第6章腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

1、第6章腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥的敏感性、腫瘤細(xì)胞和癌分子生物學(xué)特性的重要手段。應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行腫瘤研究具有許多優(yōu)點(diǎn)：可免受機(jī)體內(nèi)環(huán)境因素的影響，避免了個(gè)體差異性，便于探索各種物理、化和生物因素對(duì)腫瘤細(xì)胞生命活動(dòng)的影響。既便于從細(xì)胞水平上研究腫瘤細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，又便于從基因及分子水平上研究癌變的發(fā)生機(jī)理?？砷L(zhǎng)期傳代、保存，便于觀察腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性和遺傳行為的改變。可用于快速篩選抗癌藥物和研究耐藥機(jī)理。研究周期短，比較經(jīng)濟(jì)。但是它也有缺點(diǎn)，如長(zhǎng)期培養(yǎng)可使細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)生改變；體外實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果不能完全代表體內(nèi)的情況，應(yīng)與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)合研究更為合理等。 一、腫瘤細(xì)胞

2、培養(yǎng)的生物學(xué)特性1形態(tài)和性狀2生物特性3永生性4侵潤(rùn)性5異質(zhì)性6細(xì)胞遺傳性1形態(tài)和性狀腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞界限清晰，伸展較差，核膜、核仁輪廓明顯，核仁多、核漿豐富。折光性強(qiáng)，電鏡觀察細(xì)胞表面微絨毛多而細(xì)密，與腫瘤細(xì)胞具不定向運(yùn)動(dòng)和鋪著不依賴(lài)性有關(guān)。2生物特性癌細(xì)胞在無(wú)血清或低血清(2%5%)時(shí)仍能生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求不高，因腫瘤細(xì)胞能自分泌促增殖因子，在軟瓊脂培養(yǎng)時(shí)單個(gè)細(xì)胞能形成集落，生長(zhǎng)方向性消失，再加上失去了接觸抑制，癌細(xì)胞數(shù)量增多時(shí)可呈多層重疊生長(zhǎng)，細(xì)胞飽和密度大，有豐富的三極有絲分裂，分裂指數(shù)高，細(xì)胞倍增周期短。3永生性永生性也稱(chēng)不死性，在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為可無(wú)限制傳代而不凋亡(Apopt

3、osis)，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系(株)都表現(xiàn)有這種特性。體外培養(yǎng)的永生性和體內(nèi)腫瘤的惡性(包括侵潤(rùn)性)是兩種性狀，受不同基因調(diào)控的，因惡性腫瘤多數(shù)在體外培養(yǎng)時(shí)并不那么容易獲得成功，生長(zhǎng)增殖能力并不旺盛，有時(shí)只能傳若干代，說(shuō)明體外培養(yǎng)的永生性可在體外培養(yǎng)后獲得。另外，體外培養(yǎng)的許多細(xì)胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而無(wú)惡性。但兩者有相關(guān)性，永生性可能是細(xì)胞惡性變的某一階段。4侵潤(rùn)性侵潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為，體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞仍保持有這種特性，當(dāng)與正常組織混合培養(yǎng)時(shí)，能侵潤(rùn)入其他正常組織中，甚至能穿透人工隔膜。5異質(zhì)性所有腫瘤細(xì)胞都是由增殖能力、遺傳性、起源、周期

4、狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成，屬于異質(zhì)性，其中有的衰老、退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，只有那些處于活躍增殖的腫瘤干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分，腫瘤干細(xì)胞易于生長(zhǎng)增殖，分離培養(yǎng)干細(xì)胞的方法稱(chēng)干細(xì)胞培養(yǎng)(有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系組成)。6細(xì)胞遺傳性體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞失去了二倍體核型，呈異倍體或多倍體，常有標(biāo)記染色體出現(xiàn)。正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞的區(qū)別，如表8-1-1所示。圖 腫瘤的遷移指 標(biāo)正常成纖維細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞形 態(tài)棱形或多角形，伸展良好，折光較弱，核漿比例小，嗜堿性弱，核仁較少較小，多核巨細(xì)胞少見(jiàn)多角形或細(xì)長(zhǎng)形，伸展較差，折光強(qiáng)，核漿比例大，嗜堿性強(qiáng)，核仁多、大，常見(jiàn)多核巨細(xì)胞生長(zhǎng)特性排列有方向性，單

