第五章 重組DNA技術ppt課件

1、 第五章 分子生物學技術DNA重組技術及運用現(xiàn)代分子生物學的快速開展，得益于上個世紀中葉以來研討方法、特別是基因操作和基因工程技術的提高。基因操作主要包括DNA分子的切割與銜接、雜交、電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研討的中心技術。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進展繼續(xù)穩(wěn)定的繁衍和表達。基因工程技術是核酸操作技術的一部分，只不過它強調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。現(xiàn)實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細

2、胞之中的才干，是基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征。重組DNA技術開展史上的艱苦事件三大成就：一、在20世紀40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，處理了遺傳的物質(zhì)根底問題；二、50年代提出了DNA分子的雙螺旋構造模型和半保管復制機制,處理了基因的自我復制和世代交替問題；三、50年代末至60年代，相繼提出了“中心法那么和支配子學說,勝利地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與表達機制。5.1 基因操作的根本工具一限制性核酸內(nèi)切酶可以識別DNA上的特定堿基序列并從這個位點切開DNA分子。第一個核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實驗室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識別

3、GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個位點切開并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。 圖5-1 幾種主要DNA內(nèi)切酶所識別的序列及其酶切末端。二基因克隆的載體 我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA銜接酶進展DNA的切割和重組，還遠遠不能滿足基因工程的要求，由于大多數(shù) DNA片段不具備自我復制的才干，只需將他們銜接到具備自主復制才干的DNA分子上，才干在寄主細胞中進展繁衍。載體vector)是指具備自主復制的DNA分子，象病毒、噬菌體和質(zhì)粒等相對分子量較小的復制子均可以作為基因?qū)氲妮d體。載體三要素：自我復制才干；攜帶外源基因片段大小具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)；插入位點多少具有假設干限制

4、酶單一識別位點；易于鑒定識別具有抗菌素抗性基因大腸桿菌質(zhì)粒載體: 1、pSC101質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)嚴緊型復制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細胞僅有12個拷貝。長9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因tetr及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點，在HindIII、BamHI和SalI等3個位點插入外源基因，會導致tetr失活。大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體表示圖。是第一個真核基因克隆載體。缺陷：它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細胞中提取pSC101 DNA，產(chǎn)量很低。2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型

5、復制控制的多拷貝質(zhì)粒。普通情況下，當培育基中氨基酸被耗盡，或是在細胞培育物中參與氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑制，細胞的生長也隨之停頓。而松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復制數(shù)小時，使每個寄主細胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)到達10003000個，占細胞總DNA的50%左右。3、pBR322質(zhì)粒載體由三個不同來源的部分組成的：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因AmpR；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因tetr；第三部分那么來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復制起點ori。AmpR優(yōu)點是具有較小的分子量，其長度為4 363bp。不僅易

6、于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。有較高的拷貝數(shù)，假設經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可累積10003000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。4、pUC質(zhì)粒載體包括四個部分：(i)來自pBR322質(zhì)粒的復制起點ori；(ii)氨芐青霉素抗性基因ampr；(iii)大腸桿菌-半乳糖酶基因lacZ的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此構造特稱為lacZ基因；(iv)位于lacZ 基因中的接近5-端的一段多克隆位點MCS區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ 基因的功能。優(yōu)點： 更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pB

7、R322根底上構建pUC質(zhì)粒載體時，僅保管下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素擴增時，平均每個細胞即可達500700個拷貝。可用組織化學方法檢測重組體。pUC8質(zhì)粒構造中具有來自大腸桿菌lac支配子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用。因此，可用X-gal顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端如EcoRI和BamHI的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。5、 pGEM-3Z質(zhì)粒 長度為2743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因

8、和一個lacZ基因。 含有兩個噬菌體啟動子T7和SP6，為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。參與T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應的mRNA。6、穿越質(zhì)粒載體shuttle plasmid vector 指由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以保證外源DNA序列在不同物種的細胞之間得到擴增，能在原核和真核細胞之間往返穿越，具有廣泛的用途。7、pBluescript噬菌粒載體 pBluescript是指由Stratagene公司開展的一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS+/-

9、，如今那么更多地叫作pBluescript KS+/-或pBluescript SK+/-。SK表示多克隆位點區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向轉(zhuǎn)錄；+/ -表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。f1+起點表示當pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可以回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1-起點那么表示當pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA。(i)在多克隆位點區(qū)MCS的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指點插入在多克隆位點上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；(ii)具有單鏈噬菌體

10、M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質(zhì)粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制方式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；(iii編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標志；(iv)含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法挑選噬菌粒載體的重組子。LacZ編碼-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的-肽， IPTG異丙基- -D-硫代半乳糖苷誘導該基因表達，合成的-半乳糖苷酶-肽能與宿主細胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶相互補，產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，能水解外源參與培育基中的X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷，生成藍色的溴氯吲哚，使生長于含X-gal培育基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍色。重組DNA操作過程表示圖圖5-2 DNA銜接酶能把不同的DNA片段銜接成一個整體 僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA銜接酶進展DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只需將它們銜接到具備自主復制才干的DNA分子上，才干在寄