DNA計(jì)算中的熒光技術(shù)應(yīng)用及發(fā)展上課講義

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。DNA計(jì)算中的熒光技術(shù)應(yīng)用及發(fā)展-DNA計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展張成楊靜王淑棟(北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，高可信度軟件技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100871)摘要：DNA計(jì)算作為前沿科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，已經(jīng)從簡(jiǎn)單發(fā)展為復(fù)雜，從理論轉(zhuǎn)化為應(yīng)用。在這一過(guò)程中，反應(yīng)速度快，變化靈敏的熒光標(biāo)記技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。本文圍繞DNA計(jì)算和熒光標(biāo)記技術(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行說(shuō)明。一方面，對(duì)近年來(lái)DNA計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)：（1）熒光標(biāo)記的表面計(jì)算。（2）與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測(cè)。（3）與DNA鏈置換相結(jié)合

2、的熒光技術(shù)。（4）與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門。（5）與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)。（6）與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)。另一方面，介紹了幾種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型熒光技術(shù)：（1）熒光信號(hào)識(shí)別放大技術(shù)。（2）與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)。（3）與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)。（4）與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù)。在今后的研究中，只有將這兩者緊密結(jié)合，才能發(fā)揮DNA計(jì)算天然的優(yōu)勢(shì)。關(guān)鍵詞：DNA計(jì)算；熒光標(biāo)記技術(shù)；納米技術(shù)；DNA分子；雜交1引言DNA由于其具有的特性，在大自然的進(jìn)化中，被選擇為穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)。在細(xì)胞中，DNA精細(xì)地編碼并控制著整個(gè)細(xì)胞的新陳代謝。另一方面，

3、DNA分子容易構(gòu)成二級(jí)甚至三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，DNA作為計(jì)算工具有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)1,2。近年來(lái)，DNA計(jì)算領(lǐng)域發(fā)展迅速，尤其在DNA分子自組裝、DNA納米裝置等方面3。然而伴隨著DNA計(jì)算解決問(wèn)題的規(guī)模增大和形式多樣化，求解過(guò)程中DNA分子數(shù)量急劇增加以及DNA分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的加大，求解過(guò)程中實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣且存在誤差，使得DNA計(jì)算中解的標(biāo)記和檢測(cè)變得更加困難4。為了解決這一難題，熒光技術(shù)在DNA計(jì)算中逐漸得到了廣泛的應(yīng)用。熒光是指某些物質(zhì)受到某種波長(zhǎng)的光激發(fā)后，其原子中的電子被激發(fā)到較高能級(jí)，產(chǎn)生的發(fā)射光。熒光物質(zhì)分子都具有剛性結(jié)構(gòu)和共平面的-共軛體系。在激發(fā)態(tài)時(shí)，這種結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性，可以持續(xù)數(shù)

4、秒鐘，從而有利于能量的轉(zhuǎn)移5。DNA熒光技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)有很多應(yīng)用，如近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的DNA熒光標(biāo)記、real-time檢測(cè)技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)等。熒光標(biāo)記DNA簡(jiǎn)單便捷，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)，而且靈敏度非常高，這些特點(diǎn)都使得其在DNA計(jì)算中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，結(jié)合熒光技術(shù)的DNA計(jì)算已經(jīng)成為前沿研究熱點(diǎn)。熒光技術(shù)在DNA計(jì)算中的應(yīng)用主要有如下幾類：（1）熒光標(biāo)記的表面計(jì)算：通過(guò)DNA固定化和雜交技術(shù)，在固相表面通過(guò)熒光標(biāo)記進(jìn)行計(jì)算。（2）與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測(cè)：利用特定酶與DNA分子的特性，通過(guò)檢測(cè)酶切后熒光量進(jìn)行計(jì)算。（3）與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)：巧妙利用DNA分子的三鏈

5、甚至多鏈結(jié)構(gòu)，通過(guò)加入引發(fā)鏈，來(lái)釋放另一DNA鏈。（4）與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門：利用RNAi技術(shù)控制表達(dá)熒光蛋白，從而構(gòu)建了多重邏輯門。（5）與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)：在DNA自組裝結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光標(biāo)記技術(shù)。（6）與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)：通過(guò)DNA分子的不同狀態(tài)，構(gòu)建了可控的熒光納米裝置。近年來(lái)，熒光技術(shù)不僅應(yīng)用于生物學(xué)本身，而且在DNA計(jì)算、信息學(xué)等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。下面有幾種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型熒光技術(shù)：（1）熒光信號(hào)識(shí)別放大技術(shù)。（2）與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)。（3）與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)。（4）與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合

