組織培養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt課件

1、植物組織培育實(shí)驗(yàn)教師：葉水英實(shí)驗(yàn)一、熟習(xí)和整理植物組織培育實(shí)驗(yàn)室一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解植物組織培育實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置及根本設(shè)備，學(xué)習(xí)根本儀器設(shè)備的運(yùn)用原理與方法，掌握植物組織培育的一些根本技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：一組培實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置我系組培實(shí)驗(yàn)：植物實(shí)驗(yàn)室、分子生物實(shí)驗(yàn)室、組培室三大個(gè)實(shí)驗(yàn)室組成。一個(gè)規(guī)范的組織培育實(shí)驗(yàn)室該當(dāng)包括：預(yù)備室、接種室、培育室、馴化室等，預(yù)備室又稱為化學(xué)實(shí)驗(yàn)室或通用實(shí)驗(yàn)室，可由洗滌室、培育基配制室和滅菌室構(gòu)成。在實(shí)踐中可結(jié)合可行條件，合并一部分。各分室能滿足實(shí)驗(yàn)預(yù)備器皿的洗滌與存放、培育基制備和無(wú)菌操作、器具的滅菌、無(wú)菌操作和控制培育三項(xiàng)根本任務(wù)的需求。1、預(yù)備室由洗滌室、培育基配

2、制室和滅菌室構(gòu)成。1洗滌室(cleaning room)用于玻璃器皿和實(shí)驗(yàn)器具的洗滌、枯燥和儲(chǔ)存；培育資料的預(yù)處置與清洗；組培苗的出瓶、清洗與整理等。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，最好是白瓷水槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪墊橡膠。上下水道要暢通。備有塑料筐，用于運(yùn)輸培育器皿。備有枯燥架，用于放置枯燥涮凈的培育器皿。2培育基配制室用于培育基的配制。要求房間寬闊亮堂、通風(fēng)、枯燥、清潔衛(wèi)生，便于多人同時(shí)操作；有電源、自來(lái)水和水槽池，保證上下水道暢通。有時(shí)可將配制室內(nèi)部間隔為稱量分室和配制分室。規(guī)模較小時(shí)，配制室可與洗滌室合并為預(yù)備室。儀器與器具配置：電子天平、磁力攪拌器、蒸餾水器、酸度計(jì)、恒溫水浴鍋、電爐或微波

3、爐、電飯煲、液化氣爐灶等、冰箱等儀器設(shè)備；移液管或微量移液器、移液管架、培育瓶包括試管、棕色或透明試劑瓶、燒杯帶或不帶刻度、量筒、容量瓶、培育皿、吸管、打孔器、玻璃棒、標(biāo)簽紙、記號(hào)筆、耐高溫高壓塑料薄膜等封口資料、周轉(zhuǎn)筐、尼龍繩、脫脂棉、紗布、任務(wù)臺(tái)、蒸餾水桶、醫(yī)用小推車等用品和器具。此外，配備器械柜和藥品柜，分別存放接種器具和分類存放化學(xué)試劑可改為藥品。最好配備防塵設(shè)備，以減少灰塵污染。3滅菌室用于培育基、器皿、工具和其他物品的消毒滅菌。要求平安、通風(fēng)、亮堂；墻壁和地面防潮、耐高溫；配備水源、水槽池、電源或煤氣加熱安裝和供排水設(shè)備；保證上下水道暢通，通風(fēng)措施良好。消費(fèi)規(guī)模較小時(shí)，可與洗滌室、

4、配制室合并在一同，但滅菌鍋的擺放位置要遠(yuǎn)離天平和冰箱，而且必需設(shè)置換氣窗或換氣扇，以利通風(fēng)換氣。儀器與器具配置：高壓滅菌鍋、干熱消毒柜或烘箱、細(xì)菌過(guò)濾安裝、任務(wù)臺(tái)、培育基存放架或櫥柜、周轉(zhuǎn)筐、換氣扇、醫(yī)用小推車等。2、無(wú)菌操作室transfering room進(jìn)展植物資料的接種、培育物的轉(zhuǎn)移等無(wú)菌操作，因此接種室也稱為無(wú)菌操作室。其無(wú)菌條件的好壞對(duì)組織培育的勝利與否起著重要作用。在任務(wù)方便的前提下，接種室宜小不宜大，普通78m2，要求地面、天花板及四壁盡能夠密閉光滑，易于清潔和消毒。配置推拉門，以減少開關(guān)門時(shí)的空氣擾動(dòng)。接種室要求干爽安靜，清潔亮堂。在適當(dāng)位置吊裝1-2盞紫外線滅菌燈，用以照射