5、層生長(zhǎng)，有接觸抑制，飽和密度低方向性消失，多層重疊生長(zhǎng)，接觸抑制消失，飽和密度高 表8-1-1 區(qū)別正常成纖維細(xì)胞 與惡性腫瘤細(xì)胞的常用指標(biāo) 續(xù)表1粘 附 性細(xì)胞間粘附性強(qiáng)，緊貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞間粘附性弱，易脫落血清的要求必須有血清 無(wú)需血清能生長(zhǎng)在半固體瓊脂中生長(zhǎng)能力不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)，形成集落電子顯微鏡觀察核蛋白體較少，微絲微管有規(guī)則排列核蛋白體豐富，微絲微管消失指 標(biāo)正常成纖維細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞 表8-1-1 區(qū)別正常成纖維細(xì)胞 與惡性腫瘤細(xì)胞的常用指標(biāo) 續(xù)表2細(xì)胞膜對(duì)低分子物質(zhì)通透性粘多糖的合成和分泌腺苷酸環(huán)化酶活性細(xì)胞內(nèi)CAMP濃度低多高高高少低低對(duì)松孢菌素的反應(yīng)不刺激核分裂，或至多形成雙核細(xì)胞

6、核持續(xù)分裂，形成多核巨細(xì)胞致瘤試驗(yàn)不能形成腫瘤能形成腫瘤指 標(biāo)正常成纖維細(xì)胞惡性腫瘤細(xì)胞表8-1-1 區(qū)別正常成纖維細(xì)胞 與惡性腫瘤細(xì)胞的常用指標(biāo) 續(xù)表3二、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué) 特性的檢測(cè)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞一旦建立細(xì)胞系就需要進(jìn)行一系列的細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定.目的在于：證明培養(yǎng)的細(xì)胞是否來(lái)自原來(lái)的腫瘤細(xì)胞。說(shuō)明腫瘤組織類(lèi)型。描述腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。通常要檢查下列項(xiàng)目：檢查下列項(xiàng)目1.組織起源：應(yīng)說(shuō)明培養(yǎng)材料起源于哪個(gè)胚層、器官組織、什么樣供體、何種疾病等，必要時(shí)要提供病理診斷鑒定資料。 2.形態(tài)觀察：觀察細(xì)胞一般形態(tài)如細(xì)胞形狀，核漿比例倒置，有豐富的三極或多極有絲分裂，核仁清晰、多個(gè)，微絲、

7、微管排列紊亂。3.細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)：檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞分裂指數(shù)，倍增時(shí)間及細(xì)胞周期。癌細(xì)胞失去正常的接觸抑制，呈多層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛，倍增時(shí)間縮短，飽和密度大，分裂指數(shù)較高，具無(wú)限增殖能力，細(xì)胞浸潤(rùn)能力較強(qiáng)等。腫瘤細(xì)胞失去接觸抑制現(xiàn)象4.軟瓊脂培養(yǎng)：癌細(xì)胞在低密度下仍具有高度存活率，并在軟瓊脂中形成集落。5.細(xì)胞核型分析：檢測(cè)核型特點(diǎn)，染色體數(shù)量，有無(wú)標(biāo)記染色體，染色體帶型等，癌細(xì)胞大多為異倍體，多倍體，并有標(biāo)記染色體。6.動(dòng)物致瘤試驗(yàn)：裸鼠背部皮下接種11092109/L癌細(xì)胞能生長(zhǎng)形成實(shí)體瘤，其組織學(xué)形態(tài)與原發(fā)瘤相似。7.組織化學(xué)檢查： 癌細(xì)胞中脫氧核糖核酸、酸性磷酸酶和磷脂增多，堿性磷酸酶

8、下降，乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性也改變。8.其他生物學(xué)特性檢測(cè)：有凝集試驗(yàn)等。三、腫瘤細(xì)胞的取材和培養(yǎng)(一)腫瘤細(xì)胞的取材方法培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的材料一般來(lái)自患者，對(duì)實(shí)體瘤患者可取原發(fā)腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶，有胸、腹水患者可取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液進(jìn)行培養(yǎng)。具體：(二)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法(一)腫瘤細(xì)胞的取材方法1.體瘤取材方法 取術(shù)后或活檢標(biāo)本，要盡早浸入無(wú)血清培養(yǎng)液保鮮，盡快進(jìn)行培養(yǎng)。盡可能去除潰瘍及壞死組織，避免細(xì)菌、霉菌污染，對(duì)取自外露的腫瘤組織，應(yīng)在培養(yǎng)前在含二性霉素B 2g/mL，青霉素2001000u/mL，鏈霉素500g/mL的培養(yǎng)液中浸泡1020分鐘，再用洗液反復(fù)沖洗干凈