6、的熒光技術(shù)。相信隨著DNA計(jì)算和熒光技術(shù)的發(fā)展，這兩者必將緊密結(jié)合，使得DNA計(jì)算的種類和方法更加多樣和成熟。2DNA計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用2.1熒光標(biāo)記的表面計(jì)算DNA表面計(jì)算其基本原理是：通過(guò)DNA固定化和雜交技術(shù)，將代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通過(guò)多次的雜交以及降解過(guò)程來(lái)篩選正解。通過(guò)熒光標(biāo)記可以檢測(cè)每次和最終計(jì)算的結(jié)果。2002年，Adleman組使用雜交池完成了一個(gè)20個(gè)變量的3可滿足性問(wèn)題6。2004年XingPingSu等在2000年Liu7的工作基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種通用型的DNA表面計(jì)算模型8。同年，KristianeA.Schmidt等利用單分子雜交熒光

7、標(biāo)記技術(shù)4個(gè)變量的可滿足性問(wèn)題9。下面以2000年，Liu等發(fā)表在nature上的DNA表面計(jì)算經(jīng)典實(shí)驗(yàn)為例，說(shuō)明其解決SAT問(wèn)題的過(guò)程7。由于該問(wèn)題共有16種可能性，故將代表著不同可能解的DNA片段固定在固相表面。在每一次的雜交篩選過(guò)程中，加入與固定DNA鏈特異性互補(bǔ)的DNA。那末，被雜交的固定DNA鏈變?yōu)殡p鏈，而未互補(bǔ)的單鏈DNA則被核酸外切酶降解。通過(guò)數(shù)次操作，存在于固相表面的DNA鏈就是每次經(jīng)雜交而保留下來(lái)的DNA鏈，也就是代表正解的DNA鏈。該實(shí)驗(yàn)中，熒光技術(shù)主要應(yīng)用在解檢測(cè)的過(guò)程中：使用一條生物素標(biāo)記的引物和另一條熒光標(biāo)記的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段為模版，進(jìn)行PCR。

8、利用磁珠將PCR雙鏈產(chǎn)物吸附，再分離雙鏈，分離出熒光標(biāo)記的ssDNA。將這些ssDNA與經(jīng)過(guò)多次雜交篩選的固相雜交，只有哪些存留在固相表面的DNA鏈可以雜交上，于是特定的位置就可以檢測(cè)到較高熒光強(qiáng)度。圖1-1實(shí)驗(yàn)示意圖圖1-2列陣熒光檢測(cè)結(jié)果2.2與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測(cè)利用酶與DNA分子的特性，通過(guò)檢測(cè)酶切后熒光量進(jìn)行計(jì)算。其實(shí)就是利用某些酶與DNA分子空間結(jié)構(gòu)的相互作用，再結(jié)合熒光技術(shù)來(lái)共同實(shí)現(xiàn)的。這種方法具有靈敏度高，反應(yīng)速度快等特點(diǎn)。其最大的優(yōu)點(diǎn)就是巧妙地將酶的生物特性與計(jì)算問(wèn)題相結(jié)合，極大地豐富了DNA計(jì)算的手段。2001年，Wang等在上述表面計(jì)算實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)解的檢測(cè)又進(jìn)行

9、了新的改進(jìn)，即將酶切和熒光技術(shù)相結(jié)合10。通過(guò)上述核酸外切酶的方法，利用新技術(shù)完成單鏈DNA的解的檢測(cè)。其基本思想如下：左側(cè)DNA探針的3端至少和右側(cè)雜交的DNA探針有一個(gè)堿基的重合，并使得右側(cè)探針有5端呈單鏈狀態(tài)。此時(shí)右側(cè)探針由兩部分組成：一部分是和目標(biāo)序列形成雙鏈的；另一部分則是由非互補(bǔ)的5端DNA鏈組成（見(jiàn)圖2A）。此時(shí)該非互補(bǔ)的5端DNA臂會(huì)覆蓋在上游寡核苷酸鏈上，與左側(cè)探針至少有一個(gè)重合的堿基。恰恰在這重合的位置，可以形成酶切位點(diǎn)。因此，非互補(bǔ)的5端DNA臂可以被切割而釋放。利用這一原理，結(jié)合熒光技術(shù)，如圖所示，將熒光基標(biāo)記在非互補(bǔ)DNA鏈的5端，而將熒光淬滅基標(biāo)記在重合的酶切位點(diǎn)3