5、滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。儀器與器具配置：超凈任務(wù)臺(tái)、空調(diào)機(jī)、解剖鏡、接種器具消毒器(或高溫焚化爐)、紫外光燈、酒精燈、廣口瓶、三角瓶、搪瓷盤、接種工具、手持噴霧器、任務(wù)臺(tái)、擱架、接種用的小平車、不銹鋼長(zhǎng)方形飯盒(盛放7075%酒精，用于浸泡接種工具)或醫(yī)院用消毒盒等。配置污物桶，以便存放接種過(guò)程中的丟棄物，須每天清洗改換。進(jìn)入無(wú)菌室前，為了防止帶菌空氣直接進(jìn)入接種室和任務(wù)人員進(jìn)出接種室時(shí)帶進(jìn)雜菌，接種人員在緩沖間更衣、換鞋、洗手、戴上口罩后，才干進(jìn)入接種室。該當(dāng)在此室內(nèi)安裝滅菌用的紫外燈。3、培育室culturing room 培育室是將接種

6、的資料進(jìn)展培育生長(zhǎng)的場(chǎng)所。培育室的大小可根據(jù)需求培育架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原那么。高度比培育架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培育資料放在培育架上培育。培育架大多由金屬制成，普通 設(shè)5、6層，最低一層離地高約l0-20cm，其他每層間隔30cm左右，培育架即高1.7m左右。培育架長(zhǎng)度都是根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，那么長(zhǎng)1.3m，30W的長(zhǎng)lm，寬度普通為60cm。培育室最重要的因子是溫度，普通堅(jiān)持在2027左右，具備產(chǎn)熱安裝，并安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。由于熱帶植物和寒帶植物等不同種類要求不同溫度，最好不同種類有不同的培育室。

7、室內(nèi)濕度也要求恒定，相對(duì)濕度以堅(jiān)持在7080為好，可安裝加濕器?？刂迫展庹諘r(shí)間可安裝定時(shí)開關(guān)鐘，普通需求每天光照1016h也有的需求延續(xù)照明?，F(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽(yáng)光照作為主要能源，這樣不但可以節(jié)省能源，而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。在陰雨天可用燈光作補(bǔ)充。4、馴化室馴化室要求清潔無(wú)菌，配有空調(diào)機(jī)、加濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調(diào)理安裝、通風(fēng)口以及必要的殺菌劑。二組培實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備1、常用儀器設(shè)備1超凈臺(tái)最常用最普及的無(wú)菌操作安裝,主要經(jīng)過(guò)風(fēng)機(jī),送入的空氣經(jīng)過(guò)細(xì)菌過(guò)濾安裝,再流過(guò)任務(wù)臺(tái)面.因此,超凈任務(wù)臺(tái)應(yīng)放置在空氣干凈,地面無(wú)灰塵的地方,以延伸運(yùn)用期.運(yùn)用

8、過(guò)久,引起堵塞,需求清洗和改換過(guò)濾器。2高壓滅菌鍋是最根本的設(shè)備，用于培育基.器械等的滅菌。3空調(diào)機(jī)保證室內(nèi)溫度，普通為252，應(yīng)安頓在室內(nèi)較高的位置。以便于排熱散涼。4光照培育箱用于植物資料的特定培育，可以控制溫度、濕度及光照等。5烘箱洗凈后的玻璃器皿，如需迅速枯燥，可放在烘箱內(nèi)烘干，溫度以80-100為宜假設(shè)需干熱滅菌，溫度升高至150-160 ,繼續(xù)1-3小時(shí)即可6冰箱某些試劑藥品和母液需低溫保管，有些資料需低溫處置，需求運(yùn)用冰箱7電子分析天平電子分析天平，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品準(zhǔn)確度為0.0001g；托盤天平用于稱取用量較大的糖和瓊脂等，其準(zhǔn)確度為0.1g。