9、后，再作培養(yǎng)。2.腔液的取材方法 在無(wú)菌條件下采取體腔液(胸水或腹水)，不需加抗凝劑，可直接以1200r/min收集細(xì)胞，不要久置，也不要在冰中冷卻，而應(yīng)盡早接種。3.血液(骨髓)取材法 白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外周血為研究對(duì)象，用肝素抗凝的注射器無(wú)菌抽取510mL外周血，置于試管中立刻分離培養(yǎng)。(二)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用RPM1640，DMEM、Mc-Coy-5A等培養(yǎng)基，血清濃度不高，10%即可，建議在原代培養(yǎng)時(shí)最好能加入生長(zhǎng)因子或原患者血清(1%2%)以利細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)方法很多，主要有組織塊法、酶消化法、鉭網(wǎng)法、脫落細(xì)胞法等。1.織

10、塊培養(yǎng)法將取得的瘤組織去除脂肪結(jié)締組織及壞死部分 在平皿中用Hanks液洗3次 剪碎組織，切成12mm3小塊 接種于事先涂有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶（或皿）中 37 5%或加蓋瓶塞在普通恒溫箱中培養(yǎng)。2.酶消化法在上述的碎組織塊中加入0.25%胰蛋白酶或2000u/ml膠原酶 在37水浴中消化30分鐘或更長(zhǎng)一些，去除消化液用洗液洗3次，培養(yǎng)液洗1次后,用完全培養(yǎng)基懸浮，并用吸管吹打分散制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。 以510810108/L細(xì)胞濃度，在含有10%小牛血清的RPMI1640、或Eagle MEM或DMEM中，在37 5% CO2下分瓶(或皿)培養(yǎng)3.鉭網(wǎng)培養(yǎng)法在一張面積約為1cm2的鉭網(wǎng)上放入上述

11、剪碎的一塊或幾塊腫瘤組織塊(12mm3大小) 用鑷子輕壓，使其粘于網(wǎng)上 再把鉭網(wǎng)放入培養(yǎng)皿中，使網(wǎng)下的組織塊與皿壁緊緊接觸 于37 5% CO2下培養(yǎng)，每隔23天換液一次 5天后可見(jiàn)有上皮細(xì)胞從網(wǎng)上移出，并能在相當(dāng)于腫瘤組織部位形成純凈的單層上皮細(xì)胞。4.脫落細(xì)胞法 將新鮮的腫瘤組織去除脂肪和結(jié)締組織 洗液洗2次后 用刀片將腫瘤組織切成細(xì)薄片，在切割的同時(shí)有許多上皮細(xì)胞脫落下來(lái), 脫落細(xì)胞經(jīng)洗滌后 加入完全培養(yǎng)基，便可獲得較純的上層細(xì)胞，于培養(yǎng)瓶(或皿)中、37 5% CO2下培養(yǎng)，每隔23天換液，710天上皮細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成單層。(三)成纖維細(xì)胞的排除方法在腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)中，常在培養(yǎng)物中混有

12、正常成纖維細(xì)胞，若把正常細(xì)胞誤認(rèn)為是癌細(xì)胞，就會(huì)使整個(gè)工作失去意義，若不及時(shí)去除這些成纖維細(xì)胞，由于成纖維比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)快，最終能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，盡早排除成纖維細(xì)胞，已成為腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)建系的關(guān)鍵?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多因素能抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)(見(jiàn)表8-1-2)。為了在腫瘤細(xì)胞中排除成纖維細(xì)胞，常采用五種方法，即機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法、密度梯度離心法。方 法因 素組 織 細(xì) 胞選擇性附著胰蛋白酶膠原酶胚胎小腸、心肌表皮乳癌選擇性附著底物聚丙稀酰胺聚四氟乙烯(Teflon)膠原(豬皮)各種腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞表皮細(xì)胞匯合飼細(xì)胞層小鼠3T3人胎小腸表皮正常和惡性乳腺上皮結(jié)腸癌

13、選擇性培養(yǎng)基D-纈氨酶(Valine)MCDB-710MCDB-153Phenobarbitone腎組織乳腺表皮肝細(xì)胞表8-1-2 抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因素排除成纖維細(xì)胞 的方法1.機(jī)械刮除法用不銹鋼絲末端的橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插入不銹鋼絲或裹上少許脫脂棉制成)，裝入試管中高壓蒸氣滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。操作步驟如下：(1)標(biāo)記 鏡下觀察，用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶(皿)的背面圈下腫瘤細(xì)胞的部位。(2)刮除 棄掉培養(yǎng)液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標(biāo)記細(xì)胞空間。(3)Hanks液沖洗12次，洗除被刮掉的細(xì)胞。(4)加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，如仍有成纖維細(xì)胞殘留，