10、端方向（見(jiàn)圖2B）。這樣，只要酶切位點(diǎn)被酶切，標(biāo)記有熒光基的非互補(bǔ)的5端DNA鏈就會(huì)被釋放，從而與熒光淬滅基分離，使得熒光釋放量大大提高。這種方法可以有效檢測(cè)目的片斷是否存在。文中還將PCR方法檢測(cè)目的片斷與這種熒光檢測(cè)法進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該方法比PCR檢測(cè)具有更高的靈敏度。圖2實(shí)驗(yàn)原理示意圖圖3幾種邏輯門的構(gòu)成示意圖MilanN.等2003年研制了一種名為MAYA的游戲。這是一種利用特殊的DNA酶E6（一種依賴于DNA的RNA酶）構(gòu)建起來(lái)的邏輯門11。這種酶識(shí)別的DNA底物要求具有特殊結(jié)構(gòu)（如3a圖所示）。只有當(dāng)上部寡核苷酸探針與E6的支架區(qū)互補(bǔ)，上部寡核苷酸才能被切斷釋放。將寡核苷酸兩端分別

11、標(biāo)記熒光淬滅基（如羅丹明）和熒光基，那末只有寡核苷酸探針被切斷釋放，熒光基才能有效激活并釋放熒光。這是MAYA游戲進(jìn)行邏輯判斷的主要檢測(cè)手段。構(gòu)建有效的空間位阻是實(shí)現(xiàn)這個(gè)檢測(cè)手段的關(guān)鍵。當(dāng)寡核苷酸探針的結(jié)合使綠色標(biāo)記的位阻消失的時(shí)候，加速酶切反應(yīng)；當(dāng)寡核苷酸探針的結(jié)合使紅色標(biāo)記的位阻消失的時(shí)候，降低酶切反應(yīng)?；谝陨显?，構(gòu)建出以下幾種邏輯門：YES型、NOT型、AND型和AND-AND-NOT型。YES型邏輯門（圖3b所示），當(dāng)i1寡核苷酸加入時(shí)，消除原來(lái)i1環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而標(biāo)記的熒光探針可以與之結(jié)合，并且被切除釋放。其判斷過(guò)稱為加入i1，熒光輸出。NOT型邏輯門（圖c所示）。當(dāng)加入i6時(shí)，環(huán)

12、狀結(jié)構(gòu)打開(kāi)，熒光結(jié)合的寡核苷酸探針無(wú)法結(jié)合在互補(bǔ)區(qū)域，于是無(wú)熒光輸出。其判斷過(guò)程為加入i6，熒光輸出停止。AND型邏輯門（圖d所示）實(shí)際上是將兩個(gè)YES型邏輯門組裝在一起。也就是說(shuō)，只有當(dāng)i1和i6都被加入時(shí)，才能有熒光輸出。AND-AND-NOT型邏輯門（圖e）是更為復(fù)雜的組合體。必須同時(shí)加入i1和i3，才能輸出熒光。然而，只要有i6存在，就不會(huì)輸出熒光。文中解決的問(wèn)題是在33的棋盤中完成3個(gè)棋子同線相連?？疾焖械倪壿嬊闆r后，將所有可能的邏輯門都提前置于棋盤的網(wǎng)格中。再將代表棋子的寡核苷酸分別放入，然后觀察熒光輸出情況進(jìn)行判斷。2.3與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)該技術(shù)多用來(lái)構(gòu)建DNA邏輯