9、天平應(yīng)放置在枯燥、不受震動(dòng)的天平操作臺(tái)上。8顯微鏡及解剖鏡，種類較多，用于分別微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。雙筒解剖鏡在分別莖尖等較小組織時(shí)，便于察看、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需求有相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。為進(jìn)展操作，要有照明安裝。解剖鏡上帶有照相安裝，根據(jù)需求隨時(shí)對(duì)所需資料進(jìn)展攝影記錄。9搖床與轉(zhuǎn)床用于改善液體培育資料的通氣情況及促進(jìn)酶解原生質(zhì)體的解離。普通在液體培育中轉(zhuǎn)速為每分鐘100次左右，在解離原生質(zhì)體時(shí)為每分鐘80左右。10磁力攪拌器磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等。磁力攪拌器還可加熱，使之更利于溶解。11培育架進(jìn)展固體培育和試管苗大量

10、繁衍時(shí),需求有放置培育瓶的培育架。12酸度計(jì)組織培育中培育基pH值的準(zhǔn)確度是非常重要的，該當(dāng)運(yùn)用酸度計(jì)，假設(shè)無(wú)酸度計(jì)，也可運(yùn)用pH試紙進(jìn)展粗測(cè)。13離心機(jī)用于搜集原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)速要求較低。普通為10004000rpm即可。三必要的器皿1、玻璃器皿長(zhǎng)時(shí)間培育和儲(chǔ)存藥液用的玻璃器皿，要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成，而且可以耐高壓滅菌。1培育器皿裝入培育基進(jìn)展植物資料的培育，根據(jù)培育目的和要求不同，可以采用不同種類和規(guī)格的玻璃器皿。試管、三角瓶或錐形瓶、培育皿。通常以紗布包被棉花塞，外面再包一層牛皮紙，用線繩或橡皮筋扎好。如今多采用聚丙烯塑料薄膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了添加通氣性，可在

11、里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便，且通氣好。也可采用公用的封口膜。以到達(dá)防止培育基枯燥和杜絕污染的目的。目前，培育容器和制備培育基所需的玻璃器皿逐漸被塑料器皿所替代。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、本錢低等優(yōu)點(diǎn)，如培育容器多為平底方盒形，可提高培育空間利用率的植株數(shù)，并能一層層地疊摞起來(lái)，從而節(jié)約空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯資料制成，能耐高溫，可進(jìn)展高壓滅菌。有些產(chǎn)品為一次性耗費(fèi)品，不但可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí)間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無(wú)須另外配蓋，運(yùn)用時(shí)比較方便。2盛裝器皿配制培育基時(shí)，各種藥品的溶解，貯藏均需求各種規(guī)格的燒杯、試劑瓶等。大燒杯用于培育基的

12、熔化，本錢高，易破，可以用搪瓷盆替代。2計(jì)量器皿母液的配制、藥液的分裝、汲取需求玻璃計(jì)量器皿，如10ml、25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml的量筒，25 ml、50 ml、100 ml、200 ml、500 ml、1000 ml、2000 ml的容量瓶，以及0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml 、5 ml的移液管，用于配制培育基時(shí)汲取不同種類的母液。應(yīng)多預(yù)備幾支，分開運(yùn)用。3、其他器皿：如滴瓶、稱量瓶、玻璃棒、漏斗、玻璃管、注射器等實(shí)驗(yàn)室常用器皿應(yīng)具備。2、金屬器械報(bào)告：組織培育常用的金屬器械，可選用醫(yī)療器械或微生物實(shí)驗(yàn)所用