14、可重復(fù)刮除至徹底刮凈為止。 2反復(fù)貼壁法根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液，把含有兩類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類(lèi)細(xì)胞相互分離。方法如下(同貼壁傳代)：(1)待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后，倒去舊液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培養(yǎng)液吹打分散，制成單細(xì)胞懸液。(2)取三個(gè)培養(yǎng)瓶分別編號(hào)為A、B、C，首先把細(xì)胞懸液接種入A瓶，置溫箱中靜置培養(yǎng)520分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后，慢慢吸出全部培養(yǎng)物，再接種于B瓶中，然后向A瓶中補(bǔ)充完全培養(yǎng)基置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)。(3)B瓶中的細(xì)胞靜置培養(yǎng)520分鐘后，按處理A瓶的方法，把B瓶中的培

15、養(yǎng)液和細(xì)胞懸液吸出并注入C瓶中，再向B瓶補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，C瓶補(bǔ)加少量小牛血清(濃度為10%)。 三個(gè)瓶一并在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如操作成功，次日觀察，可見(jiàn)A瓶中主要為成纖維細(xì)胞，B瓶中兩類(lèi)細(xì)胞混雜，C瓶中主要為上皮細(xì)胞(癌細(xì)胞)，必要時(shí)可反復(fù)處理幾次直至癌細(xì)胞純化為止。3消化排除法此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體方法如下：(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后加入新的混合液繼續(xù)消化直到有半數(shù)細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，立即停止消化。(2)把消化液離心棄去上清，沉下的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸并吸入另一培養(yǎng)瓶中，置溫箱培養(yǎng)，向原瓶中補(bǔ)加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，此法處理后，鑒于成纖

16、維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞先脫落，原瓶中留下的多為腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理，就能把成纖維細(xì)胞除凈。4膠原酶消化法本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。(1)可用的膠原酶消化處理，邊消化邊在鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后即終止消化。(2)用Hanks液洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞，若未清除凈，可再次重復(fù)。5密度梯度離心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重的密度梯度分離液 加入細(xì)胞懸液后 2500r/min離心10分鐘(比重層為成纖維細(xì)胞，比重層為上皮細(xì)胞) 將收集的上皮細(xì)胞經(jīng)洗液3次后，進(jìn)行培養(yǎng)可獲純凈的腫瘤細(xì)胞。(四)血癌細(xì)胞分離培養(yǎng)1.采血與分離白細(xì)胞

17、 用肝素抗凝的注射器無(wú)菌抽取白血病患者外周血510mL 置無(wú)菌離心管中，斜放于37的水浴中，待紅細(xì)胞沉淀后，將血漿部分吸入另一離心管中 以1500r/min離心15分鐘，收集細(xì)胞 用含20%小牛血清的RPMI1640含50u(g)/mL青、鏈霉素培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1109細(xì)胞/L以上，開(kāi)始接種濃度要大。培養(yǎng)基中加入患者血清為1%2%。2原代培養(yǎng)物的維持將分離的患者白細(xì)胞種入鏈霉素小瓶中，每瓶3mL在37溫箱中進(jìn)行懸浮狀態(tài)的靜置培養(yǎng)，每隔23天半量換一次，吸出舊液棄去，加入新鮮完全培養(yǎng)基。若換液前培養(yǎng)基中的pH有下降，說(shuō)明細(xì)胞存活，起先一直堅(jiān)持換液，不分瓶傳代，直至細(xì)胞有明顯增殖再擴(kuò)大培養(yǎng)。3

18、傳代培養(yǎng)（直到建系）細(xì)胞增殖后，pH下降明顯時(shí)，說(shuō)明細(xì)胞有明顯增殖，此時(shí)搖動(dòng)細(xì)胞，在細(xì)胞懸液中有少量細(xì)胞結(jié)成的團(tuán)塊，可轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)，開(kāi)始以1:2分瓶培養(yǎng)，當(dāng)傳至10代左右，細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)減慢，幾乎不分裂，甚至有許多細(xì)胞死亡，此時(shí)再并瓶培養(yǎng)，堅(jiān)持每3天換液一次，23周后細(xì)胞已適應(yīng)了外界環(huán)境，開(kāi)始增殖，然后每2天換一次液，每周傳一代，即加入等量培養(yǎng)基以1:2分瓶培養(yǎng)，細(xì)胞增殖快時(shí)以1:3分瓶，即每瓶加入6mL，共計(jì)9mL，分成3瓶，每瓶3mL，繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)傳至20代以上時(shí)已基本穩(wěn)定，可以認(rèn)為已基本建系，我院共建了兩個(gè)白血病細(xì)胞系，即S7811粒單型白血細(xì)胞系和S801急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系。(五)