13、門。其巧妙利用DNA分子的粘貼，通過(guò)加入引發(fā)鏈，來(lái)釋放另一DNA鏈。在邏輯計(jì)算中，這種技術(shù)具有循環(huán)性、自引發(fā)性、反饋性、靈敏性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)。近年來(lái)在science等高水平科研雜志上都發(fā)表了大量系列工作，而且在生物檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的實(shí)際應(yīng)用前景。2000年，BernardYurke構(gòu)建了一種DNA鏈置換機(jī)器，在置換過(guò)程中可以實(shí)現(xiàn)閉合式運(yùn)動(dòng)12。2003年，B.Yurke等構(gòu)建了一種基于DNA鏈置換的納米機(jī)器13。Jong-ShikShin等利用可反復(fù)的DNA鏈置換，構(gòu)建了可以反復(fù)讀取和輸入的三狀態(tài)存儲(chǔ)器14。2006年，GeorgSeelig等對(duì)DNA鏈相互粘貼、置換的幾種模式進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)15。

14、2006年，SimonJ.Green等用莖環(huán)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了DNA鏈的粘貼互換16。2007年，DavidYuZhang等實(shí)現(xiàn)了DNA鏈置換的循環(huán)進(jìn)行17。2007年,suvirvenkataraman等實(shí)現(xiàn)了通過(guò)DNA鏈自粘貼來(lái)完成多段DNA聚合延伸18。下面介紹兩個(gè)具有代表性的工作。2006年，Georgseelig等報(bào)道了一種沒(méi)有酶參與的DNA邏輯門19。其基本原理如圖4-1所示，即先構(gòu)建好由寡核苷酸鏈G、Eout、F共同雜交組成的DNA互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，再加入Gin寡核苷酸鏈。此時(shí)，由于Gin一側(cè)末端和G的一側(cè)單鏈末端互補(bǔ)，從而使邏輯門中的G寡核苷酸鏈被釋放，與Gin形成互補(bǔ)雙鏈。此時(shí)的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)中，

15、只剩下了寡核苷酸鏈Eout和F。然后再加入Fin寡核苷酸鏈，F(xiàn)in的一側(cè)末端與F中間有互補(bǔ)序列，加之Eout本身形成的是單鏈環(huán)狀的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，于是，F(xiàn)和Fin結(jié)合成雙鏈。Eout寡核苷酸鏈被釋放。文中使用了熒光標(biāo)記地對(duì)Eout的釋放情況進(jìn)行了檢測(cè)（如圖4-2所示）。Eq末端標(biāo)記有熒光基，而Ff末端標(biāo)記有熒光淬滅基。當(dāng)其互補(bǔ)結(jié)構(gòu)存在時(shí)，熒光恰被淬滅，從而無(wú)法檢測(cè)。但是，當(dāng)Eq和Ff分離時(shí)，熒光就被釋放出來(lái)，從而表明DNA鏈的分離情況。上述由G、Eout、F的DNA互補(bǔ)結(jié)構(gòu)就可以構(gòu)成與門。也就是說(shuō)，只有同時(shí)加入Gin和Fin，才能誘發(fā)釋放出熒光。值得注意的是，文章并不只是提出這種DNA計(jì)算邏輯門，

16、而是將其應(yīng)用到生物基因檢測(cè)的中。在鼠腦總RNA中，成功的檢測(cè)了數(shù)個(gè)基因的表達(dá)情況。圖4-1鏈置換原理示意圖圖4-2熒光標(biāo)記原理示意圖2008年，PengYin等對(duì)這種DNA自粘貼、鏈置換進(jìn)行了更為精細(xì)的研究20。其主要原理是利用DNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的鏈置換。如圖5-1所示，莖環(huán)結(jié)構(gòu)A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列構(gòu)成的，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)末端有未互補(bǔ)的單鏈DNA區(qū)域。如果加入與末端單鏈DNA互補(bǔ)的序列，整個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)就會(huì)打開(kāi)（圖中的at與at*可以互補(bǔ)，其它同理）。因此，當(dāng)體系中只加入A、B這兩種莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，相互之間無(wú)任何影響。但是，當(dāng)體系中加入了寡核苷酸鏈I后，就觸發(fā)了整個(gè)循環(huán)。I先和A末端互