13、的器械。1鑷子類：常運(yùn)用醫(yī)療上的鑷子。根據(jù)操作需求有各種類型，假設(shè)用l00ml的三角瓶作為培育瓶，可用20em長(zhǎng)的鑷子。鑷子過(guò)短容易使手接觸瓶口，呵斥污染。鑷子太長(zhǎng)，運(yùn)用起來(lái)不靈敏。2剪刀類：可采用醫(yī)療五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深化到瓶口中進(jìn)展剪切。3解剖刀切割較小資料和分別莖尖分生組織時(shí)，可用解剖刀。刀片要經(jīng)?；Q，使之堅(jiān)持鋒利形狀，否那么切割時(shí)會(huì)呵斥擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培育效果。4接種針用來(lái)轉(zhuǎn)移細(xì)胞和愈傷組織。四實(shí)驗(yàn)器具的洗滌和滅菌1、器皿的清洗植物組織培育最重要的，也是最根本的要求，就是各項(xiàng)操作都應(yīng)從無(wú)毒害、無(wú)污染

14、的培育環(huán)境來(lái)思索。培育過(guò)程中最經(jīng)常、最大量的任務(wù)之一，是洗滌培育瓶及其它常用器皿。在清洗器皿處應(yīng)有較大的水池，水池運(yùn)用水泥制造，白瓷磚砌內(nèi)外外表，池底另放一張橡膠墊，以減少器皿破損。自來(lái)水龍頭宜采用三孔鵝頸式的，用水方便，并在需求時(shí)可加裝抽濾器。下水道應(yīng)暢通，以免妨礙任務(wù)。除水池外，還需輔助以假設(shè)干盆與桶。 最常用的洗滌助劑就是家庭用的洗衣粉及肥皂兩種，備一點(diǎn)去污粉也有些用途。假設(shè)冷的洗衣粉水效能欠佳，可以添加濃度或適當(dāng)加熱。這已可以處置許多清洗中的問題。沒必要運(yùn)用鉻酸-硫酸洗液，由于運(yùn)用這種洗液要非常小心，而且效率也不高。洗瓶時(shí)先將瓶子在清水中泡一會(huì)兒，然后在水龍頭下涮去瓶?jī)?nèi)污物，瀝干水，泡

15、入濃洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷動(dòng)和呈圓周旋轉(zhuǎn)兩個(gè)方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之處。刷后放到水龍頭下用流水沖刷4次，以徹底沖去洗衣粉殘留物。洗好的瓶子應(yīng)透明锃亮，內(nèi)外壁水膜均一，不掛水珠，即表示無(wú)污跡存在。通常無(wú)須乎再用蒸餾水涮一遍，直接置于擱架上瀝晾水汽。也可制造晾洗架，瓶子倒放在孔格中或掛在小木棍上，這樣洗后要擺一遍瓶子，用時(shí)再收一次瓶子。急等運(yùn)用的瓶子可以用烘箱烘干。烘時(shí)緩慢升溫，溫度也無(wú)須太高。新買進(jìn)的瓶子亦可按上述方法處置。移液管之類的儀器，可用橡皮吸球(洗耳球)和熱洗衣粉水吸洗，再放水龍頭下流水沖凈，垂直放置晾干。帶刻度的計(jì)量?jī)x器不宜烘烤，以免玻璃變形，影響計(jì)量的準(zhǔn)確

16、度。如洗后急等運(yùn)用，只需用要吸量的液體吸棄數(shù)次，或用95%酒精吸棄數(shù)次后，即可運(yùn)用。2、滅菌1器皿和器具常用滅菌方法：1、熱壓滅菌法學(xué)習(xí)操作將洗凈的培育器皿，器具，用牛皮紙包好，放入高壓消毒鍋中，1.1壓力下滅菌2030分鐘。2、干熱滅菌法洗凈的玻璃器皿置于電熱枯燥箱中，15040分鐘或120兩小時(shí)，待冷卻后運(yùn)用。二無(wú)菌室滅菌接種室、培育室1、用新潔爾滅擦抺任務(wù)臺(tái)，70%酒精擦拭超凈任務(wù)臺(tái)。2、薰蒸學(xué)習(xí)操作用甲醛、高錳酸鉀提早13天薰蒸密封房間方法1：甲醛倒入蒸發(fā)皿加熱，用量10ml/m2。方法2：甲醛HCHO與高錳酸鉀KMn4以10：1比例混合。3、接種前用7075%酒精噴霧，使飄在空氣中的

