掃描并進(jìn)行密度分析（如圖所示）。 為了確定PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計(jì)的目的片段，或產(chǎn)物是否有突變，都需做分子雜交檢測(cè)。分子雜交包括點(diǎn)雜交和Southern印跡雜交。點(diǎn)雜交靈敏度較高，特別適用于特異性不高的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析。 Southern印跡雜交可鑒定PCR產(chǎn)物的大小和特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)10ng。基本過程是PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。分子雜交（五）普通PCR反應(yīng)中應(yīng)注意的事項(xiàng)（一）防止污染

17、試劑小量分裝吸頭及Ep管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對(duì)照：陽性對(duì)照：陽性模板陰性對(duì)照：陰性模板試劑對(duì)照：除模板外的所有組分（六）普通PCR反應(yīng)中常見問題無擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增拖尾假陽性（七）普通PCR反應(yīng)缺點(diǎn)a.只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析，無法對(duì)起始模版準(zhǔn)確定量b.必須在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，費(fèi)時(shí)費(fèi)事c.無法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)d.EB(核酸染料，在電泳時(shí)使用）有毒real-time PCR， FQ-PCR，美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在普通PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與普通PCR相比，實(shí)

18、時(shí)定量PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值（循環(huán)數(shù)）和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板進(jìn)的定量分析。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，探針的5端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)FAM（熒光發(fā)射峰值在518nm處），靠近3端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA（熒光發(fā)射峰值在582nm處）。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí)Taq酶的5-3外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就

19、有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理和方法熒光發(fā)射基團(tuán)熒光淬滅基團(tuán)Taq酶每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)與基因拷貝數(shù)成正比IQ5 Real-time PCR儀循環(huán)數(shù)，ct值熒光強(qiáng)度 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖 實(shí)時(shí)熒光定量PCR三個(gè)關(guān)鍵詞： 實(shí)時(shí)，熒光，定量 如何實(shí)時(shí)檢測(cè)？ 借助熒光物質(zhì)示蹤擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化 如何對(duì)起始模板定量？ 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板的定量分析 引入兩個(gè)概念： 熒光閾值、Ct值熒光閾值在熒光擴(kuò)

20、增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))閾值線熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，默認(rèn)設(shè)置一般是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合擴(kuò)增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮 Ct值的概念Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號(hào)）到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-閾值線濃度低濃度高模板起始濃度越高，Ct值越小CT值與模板起始濃度的關(guān)系哪個(gè)樣品濃度高？普通PCR終點(diǎn)處檢測(cè)產(chǎn)物量不恒定；Real-time PCR利用Ct的概念，在指數(shù)擴(kuò)增的開始階段進(jìn)行檢

21、測(cè)，此時(shí)樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。 定量原理 理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0(1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質(zhì)（二）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系 SYBR Green 1染料 TaqMan探針熒光化學(xué)SYBR Green 1（綠色熒光染料）（三）SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)

22、出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAExtension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllA 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA溶液按101，102，103，104，105進(jìn)行梯度稀釋，以不同稀釋度的cDNA為模

23、板擴(kuò)增目的基因和看家基因，以相對(duì)起始濃度和Ct值（循環(huán)閾值）為X、Y軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。B 配制反應(yīng)體系SYBR Premix Ex TaqTM（2）12.5 lPCR Forward Primer（10 M）0.5 lPCR Reverse Primer（10 M）0.5 l模板2 ldH2O2（滅菌蒸餾水）9.5 l以檢測(cè)c-fos基因?yàn)槔?引物：c-fos-forward 5-TGATACACTCCAAGCGGAGAC-3c-fos-reverse 5-CCCAGTCTGCTGCATAGAAGG-3GAPDH-forward 5-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3GAPDH-r

24、everse 5-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3循環(huán)參數(shù)：95 10s 預(yù)變性，然后94 40s，60 40s，72 40s 共60個(gè)循環(huán)。c-fos real-time PCR 擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線融解曲線SYBR Green 1這種非特異性結(jié)合 dsDNA 的染料，也可能和反應(yīng)中的引物二聚體非特異性結(jié)合，而釋放熒光信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致儀器檢測(cè)的信號(hào)不僅僅是目的基因的，所以需要在反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定一個(gè)升溫過程，然后慢慢把溫度降下來，因?yàn)椴煌珼NA片段的解鏈溫度不同，這時(shí)若PCR產(chǎn)物純，則只會(huì)出現(xiàn)一個(gè)熒光峰，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)溫度值，若有雜質(zhì)，則會(huì)出現(xiàn)其他峰值，這是一個(gè)特異性檢測(cè)方法。融解曲線參數(shù)(d