17、補(bǔ)，使得A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)。此時(shí)，A的Bt區(qū)域與B的Bt*相互作用，使得B的莖環(huán)打開(kāi)。當(dāng)B完全打開(kāi)后，B的a*區(qū)域會(huì)與I競(jìng)爭(zhēng)A的a區(qū)域形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。被置換掉的I就可以重新激發(fā)新的循環(huán)。在上述基礎(chǔ)之上，PengYin等設(shè)計(jì)了多種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)：直線型、回路型、支架型、自動(dòng)位移型（見(jiàn)圖5-2）。直線型指I與A、B、C組件是逐級(jí)觸發(fā)，形成串聯(lián)關(guān)系?；芈沸椭竻⑴c的激發(fā)物在循環(huán)結(jié)束后又被釋放，從而再次作用于系統(tǒng)。并且構(gòu)建了多個(gè)循環(huán)相互鑲嵌的復(fù)雜體系。支架型指在整個(gè)觸發(fā)過(guò)程中，不僅是線性的作用方向，而且是向二維平面的擴(kuò)展。自動(dòng)位異型則是用鏈置換實(shí)現(xiàn)了特定DNA序列的位移。在這些實(shí)驗(yàn)中，熒光技術(shù)發(fā)揮了重要的作

18、用。其中主要是將熒光基標(biāo)記在莖環(huán)的一端，另一端則標(biāo)記有熒光淬滅基。只有莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開(kāi)，才能夠檢測(cè)到相應(yīng)的熒光。根據(jù)標(biāo)記不同的熒光，可以了解整個(gè)循環(huán)的反應(yīng)速度，和反應(yīng)程度。尤其是在自動(dòng)位移型實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)檢測(cè)熒光，可以得知特定DNA序列在特定時(shí)間移動(dòng)的位置。圖5-1莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA置換原理回路型直線型自動(dòng)位移型支架型圖5-2幾種復(fù)雜類型：直線型、回路型、支架型、自動(dòng)位移型2.4與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門2007年，keller等創(chuàng)造性地使用活體細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)，通過(guò)控制特異基因的表達(dá)，構(gòu)建多重邏輯門。這種技術(shù)將DNA計(jì)算和基因表達(dá)、疾病診療有機(jī)的結(jié)合在一起，為DNA計(jì)算的應(yīng)用指出了另

19、一方向21。RNAi技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的特異性沉默基因技術(shù)，其基本原理就是將想敲除的基因序列或者部分序列構(gòu)建到特定載體中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄，形成部分序列的反義RNA（還可以通過(guò)直接加入特異的反義短寡核苷酸進(jìn)行基因敲除）。這些RNA很快就可以被酶解為小片段，并與相關(guān)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。于是，這種復(fù)合體就可以根據(jù)RNA來(lái)識(shí)別特定的mRNA，從轉(zhuǎn)錄水平消除特定基因。keller等利用載體序列的線形串聯(lián)排列以及基因表達(dá)的調(diào)控原理（非翻譯區(qū)UTR對(duì)下游基因轉(zhuǎn)錄的影響），構(gòu)建了多個(gè)邏輯門模型。（1）或門，如圖6-1a所示，mRNA1和mRNA2分別與熒光蛋白基因串聯(lián)。這兩個(gè)mRNA只要有一個(gè)正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，就會(huì)有

20、熒光蛋白輸出。因此，形成了“或”的關(guān)系。（2）與門，如圖6-1b所示，TargetA、TargetB序列是串聯(lián)分布。假設(shè)有A、B兩種內(nèi)源物分別抑制siRNA-A和siRNA-B對(duì)TargetA、B的影響。那末只有同時(shí)加入A、B時(shí)，才能完全抑制RNAi作用，也就是說(shuō)，此時(shí)熒光蛋白才能正常表達(dá)。因此A和B形成“與”的關(guān)系。（3）非門，如圖6-1c所示，假設(shè)內(nèi)源物A對(duì)siRNA-NOT（A）有激活作用。當(dāng)加入A后，將會(huì)抑制Target-NOT（A）的表達(dá)，此時(shí)直接導(dǎo)致熒光蛋白產(chǎn)物的減少。將這些簡(jiǎn)單的邏輯門組合起來(lái)，就可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的邏輯運(yùn)算，如（AANDCANDE）OR（NOT（A）ANDB），見(jiàn)圖6

