藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)和影響因素

1、藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)和影響因素藥敏試驗(yàn)MIC：在與微生物生長(zhǎng)速率有關(guān)的特定時(shí)間間隔內(nèi)，通常是1824小時(shí)，能夠抑制被測(cè)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。對(duì)倍稀釋的優(yōu)點(diǎn)：操作容易敏感株的MIC呈正態(tài)分布區(qū)分異常(R)與敏感(S)的菌群藥敏試驗(yàn)折點(diǎn)的建立 1. MIC的分布2. 藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué) 定 MIC的折點(diǎn)3. 臨床療效和細(xì)菌清除率4. 抑菌圈直徑的分布 定抑菌圈折點(diǎn)統(tǒng)計(jì)學(xué)的線性回歸計(jì)算錯(cuò)誤率：盡可能減少極重要誤差 (假敏感率)MIC的分布藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)藥代動(dòng)力學(xué)：藥物吸收，分布，代謝，排泄藥效學(xué)：藥物對(duì)機(jī)體的作用時(shí)間依賴型（TMIC：內(nèi)酰胺類，大環(huán)內(nèi)酯類濃度依賴型（AUC/MIC比率：AGS, FQ

2、這些參數(shù)可用于計(jì)算具有最佳藥效的給藥方案MIC與抑菌圈直徑的線性關(guān)系耐藥 中介 敏感RISLog2. MICD 1 d2 抑菌圈直徑（mm)抑菌圈直徑與MIC的關(guān)系不同國(guó)家的判定折點(diǎn)可能不同原因：用藥劑量不同，服藥的間隔不同評(píng)價(jià)敏感時(shí)較保守更強(qiáng)調(diào)檢測(cè)出耐藥株（即特定的耐藥群）技術(shù)因素：接種、培養(yǎng)基敏感性分類(NCCLS的定義)敏感（Susceptible）用常規(guī)用量治療有效常規(guī)用藥時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度超過細(xì)菌的MIC 5倍以上。耐藥（Resistance）用常規(guī)用量治療不能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)MIC高于藥物在血、體液中可能達(dá)到的濃度敏感性分類（2）中介 (Intermediate)MIC接近血、體液

3、中藥物的濃度，治療反應(yīng)率低于敏感株藥物生理濃集部位有效 (尿FQ)加大用藥劑量可能有效緩沖區(qū)：防止操作的系統(tǒng)誤差造成重大結(jié)果的判定錯(cuò)誤藥敏試驗(yàn)的方法學(xué)半定量紙片擴(kuò)散法 (抑菌圈直徑)MIC法：稀釋法(肉湯、瓊脂)自動(dòng)化儀法抗生素連續(xù)梯度法 (Etest )流式細(xì)胞儀藥敏試驗(yàn)方法的選擇紙片法有獨(dú)特之處選藥?kù)`活、便宜、易懂MIC法：商品肉湯法 (自動(dòng)化法)可用于厭氧菌、苛氧菌計(jì)算機(jī)管理快速，但可能有錯(cuò)誤（如誘導(dǎo)型菌）新藥的評(píng)價(jià)藥敏試驗(yàn)方法1（紙片擴(kuò)散法材料：浸有一定Abs的干燥的園濾紙片步驟：制備菌懸液涂平板貼紙片孵育卡尺測(cè)量抑菌圈直徑判定R、I、S優(yōu)點(diǎn)：選藥?kù)`活、便宜、一個(gè)平皿可測(cè)多個(gè)藥缺點(diǎn)：影

4、響因素多適用于快生長(zhǎng)菌、部分苛養(yǎng)菌紙片擴(kuò)散法影響因素MIC接種菌量細(xì)菌生長(zhǎng)率抗生素含量、擴(kuò)散性平皿厚度溫度，預(yù)孵育時(shí)間紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)化NCCLS：美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standards)每年修訂更改包括質(zhì)控新藥的判定標(biāo)準(zhǔn)特殊耐藥性的檢測(cè)NCCLS的法規(guī)規(guī)定紙片含量、接種濃度、培養(yǎng)基、平皿厚度、判定標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控規(guī)定常規(guī)測(cè)試報(bào)告的抗生素不同的藥判定標(biāo)準(zhǔn)不同不同的菌判定標(biāo)準(zhǔn)也不同常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組(1) 腸桿菌科綠膿和非腸桿菌科一 級(jí) 氨芐頭孢他啶 唑林，慶大慶大，替卡，哌拉二級(jí) 阿米卡星阿米卡星 氨芐/舒