17、塵埃堆積下來(lái)。4、用紫外光燈進(jìn)展照射滅菌波長(zhǎng)26502660A最好接種箱及器具3040分鐘。三培育基滅菌略四培育資料滅菌略五任務(wù)人員無(wú)菌操作略三、作業(yè)：簡(jiǎn)述我系組培實(shí)驗(yàn)室中的各儀器及運(yùn)用方法。實(shí)驗(yàn)二 MS培育基母液的配制與保管一、目的要求：經(jīng)過(guò)MS培育基母液的配制與保管，掌握配制與保管培育基母液的根本技藝。二、資料與器具：配制MS培育基所需的藥品、天平、燒杯、容量瓶、量筒、蒸餾水、母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、母液的配制1母液1的配制：稱量：NH4NO3 82.5g，KNO3 95g， MgSO47H2O 18.5g混合：用少量蒸餾水將藥品分別加熱溶解。然后依次混合。定容：加少蒸餾水

18、定容至1000ml，成50倍液。2母液2的配制：稱量：CaCl22H2O 22.0g定容：加蒸餾水定容至500ml，成100倍液。3母液3的配制：稱量：KH2PO48.5g 定容：加蒸餾水定容至500ml，成100倍液。4母液4的配制：稱量：Na2-EDTA 1.865 g , FeSO47H2O 1.390 g , EDTA：乙二胺四乙酸混合：用少量蒸餾水將Na2-EDTA加熱溶解后。再漸漸倒入FeSO4溶液，充分?jǐn)嚢璨⒓訜?分鐘，使其充分螯合。定容：加蒸餾水定容至500ml，成100倍液。5母液5的配制：微量稱量：H3BO30.31g ，NaMoO42H2O 0.0125g，MnSO44H

19、2O 1.115g CuSO35H2O 0.00125g，ZnSO47H2O 0.43g，CoCl26H2O 0.00125gKI0.0415g混合：用少量蒸餾水將藥品分別加熱溶解。然后依次混合。定容：加蒸餾水定容至1000ml，成50倍液。6母液6的配制：微量稱量：肌醇：5.0g，甘氨酸：0.1g,煙酸：0.025g。VB6 (鹽酸吡哆素) 0.025g , VB1鹽酸硫氨素0.005g, 混合：用少量蒸餾水將藥品分別加熱溶解。然后依次混合。定容：加蒸餾水定容至250ml，成200倍液。7植物生長(zhǎng)調(diào)理物質(zhì)母液的配制。微量稱量：生長(zhǎng)素IAA、IBA、NAA、2,4-D或細(xì)胞分裂素(KT、ZT、

20、6-BA)50100mg，0.05g0.1g溶解：生長(zhǎng)素IAA、IBA、NAA、2,4-D可用少量0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，細(xì)胞分裂素(KT、ZT、6-BA) 可用少量0.1mol/L的HCI加熱溶解。定容：將溶解的生長(zhǎng)物質(zhì)一滴滴倒入不斷攪拌的盛有5060ml蒸餾水的小燒杯中，然后倒入100ml容量瓶，用水沖洗小燒杯數(shù)次，最后加蒸餾水定容至100ml配制成濃度為0.51mg/ml的溶液。2、母液的保管1裝瓶：將配制好的母液分別倒入瓶中，貼好標(biāo)簽，注明培育基稱號(hào)、母液號(hào)、配制倍數(shù)或濃度與配制日期。2貯藏：將母液瓶?jī)?chǔ)放在40冰箱內(nèi)備用。實(shí)驗(yàn)三 MS固體培育基的配制 MS培育基是

21、目前運(yùn)用最普遍的培育基。其具有較高的無(wú)機(jī)鹽濃度，可以保證組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長(zhǎng)。由于配方中的離子濃度高，在配制、儲(chǔ)存和消毒等過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不會(huì)影響離子間的平衡。 MS固體培育基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培育，其液體培育基用于細(xì)胞懸浮培育時(shí)能獲得明顯的勝利。MS培育基的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)的數(shù)量和比例比較適宜，足以滿足植物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)上和生理上的需求。因此，普通情況下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分。和其它培育基的根本成分相比，MS培育基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的顯著特點(diǎn)。一、目的和要求：經(jīng)過(guò)MS固體培