21、-1d。首先確定A、B、C、E與各個(gè)siRNA之間的關(guān)系，如：加入A抑制siRNA-A，促進(jìn)siRNA-NOT（A）。當(dāng)A、B、C、E共同作用時(shí)，就可以根據(jù)基因排列的線性關(guān)系自動(dòng)進(jìn)行邏輯判斷。圖6-1RNAi邏輯門示意圖在上述一步完成的RNAi邏輯門的基礎(chǔ)上，還構(gòu)建了二層邏輯門。所謂一步完成是指加入的siRNA直接發(fā)生作用，降低熒光基因的表達(dá)。而二層邏輯門是指首先調(diào)控一級(jí)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，再由一級(jí)蛋白質(zhì)來(lái)調(diào)控二級(jí)熒光蛋白基因的表達(dá)。如圖a所示，構(gòu)建了AND運(yùn)算邏輯門。mRNA1和mRNA2的表達(dá)都下降才能最大限度地減少Lac抑制子的表達(dá)，從而減小Lac抑制子對(duì)熒光蛋白的表達(dá)抑制。這種多層邏輯門與細(xì)胞

22、內(nèi)的蛋白、基因調(diào)控極為相似，因此在疾病診療方面有著廣闊的應(yīng)用前景。圖6-2二層邏輯門示意圖2.5與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)DNA自組裝是近期發(fā)展迅速的領(lǐng)域，也是具有應(yīng)用前景的領(lǐng)域。其涉及編碼、雜交、空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等多個(gè)方面。從自組裝結(jié)構(gòu)上分，自組裝可分為一維線段結(jié)構(gòu)、二維平面結(jié)構(gòu)和三維立體結(jié)構(gòu)。在DNA自組裝結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)，發(fā)展了很多精巧的DNA三維結(jié)構(gòu)，如2008年RussellPGoodman等構(gòu)建的四面體，其邊還可以產(chǎn)生熒光標(biāo)記的可伸縮莖環(huán)22。這些三維結(jié)構(gòu)不僅僅包含有圖像、結(jié)構(gòu)信息，而且還能隨著結(jié)構(gòu)的變化應(yīng)用于納米技術(shù)、藥物載體、DNA計(jì)算等方面。2008年Y

23、ossiWeizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術(shù)緊密結(jié)合的一個(gè)例子23。首先，利用DNA分子互補(bǔ)，將兩環(huán)相接觸部分的DNA序列設(shè)計(jì)為互補(bǔ)，雜交后再經(jīng)連接酶連接，就形成了穩(wěn)定的環(huán)鏈結(jié)構(gòu)。通過(guò)AFM電鏡檢測(cè)，也能夠看到環(huán)鏈結(jié)構(gòu)的存在。另外，將一個(gè)環(huán)狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應(yīng)頭上，而與其有互補(bǔ)序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。當(dāng)雜交并且被連接后，其感應(yīng)力較未被連接有了顯著提高，側(cè)面說(shuō)明環(huán)套結(jié)構(gòu)的存在。在此基礎(chǔ)上，還設(shè)計(jì)了將DNA環(huán)分別固定在兩個(gè)金微粒（1.4nm）上，然后利用內(nèi)切酶進(jìn)行切割分離的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這些操作都可以在環(huán)套結(jié)構(gòu)上成功實(shí)現(xiàn)。除了上述電鏡檢測(cè)外

24、，YossiWeizmann等還利用熒光技術(shù)進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，如圖A所示，將四甲基羅丹明標(biāo)記在短寡核苷酸上，通過(guò)雜交，形成環(huán)套和多個(gè)短寡核苷酸復(fù)合物。在電鏡下，可以觀察到柱狀熒光條帶。然后，使用四甲基羅丹明標(biāo)記的凝血酶，當(dāng)凝血酶結(jié)合在環(huán)套的側(cè)面時(shí)，利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA，并伴有多節(jié)膨大結(jié)構(gòu)。同時(shí)，還對(duì)環(huán)套結(jié)構(gòu)進(jìn)行了類似的雙熒光探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因?yàn)橹挥挟?dāng)兩個(gè)熒光基和淬滅基的距離小于5nm時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，因此，也說(shuō)明環(huán)套結(jié)構(gòu)是有序排列存在的。圖7-1環(huán)鏈結(jié)構(gòu)組成圖7-2熒光段寡核苷酸和凝血酶標(biāo)記的環(huán)鏈圖7-3DNA盒子蓋開(kāi)閉示意圖2009年E