5、，阿莫/克吡肟，哌酮，氨曲南 頭孢膚肟，頭霉環(huán)丙，亞胺培南，替卡/克 噻肟，曲松，環(huán)丙妥布，磺胺 亞胺培南，替卡，哌拉三級(jí) 氨曲南，頭孢他啶頭孢曲松 卡那，奈替，妥布氯霉素，奈替 四環(huán)素，氯霉素 常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組(2) 葡萄球菌腸球菌一級(jí) 苯唑，青霉素青霉素，氨芐二級(jí) 紅霉素類萬(wàn)古霉素 克林，萬(wàn)古三級(jí) 氯霉素慶大常規(guī)測(cè)試并報(bào)告的藥物分組(3) 流感嗜血桿菌肺炎鏈球菌一級(jí) 氨芐，青霉素青霉素，紅霉素 TMP/SMZ TMP/SMZ二級(jí) 頭孢膚肟，噻肟氧氟，四環(huán)素 他啶，氯霉素 萬(wàn)古霉素三級(jí) 阿奇，頭孢克羅氯霉素，利福平 環(huán)丙，亞胺培南利福平，四環(huán)素預(yù)報(bào)用藥(一) 測(cè)試藥菌名推測(cè)其它藥物的

6、敏感性 苯唑西林葡萄球菌所有內(nèi)酰胺類 四環(huán)素所有（除葡多西環(huán)素，米諾環(huán)素 萄球菌和不 動(dòng)桿菌紅霉素G球菌羅紅，克拉，阿奇克林霉素所有林可霉素預(yù)報(bào)用藥(二)測(cè)試藥菌名推測(cè)其它藥物的敏感性氨芐西林腸球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨芐，美洛，替卡頭孢噻吩腸桿菌科拉定，頭孢氨芐，克羅奈啶酸s腸桿菌科所有FQs萬(wàn)古霉素s所有替考拉寧s紙片擴(kuò)散法操作規(guī)程(一)培養(yǎng)基：MH (重復(fù)性好，低抑制劑，營(yíng)養(yǎng)好)厚度：4mmpH低時(shí)，氨基糖甙,大環(huán)內(nèi)酯 pH高時(shí)，青霉素類的活性 離子濃度 (Ca 2+ , Mg 2+ )影響 氨基糖甙類、四環(huán)素對(duì)Pae活性高時(shí)，抑菌圈；紙片擴(kuò)散法操作規(guī)程(二)接種：純的新鮮菌落，菌懸液

7、在15分鐘內(nèi)種入平皿內(nèi)紙片中心的間距=24mm孵育：CO2影響Ags, Tet, Macrolides質(zhì)控: ATCC25922, 35218 ATCC27853, ATCC25923紙片擴(kuò)散法結(jié)果的判定1. 先看菌名（鑒定到種2. 不同的藥物使用不同的折點(diǎn)藥名菌名RS菌株1菌株2Pip/Taz綠膿171816R30SCAZ綠膿 141816I19S3. 同是S時(shí)，偏離敏感折點(diǎn)越高的藥, MIC越低，活性也越高抑菌圈的分布抑菌圈的分布非NCCLS系統(tǒng)的擴(kuò)散試驗(yàn)方法國(guó)家學(xué)會(huì)培養(yǎng)基評(píng)論比較法UKBSACIso-Sensitest不校正MICsStokesUKBSACIso-Sensitest不校正

8、MICsSFM法國(guó)SFMMH與NCCLS相近DIN德國(guó)DINMH與NCCLS相近SIR瑞典SMSPDMASMMIC相關(guān)值低Neo-sensitabs丹麥、比利時(shí)MH藥片，易保存雙歧澳大利亞Sensitest無(wú)中介藥敏試驗(yàn)的錯(cuò)誤來源(一)每個(gè)系統(tǒng)特有的局限性 （快生長(zhǎng)菌培養(yǎng)基（成分、厚度、pH、離子濃度）各種材料的正確保存 (紙片20)操作步驟純菌、35、1628h葡萄球菌、腸球菌 24h藥敏試驗(yàn)的錯(cuò)誤來源(二)體內(nèi)、體外試驗(yàn)的不一致性某些菌測(cè)某些藥，結(jié)果有誤頭孢菌素、氨基糖甙類：沙門菌、志賀菌頭孢菌素：李斯特菌屬頭孢菌素、氨基糖、克林、TMP/SMZ：腸球菌Beta內(nèi)酰胺類：MRS即使敏感，也

9、應(yīng)報(bào)告耐藥問題菌和耐藥機(jī)制有些菌無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏試驗(yàn)棒桿菌、芽胞桿菌、氣單胞菌、巴斯德菌某些耐藥機(jī)制需要多種檢測(cè)方法誘導(dǎo)型：VanB, Bush I型酶MRS的異質(zhì)型表達(dá)ESBL藥敏可能無(wú)法檢出新出現(xiàn)的耐藥，VISA藥敏試驗(yàn)方法2肉湯稀釋法 4 816 32 64 128 256 ug/ml 混 混 清抗生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml ， 孵育35，16-20h，判讀藥敏試驗(yàn)方法2肉湯稀釋法調(diào)節(jié)離子濃度的MH肉湯宏量肉湯法（2ml, 13x100mm ）微量肉湯法 （ 0.1ml, 微量板） 自動(dòng)化儀優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確，可靠，可用于研究缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大細(xì)菌生長(zhǎng)情況不可查藥敏試驗(yàn)方法3瓊脂稀釋法 濃

