蛋白組學分析技術

1、第二章: 蛋白質(zhì)的電泳分離技術(jsh)蛋白組學分析(fnx)技術課程之生命科學學院發(fā)育生物學教研室姓名：藍 興 國 日期：2014.06. 1共二十七頁2共二十七頁圖像(t xin)分析圖像(t xin)獲取蛋白質(zhì)斑點切取基于凝膠的工作流程SDS蛋白分離及鑒定的工作流程樣品制備等電聚焦MALDI點靶MS鑒定3共二十七頁2.1 蛋白樣品的提取 2.2 雙向凝膠電泳技術的原理2.3 等電聚焦的原理2.4 SDS的原理2.5 樣品分離(fnl)的策略2. 雙向凝膠電泳技術(jsh)4共二十七頁2.1 蛋白樣品(yngpn)的提取（植物） TCA丙酮(bn tn)的方法 酚結(jié)合乙酸銨的方法5共二十七

2、頁6共二十七頁第一(dy)向:根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點分離第二向:SDS 聚丙烯酰胺電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量分離一塊(y kui)雙向電泳膠上可以分離幾千個蛋白點2.2 雙向凝膠電泳的原理7共二十七頁等電聚焦技術是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點（pI）的不同而將他們分離的一種電泳技術。蛋白質(zhì)分子的帶電量取決于組成蛋白質(zhì)的氨基(nj)酸的側(cè)鏈及氨基(nj)端和羧基端所有電荷總合。圖1 蛋白質(zhì)所在pH環(huán)境與帶電的關系2.3 等電聚焦(jjio)電泳8共二十七頁2.3.1 等電聚焦(jjio)電泳圖2 蛋白質(zhì)的凈電荷與相對環(huán)境pH 值關系的曲線圖9共二十七頁丙烯酰胺緩沖液: Immobiline buffer, 化學上

3、確定的丙烯酰胺衍生物, 共同結(jié)構(gòu): CH2=CH-CO-NH-R,R ：弱酸性或弱堿性(jin xn)緩沖基團2.3.2 固相pH梯度(t d)（Immobilized pH gradients, IPG）兩種形式：一種是含丙稀酰胺緩沖液的相對酸性的混合物，另一種含相對堿性緩沖液的混合物。不同濃度配比的酸性和堿性緩沖液決定pH梯度的范圍。10共二十七頁采用(ciyng)Immobiline DryStrip凝膠進行第一向電泳分離。2.3.3 Immobiline DryStrip 凝膠11共二十七頁2.3.3 Immobiline DryStrip 凝膠12共二十七頁linear (L)non

4、linear (NL)2.3.3 Immobiline DryStrip 凝膠13共二十七頁from Prof. Angelika Grg, Technical University Munich小鼠肝臟蛋白(dnbi)的分離：IPG 3-10linear (L)nonlinear (NL)14共二十七頁標準型單根膠條槽采用氧化鋁陶瓷質(zhì)地的膠條槽、可以保證充分(chngfn)的散熱和電場分離效果；膠條槽平整度好，長期使用不會變形，確保膠條泡漲厚度均勻。Manifold多功能膠條盤 適合高通量7-24cm任意長度的IPG 膠條的等電聚焦和后續(xù)的平衡反應； 膠條槽表面有疏水涂層，有效防止蛋白黏附到

5、膠條槽內(nèi)壁上，避免(bmin)樣品交叉污染。2.3.4 膠條槽的選擇共二十七頁2.3.5 Ettan IPGphor 3 第一向等電聚焦(jjio)系統(tǒng)內(nèi)置電源 電壓(diny)：0 - 10000 V, 電流：0 - 2.4 mA, 功率：最大12 W 同時運行112根IPG膠條16共二十七頁2.3.6 IPG膠條的平衡(pnghng) 在IPG膠條等電聚焦之后，需要進行IPG膠條的平衡(pnghng)，使蛋白質(zhì)被SDS充分飽和。試劑目的IPG膠條平衡SDSDTT碘乙酰胺與蛋白質(zhì)結(jié)合破壞二硫鍵除去多余的DTT，烷基化巰基基團第一步，15min，緩沖液中含DTT第二步，15min，緩沖液中含碘