22、育基的配制，掌握配制培育基的根本技藝。二、資料與器具：配制MS培育基的各種母液、生長(zhǎng)調(diào)理物質(zhì)母液、瓊脂粉、蔗糖、蒸餾水、移液管量筒、容量瓶、電爐、酸度計(jì)或PH試紙、0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCI、培育瓶、標(biāo)簽、鉛筆等。三、方法與步驟：下面取的量是定容1000ml，每小瓶30ml左右，每人接種4小瓶左右。要多少ml？1、按母液順序和規(guī)定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量的蒸餾水的燒杯中。母液1 20ml 母液2 10ml 母液3 10ml 母液4 10ml母液5 20ml(假設(shè)是800倍的，母液1.25ml+水18.75ml) 母液6 5ml2、參與生長(zhǎng)調(diào)理物質(zhì)：參與的

23、詳細(xì)調(diào)理物質(zhì)與量，視培育物不同而異，有時(shí)也可不加。3、參與固化劑：參與瓊脂7g。4、加糖：放入蔗糖30g。5、定容：參與蒸餾水定容至1000ml。如是固體瓊脂要加熱溶化。6、調(diào)整PH值：經(jīng)酸度計(jì)或PH試紙測(cè)試，用0.1 mol/L的NaOH、0.1 mol/L的HCI把培育基的PH調(diào)整到5.86.0之間。7、培育基分注：把配制好的培育基分注到培育瓶中，100150ml的培育瓶每瓶裝入2025ml左右培育基。分注后立刻加蓋，貼上標(biāo)簽，注明培育基的稱號(hào)和配制時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)四、培育基和培育器具的滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握高溫高壓濕熱滅菌的原理及手提式滅菌鍋滅菌操作流程。 2、 探求影響培育基滅菌效果和

24、凝固效果的主要要素。 二、 實(shí)驗(yàn)原理：培育基和培育器具普通采用高溫高壓濕熱滅菌法來(lái)進(jìn)展滅菌， 其滅菌原理是利用高溫高壓產(chǎn)生的蒸汽殺滅微生物的方法， 由于熱蒸氣具有較強(qiáng)穿透力 ，可使蛋白質(zhì)凝固而到達(dá)滅菌的目的。 培育基高溫高壓濕熱滅菌是壓力在 0. 11-0. 15MPa(溫度為 121-126 ) ， 堅(jiān)持該壓力 15-30 min， 即可到達(dá)滅菌目的。 三、 資料、 儀器與試劑 1、儀器: 高壓滅菌鍋 2、用 具: 集裝框、 手套、 計(jì)時(shí)器 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、洗滌：把組織培育基用 的培育皿、 三角 瓶、 試管等玻璃器皿進(jìn)展徹底清洗。自 然晾干或烘箱枯燥。 2、包扎：用牛皮紙、報(bào)紙、紗布或錫箔

25、紙把玻璃器皿和金屬器械分別包扎好。 3、加水：往鍋里加水至浸沒發(fā)熱管( 切忌干燒! ) 。 4、裝鍋：在滅菌鍋內(nèi) 放入含培育基的培育瓶或三角 瓶、裝蒸餾水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金屬器械等。 5、封鍋、 接通電源: 蓋好鍋蓋， 對(duì)角線擰緊螺旋。封鎖放氣閥和平安閥， 接通電源， 加熱。 6、排冷空氣：當(dāng)壓力到達(dá) 0. 05Mpa 時(shí)，翻開手動(dòng)放氣閥放冷氣， 將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出。 或?qū)⑴艢忾y開著，加熱，直至鍋內(nèi)釋放出大量水蒸氣( 此時(shí)水蒸氣橫向噴出 ) ，再封鎖閥門 。 7、 升溫升壓: 壓力 回零后， 封鎖放氣閥， 繼續(xù)加熱加壓。8、 保溫保壓: 當(dāng)壓力到達(dá) 0. 11Mpa( 溫度