25、sDNA的解鏈溫度Tm值）：72-95, 第一步持續(xù)時(shí)間為45s, 接下來每步持續(xù)時(shí)間為5s。評(píng)價(jià)產(chǎn)物是否純?cè)趒PCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，系統(tǒng)會(huì)進(jìn)行測(cè)定融解曲線，通常的方式就是從70度加熱到90度，然后每隔一定時(shí)間（1s或者少于1s）測(cè)定系統(tǒng)熒光強(qiáng)度，隨著溫度的升高，dsDNA都解開雙鏈，SYBRGreen都游離之后不發(fā)熒光，熒光逐漸下降。那么畫出來一個(gè)個(gè)熒光強(qiáng)度和溫度的曲線融解曲線c-fos real-time PCR 隨著溫度上升，達(dá)到圖中Tm點(diǎn)時(shí)，大部分?jǐn)U增出來的雙鏈DNA解開，熒光值下降非?？?。如果qPCR產(chǎn)物非常特異那么，融解曲線在80-90之間會(huì)形成一個(gè)單峰(溫度和qPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度以

26、及GC含量相關(guān)）溫度dR/dT熒光強(qiáng)度對(duì)溫度求導(dǎo)評(píng)價(jià)產(chǎn)物特異性： 使用融解曲線分析（ Melt Curve Analysis） 評(píng)價(jià)引物對(duì)擴(kuò)增效率： 將模板進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行絕對(duì)定量： 使用擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 使用方便 - 不必設(shè)計(jì)復(fù)雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏（四）SYBR Green I優(yōu)點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合無法實(shí)現(xiàn)多個(gè)目的基因的檢測(cè)（五）SYBR Green I缺點(diǎn)TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan（六）TaqMan探針的工作原理TaqMan水解型、具有目標(biāo)特異性的探針 5為熒光素， 3為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標(biāo)序列互補(bǔ)5533d.NTPsT

27、hermal Stable DNA PolymerasePrimers5353535353535353Add Master Mix and SampleDenaturation（變性）535353535353Annealing（退火）Reaction TubeTaql53RQProbe53RQTaqMan工作原理535353RQExtension Step531. Strand DisplacementTaq5533QTaqR52. Cleavage3. PolymerizationComplete53QTaqR354. Detection533QTaqR5lTaqMan工作原理R3Q 對(duì)目標(biāo)

28、序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè) 設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單（七）TaqMan探針優(yōu)點(diǎn) 價(jià)格較高 只適合于一個(gè)特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 背景高（八）TaqMan探針缺點(diǎn) （九）熒光探針設(shè)計(jì)遵循原則探針長(zhǎng)度應(yīng)在2040個(gè)堿基左右，保證結(jié)合特異性。GC堿基含量在40%60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。避免與引物發(fā)生雜交或重疊。探針與模板結(jié)合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值（ DNA熔解溫度）要比引物的Tm值至少高出5。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。 FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針

29、的應(yīng)用，可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。FQ-PCR只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了普通PCR操作中的諸多弊端。五、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特點(diǎn)六、PCR技術(shù)應(yīng)用研究基因克隆，DNA測(cè)序，分析突變?cè)\斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測(cè)其他 1 病原體測(cè)定由于PCR技術(shù)的問世，使得病原體檢測(cè)能夠快速而方便的進(jìn)行。但由于其高靈敏性，實(shí)驗(yàn)操作很容易受到污染而出

30、現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴(kuò)增即可為陽性結(jié)果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義，因此結(jié)模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而PE公司研制的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問題提供了可能。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測(cè)研究。 Morris等用FQ-PCR對(duì)黑猩猩丙型肝炎動(dòng)物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進(jìn)行了研究。FQ-PCR技術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的同時(shí)又能提高效率，因此可作為一種檢測(cè)HCV的有效方法。同時(shí)，由于FQ-PCR可以測(cè)出血清中病原體濃度，故可

31、給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。以前常規(guī)檢測(cè)大腸桿菌的方法，都因?yàn)榉爆?，需要大量的PCR后處理過程及不能對(duì)標(biāo)本定量而受到限制。美國(guó)Witham等1996年將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測(cè)研究。針對(duì)不同血清變異型的大腸桿菌，他們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用不同的探針，從而提高了實(shí)驗(yàn)特異性。 2. 腫瘤研究意大利Gelmini等用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以-肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閰⒄仗剿髯罴褜?shí)驗(yàn)條件，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在2831之間時(shí)，RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們?cè)诖藯l件下擴(kuò)增了c-erbB-2基因和-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但是各個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度下二者的RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Southern印跡結(jié)果和已報(bào)告的競(jìng)爭(zhēng)性PCR結(jié)果比較都顯示高度相關(guān)性（n=25，r=0.94，P0.01）。 3. 基因表達(dá)研究由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，對(duì)mRNA的檢測(cè)顯得較以前常用的方