6、乙酰胺（不含DTT）17共二十七頁2.4 SDS 瓊脂糖覆蓋(fgi)密封 放置(fngzh) IPG strip18共二十七頁2.4 SDS的原理(yunl) SDS是一種陰離子表面活性劑，當它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異(chy)。 SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，如巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。這樣，蛋白質(zhì)SDS復合物在水溶液中的形狀，近似于長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復合物的短軸長度都一

7、樣，而長軸則隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小成正比的變化。 蛋白質(zhì)-SDS復合物在凝膠中遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的相關。19共二十七頁Ettan DALTsix 第二向電泳(din yn)系統(tǒng)20共二十七頁Ettan DALTtwelve 第二(d r)向電泳系統(tǒng)21共二十七頁問題1: 對于(duy)一個新的組織樣品，該如何進行IPG膠條選擇？問題2: 對于低豐度的蛋白，該如何進行樣品(yngpn)分離？2.5 樣品分離的策略22共二十七頁問題1: 對于一個新的組織樣品，該如何(rh)進行IPG膠條選擇？ 蛋白質(zhì)主要分布在兩個區(qū)域，一部分為pI為4-6.5的

8、蛋白質(zhì)，另一部分為pI在8-12的蛋白質(zhì)。 大多數(shù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量小于100kDa。 采用寬范圍的IPG膠條進行(jnxng)分離，然后進一步用較窄的IPG膠條進行(jnxng)分離。pI311A舉例：羽衣甘藍柱頭組織蛋白質(zhì)的二向電泳分離pI4B723共二十七頁pH3-11 NLpH3-5.6NL pH5.3-6.5pH7-11NLpH6.2-7.5舉例: 小鼠肝臟(gnzng)蛋白的電泳分離24共二十七頁問題2: 對于低豐度的蛋白(dnbi)，該如何進行樣品分離？舉例：在血清中，白蛋白占蛋白質(zhì)總量的60%，免疫球蛋白占總蛋白質(zhì)總量的15%，白蛋白的大斑點使得(sh de)2-DE不能夠展示出

9、其他蛋白質(zhì)，同樣，在MS分析中，高濃度的白蛋白肽段也會掩飾其他肽段，使之無法得到檢測。 去除高豐度的蛋白，如白蛋白和免疫球蛋白。（白蛋白可以通過免疫吸附去除，免疫球蛋白可以通過固定化的金黃色葡萄球菌蛋白A去除） 去除高豐度蛋白后，可以上樣更多感興趣的蛋白，從而檢測到之前無法檢測的蛋白質(zhì)（低豐度）。25共二十七頁 參考書： 蛋白質(zhì)分析實驗技術指南，李玉花(y hu)等編著，高等教育出版社，2010. 蛋白質(zhì)電泳實驗技術 （第二版），郭堯君編著, 科學出版社，2005. Guide to protein purification (Second Edition), Richard R. Burgess, 科學出版社，2011. 蛋白質(zhì)組學中的蛋白質(zhì)純化手冊，茹炳根主譯，化學工業(yè)出版社， 2008. 蛋白質(zhì)組學研究-概念、技術及應用，張麗華等譯 （原書第二 版），科學出版社，2010.26共二十七頁內(nèi)容摘要第二章: 蛋白質(zhì)的電泳分離技術。等電聚焦技術是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點（pI）的不同而將他們分離的一種電泳技術。圖1 蛋白質(zhì)所在pH環(huán)境與帶電的關系。兩種形式：一種是含丙稀酰胺緩沖液的相對酸性的混合物，另一種含相對堿性緩沖液的混合物。不同濃度配比的酸性和堿性緩沖液決定pH梯度的范圍。采用氧化鋁陶瓷質(zhì)地的膠條槽、可以保證充