26、為 121 ) 時(shí)開場(chǎng)計(jì)時(shí)，使壓力堅(jiān)持在 0. 11-0. 15Mpa( 121-126 ) 之間，維持15-30min。 ( 假設(shè)滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使培育基中的某些成分變性失效) 9、 斷電降溫、出鍋: 滅菌終了后，斷電， 手動(dòng)緩慢放氣到壓力為 0. 05 Mpa 時(shí)，才干快速放氣，當(dāng)壓力降到“ 0 時(shí)翻開鍋蓋， 取出滅菌物品 。 本卷須知: 1、 培育基中含有大量有機(jī)物， 尤其是含糖量較高，為各種微生物繁殖和繁衍提供極好場(chǎng)所。 因此，培育基配制好必需盡早( 不能超越 24h) 進(jìn)展滅菌，以保證植物組織培育的順利進(jìn)展。2、滅菌鍋運(yùn)用應(yīng)留意: ( 1) 先翻開放氣閥， 再翻開鍋蓋。 ( 以免鍋內(nèi)

27、 壓力 大而爆炸! ) ( 2) 開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培育瓶，使培育瓶冷卻、 凝固 。 普通應(yīng)將滅菌后的培育瓶貯藏于 30 以下的室內(nèi) ， 最好貯藏在 4-10 的條件下。 ( 3) 某些生長(zhǎng)調(diào)理劑如 IAA、 ZT、 ABA 等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的， 不能同培育基一同高壓滅菌， 而需求進(jìn)展過(guò)濾滅菌。 ( 4) 鍋內(nèi)冷氣必需排盡， 以保證滅菌效果。 否那么， 壓力表指針雖指到一定壓力 ， 但由于鍋內(nèi)冷空氣的存在而達(dá)不到要求的溫度， 很難到達(dá)徹底滅菌。 ( 5) 當(dāng)?shù)竭_(dá)一定壓力后， 要嚴(yán)厲遵守滅菌時(shí)間。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使一些化學(xué)物質(zhì)遭到破壞，影響培育基成分; 時(shí)間短那么達(dá)不到徹底滅菌的目的。實(shí)驗(yàn)五

28、 無(wú)菌操作技術(shù)一、目的和要求：經(jīng)過(guò)在超凈任務(wù)臺(tái)上進(jìn)展無(wú)菌操作訓(xùn)練，使學(xué)生初步掌握組織培育的無(wú)菌操作技術(shù)。二、資料與器具：超凈任務(wù)臺(tái)、70%酒精、95%的酒精、盛有培育基的培育瓶已滅菌、接種器械主要指解剖刀、剪刀、鑷子等、酒精燈、培育資料根、莖、葉或種子等、0.1%的升汞或漂白粉、無(wú)菌水等。三、方法與步驟：1、用水和肥皂洗凈雙手，穿上滅菌過(guò)的公用實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。2、翻開超凈任務(wù)臺(tái)和無(wú)菌操作室的紫外燈，照射20分鐘。3、操作前10分鐘使超凈任務(wù)臺(tái)處于任務(wù)形狀，讓過(guò)濾室空氣吹拂任務(wù)臺(tái)面和周圍的臺(tái)壁。4、照射20分鐘后，封鎖紫外燈，5、用70%的酒精燈擦拭任務(wù)臺(tái)和雙手。6、用蘸有70%

29、的酒精的紗布擦拭裝有培育基的培育器皿，放進(jìn)任務(wù)臺(tái)。 7、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，在火焰上滅菌后，放在器械架上。8、把培育資料放進(jìn)70%的酒精中浸泡30秒后。再在0.1%的升汞氯化汞中浸泡10分鐘，或在10%的漂白粉上清液中浸泡1015分鐘，浸泡時(shí)可進(jìn)展攪動(dòng)，使植物資料與滅菌劑有良好的接觸；然后用無(wú)菌水沖洗35次。9、用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶口使瓶口各部分都燒到，翻開瓶口。10、取下接種器械，在火焰上滅菌。11、把培育資料放入培育瓶，蓋上瓶口每人接種510瓶。操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%酒精擦拭任務(wù)臺(tái)和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上滅菌。12、接種終了后，清理和封鎖超凈任務(wù)臺(tái)。防止操作帶來(lái)的污染A、整個(gè)接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)展，且動(dòng)作要迅速正 確 錯(cuò) 誤B、接種過(guò)程中盡能夠到達(dá)懸空要求防止操作帶來(lái)的污染正 確 錯(cuò) 誤C、接種時(shí)不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口防止操作帶