10、度 16 32 64 128 256 ug/ml 制備含對(duì)倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點(diǎn)種菌，104/每個(gè)點(diǎn)，孵育，判讀結(jié)果藥敏試驗(yàn)方法3瓊脂稀釋法優(yōu)點(diǎn)：金標(biāo)準(zhǔn) 精確可靠可同時(shí)測(cè)定多株菌（40株）細(xì)菌生長(zhǎng)情況可查缺點(diǎn)： 測(cè)多個(gè)藥時(shí)勞動(dòng)強(qiáng)度大制備平皿費(fèi)時(shí)費(fèi)力藥敏試驗(yàn)方法4E test 法 細(xì)菌生長(zhǎng)區(qū)E test 塑料條橢圓形細(xì)菌生長(zhǎng)抑制區(qū)256128 8016判讀抑菌濃度（MIC ug/ml)藥敏試驗(yàn)方法4E test 法優(yōu)點(diǎn)連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好影響因素少，穩(wěn)定性高操作簡(jiǎn)單，省時(shí)缺點(diǎn)：昂貴用途：快生長(zhǎng)菌，苛養(yǎng)菌，厭氧菌，酵母菌， 分枝桿菌評(píng)價(jià)藥物體外抗菌活性的指標(biāo)MIC50

11、, MIC90, MIC 均值， MIC 范圍，R，I，SMIC50/ MIC90：MIC從小到排列，位于第50 / 90百分位菌株的MIC值單純比較MIC50，MIC90是片面的，還要同時(shí)看平均MIC及MIC范圍同時(shí)結(jié)合R，I，S，（不同藥物血濃度不同，安全范圍不同抗生素細(xì) 菌人 體 RESISTANCEPHARMACODYNAMICSINFECTIONIMMUNITYSIDE EFFECTSPHARMACOKINETICS抗生素、細(xì)菌、人體40Slide noTime above MICCorrelation of serum pharmacokinetics with MIC (susc

12、eptibility)of an organism Time above MICTimeAntibiotic concentration (ug/ml)2Drug ADrug BABDrug A present at concentration of 2 ug/ml for 50% of dosing intervalDrug B present at concentration of 2 ug/ml for 30% of dosing interval4680Relationship between Time above MIC and efficacy in animal infectio

13、n models020406080100020406080100Time above MIC (%)PenicillinsCephalosporinsMortality after 4 days of therapy (%)Craig. Diagn Microbiol Infect Dis 1996; 25:21321742Slide no 24-hr AUC/MICCorrelation of serum pharmacokinetics with MIC (susceptibility)of an organism Antibiotic concentrationMIC TimeArea

14、under the curve over MIC24-hr AUC/MIC is correlated with outcome of infection, the magnitude required for success and MIC at which this occurs becomes the PD breakpoint43Slide noThe relationship between time above MIC90and bacteriological cure in S. pneumoniae (red) andH. influenzae (blue) in otitis

15、 media and sinusitisOtitis mediaSinusitisTime Above MIC (% of dosing interval)Bacteriological cure (%)020406080100020406080100Craig, ECCMID 2000, Stockholm, Sweden抗生素選擇時(shí)需考慮的因素藥物感染部位濃度對(duì)細(xì)菌MIC結(jié)果微生物學(xué)抗菌機(jī)制抗菌譜藥代動(dòng)力學(xué)吸收、分布、代謝、排泄給藥方案藥效學(xué)時(shí)間/濃度依賴型殺菌劑/抑菌劑組織滲透抗菌時(shí)效臨床效果細(xì)菌清除患者依從性耐受性耐藥產(chǎn)生抗生素治療失敗的主要原因抗生素藥效學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)關(guān)系研究 PK/PD藥代條件下的藥效 PARAMETERS：PK：Cmax、AUC、T1/2 PD：MIC PK/PD：AUC/MIC Cmax/MIC TMIC抗生素藥效學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)關(guān)系研究 抗生素PK/PD分類抗生素藥效學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)關(guān)系研究 PK/PD研究的應(yīng)用給藥方案的制定與優(yōu)化抗菌藥物合理應(yīng)用的藥理學(xué)考慮藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)參數(shù)與抗菌效力（動(dòng)物模型） 參數(shù) 藥物高于MIC時(shí)間青、頭孢、碳青烯、氨曲、大 環(huán)、克林24h AUC/MIC氨基糖苷、氟喹酮、阿奇峰值/MIC 四環(huán)