細胞培養(yǎng)培訓

1、細胞培養(yǎng)培訓2009-6-121常用設備 液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱、水浴鍋、4冰箱 2無菌室的滅菌1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3來蘇水或者新潔爾滅或者0.5過氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射3無菌室的滅菌3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實驗后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）

2、擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。4實驗人員的無菌準備1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩。3.用75酒精棉球擦凈雙手。5無菌操作的演示 1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精燈火焰操作。3.器皿使用前必須過火滅菌6無菌操作的演示 4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。 7細胞培養(yǎng)用液的配制與消毒 細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水

3、或純凈水 8青、鏈霉素溶液的配制與消毒 1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。 2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。 3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位1微克？9RPMI1640的制備與消毒1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,

4、使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。 10RPMI1640的制備與消毒2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。 3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。 4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4冰箱內(nèi)待用。 5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4時兩周有效）。 11血清的滅活 細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過過濾方可加入培養(yǎng)基中使

5、用。 12谷氨酰胺合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4下放置1周可分解50，故應單獨配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。 13谷氨酰胺一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為14mol/L。可以配制200mol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小

6、瓶，-20保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 14細胞傳代培養(yǎng)（消化法）一.傳代前準備： 1.預熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內(nèi)預熱。2.用75酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。 3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。 4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。 15細胞傳代培養(yǎng)（消化法） 5.準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。 6.取出預熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。 7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要

7、旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。 8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。 16細胞傳代培養(yǎng)（消化法）吹打分散細胞1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液。 2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。 3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。 4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。17細胞傳代培養(yǎng)（消化法）繼續(xù)培養(yǎng)： 用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶

8、底面積25時為一個，占50為，占75時為。 18細胞傳代培養(yǎng)（消化法）傳代細胞培養(yǎng)注意事項： 1.嚴格的無菌操作 2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。 19細胞的復蘇 細胞復蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196液氮中的細胞快速融化至37，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。20細胞的復蘇一.實驗前準備： 1.將水浴鍋預熱至37 2.用75酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。 3.在超凈工作

9、臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。 21細胞的復蘇二取出凍存管： 1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。 2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。22細胞的復蘇三迅速解凍： 1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。 2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。四.平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min23細胞的復蘇五.制備細胞懸液： 1.吸棄上清液。2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。六.培養(yǎng)細胞 將復合細

10、胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37和5CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。24初學者易犯錯誤1水浴鍋未預熱或者未預熱到37。 2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。25細胞的凍存 1.先將凍存管放入4冰箱，約40min。 2.接著置于-20冰箱，約30-60min。 3.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。 4.置于液氮罐中長期保存。 5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。 26細胞的凍存注意事項： 1.使用DMSO前，不需要進行高壓