19、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率的措施根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外易培養(yǎng)，但建立能夠傳代的細(xì)胞系較為困難，當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代培養(yǎng)后，常出現(xiàn)以下幾種情況：完全無(wú)細(xì)胞游離出或移動(dòng)。有細(xì)胞移動(dòng)和游出，但無(wú)細(xì)胞增殖，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代。傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢，經(jīng)過(guò)一段停滯期后，才呈現(xiàn)旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)，形成穩(wěn)定生長(zhǎng)的腫瘤傳代細(xì)胞系。必須采取特殊的措施適宜底物：把純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層或飼養(yǎng)細(xì)胞層等。生長(zhǎng)因子：將促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子加入培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，常用胰島素、氫化可的松、雌激素以及其他生長(zhǎng)因子。動(dòng)物體媒介培養(yǎng)：為了提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)和增加有活力的癌細(xì)胞

20、(干細(xì)胞)的數(shù)量，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率，受體動(dòng)物以裸鼠最好。方法如下： 動(dòng)物體媒介培養(yǎng)(1)瘤塊接種 取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成13mm3小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，于皮下注入瘤塊。(2)待腫瘤生長(zhǎng)達(dá)較大體積后剝?nèi)〕隽鼋M織，進(jìn)行體外培養(yǎng)。(3)為防止失敗，可取部分瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)傳代，通過(guò)裸鼠媒介接種，使腫瘤干細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞易于培養(yǎng)成功。(六)腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)應(yīng)注意的事項(xiàng)1在原代培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題 (1)培養(yǎng)材料應(yīng)取自腫瘤細(xì)胞集中、活力較好的部分，取材后應(yīng)立即培養(yǎng)并存放于培養(yǎng)液中。 (2)取材和培養(yǎng)過(guò)程中要防止細(xì)菌和霉

21、菌污染。 (3)培養(yǎng)物中混有的成纖維細(xì)胞要盡快清除。 (4)癌組織中若有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，應(yīng)采用密度離心法將淋巴細(xì)胞清除，否則癌細(xì)胞會(huì)被殺死。 (5)實(shí)驗(yàn)要防止其他細(xì)胞株的交叉污染。2在傳代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題(1)當(dāng)癌細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足夠的量時(shí)，應(yīng)耐心等待，堅(jiān)持換液，不要急于傳代。(2)癌細(xì)胞經(jīng)常重疊生長(zhǎng)，如果混有成纖維細(xì)胞，應(yīng)在傳代時(shí)采用消化消除法及反復(fù)貼壁法加以清除，分離出癌細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。(3)在傳到10代前細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖極不穩(wěn)定，傳代要小心，該合并培養(yǎng)時(shí)還得合并，千萬(wàn)不能傳代。要確定適合該細(xì)胞的培養(yǎng)方法。(4)在早期傳代時(shí)要適當(dāng)提高接種濃度。(5)對(duì)于增殖能力極低的細(xì)胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層中培養(yǎng)，并加入一些促生長(zhǎng)物質(zhì)，如胰島素、氫化考的松、雌激素、EGF、軟鐵蛋白等因子。(6)消除成纖維細(xì)胞始終為癌細(xì)胞培養(yǎng)中的重要條件，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)盡早盡快按上述介紹的方法加以清除。(七)人類(lèi)惡性腫瘤連續(xù)性細(xì)胞系(株)的建系(株)標(biāo)準(zhǔn)1共同特征（1）原始資料 能在體外培養(yǎng)半年以上(或20代以上)，生長(zhǎng)穩(wěn)定，保持特性，能連續(xù)傳代的，可稱(chēng)為連續(xù)性細(xì)胞系(株)。要具備如下原始資料： 標(biāo)本來(lái)源 要記錄患者姓名、年齡、性別、臨床診斷的疾病類(lèi)別和分期。 標(biāo)本收集日期、細(xì)胞制作培養(yǎng)日期和方法。 標(biāo)本的病理切片和病理診斷，按組織