25、bbeS.Andersen等巧妙地將DNA熒光技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)納米裝置開(kāi)啟和閉合24。為了檢測(cè)DNA分子納米盒子的蓋子的開(kāi)閉，分別在蓋子和盒體上標(biāo)記了Cy3和Cy5熒光染料（見(jiàn)圖7-3）。當(dāng)加入“鑰匙”DNA鏈時(shí)，盒子蓋打開(kāi)，兩個(gè)熒光分子分開(kāi)。此時(shí)，Cy3的熒光信號(hào)增加，而Cy5熒光信號(hào)下降。在該實(shí)驗(yàn)中，利用熒光信號(hào)增減可以有效地檢測(cè)DNA納米裝置的空間變化。2.6與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)通過(guò)DNA分子的不同狀態(tài)，構(gòu)建可控的熒光納米裝置。隨著DNA分子的變構(gòu)，其熒光強(qiáng)度也隨之變化。因此，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度就可以知道DNA分子的構(gòu)象變化。1999年，Mao等構(gòu)建了一種基于DNA分子變構(gòu)的納米裝置

26、25。其應(yīng)用的原理就是B、Z型DNA的相互轉(zhuǎn)換。B-DNA就是我們所熟悉的右手螺旋結(jié)構(gòu)。但是，對(duì)于含有多個(gè)GC的重復(fù)序列，當(dāng)離子濃度發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)伸展為左旋結(jié)構(gòu)。如圖8-1所示的DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)是由三條鏈組成的。其中，藍(lán)色的兩條鏈相同。在每個(gè)連接的轉(zhuǎn)折處都由4的相連的T組成。在這個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)的中部，也就是黃色標(biāo)記的序列，其中含有多個(gè)GC的重復(fù)序列。當(dāng)改變離子濃度時(shí)，該區(qū)域就會(huì)伸展成為左旋結(jié)構(gòu)。將熒光發(fā)射基和接收基固定在如下所示位置（圓點(diǎn)）。那末只有當(dāng)復(fù)合結(jié)構(gòu)是B-DNA時(shí)，才能通過(guò)能量轉(zhuǎn)移激發(fā)出熒光。當(dāng)其為Z-DNA時(shí)，由于兩個(gè)基團(tuán)距離加大，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移。圖8-2為B、Z型DNA轉(zhuǎn)換時(shí)其

27、能量轉(zhuǎn)移的變化。圖8-1DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)變構(gòu)示意圖圖8-2DNA轉(zhuǎn)換時(shí)其能量轉(zhuǎn)移3近期熒光技術(shù)的新發(fā)展熒光技術(shù)發(fā)展速度很快，在DNA計(jì)算、信息學(xué)、物理學(xué)等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。下面介紹幾種近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型熒光技術(shù)，希望能為DNA計(jì)算提供新的思路。（1）熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)；（2）與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)（3）與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)；（4）與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù)。3.1熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)分子信標(biāo)技術(shù)是目前較為成熟的技術(shù)，尤其是在檢測(cè)方面有著重要的應(yīng)用。但是當(dāng)檢測(cè)物很少時(shí)，分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光就不足以被檢測(cè)，甚至發(fā)生錯(cuò)誤信號(hào)。2008年，GaryKGeis

28、s等報(bào)道了一種基因表達(dá)的多色熒光分析系統(tǒng)26。其中使用了固定化、探針捕捉、多色熒光標(biāo)記等多種技術(shù)。2005年，ErnestK.Lewis等設(shè)計(jì)了能同時(shí)激發(fā)多種熒光的方法，使得DNA檢測(cè)速度以及準(zhǔn)確度都大大提高27。2008，JianweiJefferyLi等提高了熒光分子信標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度28。其原理（如圖9-1所示）就是先通過(guò)普通的分子信標(biāo)雜交過(guò)程，待分子雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)后，此時(shí)，加入特異的缺刻DNA酶，即將因雜交而展開(kāi)的分子信標(biāo)切斷，并釋放。從而，再進(jìn)行新的一輪分子信標(biāo)雜交釋放。那末熒光信號(hào)就會(huì)積累增多。在此基礎(chǔ)上，還建立了一種加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)（如圖9-2所示）。首先，與目標(biāo)片斷

29、互補(bǔ)的單鏈DNA雜交，再使用連接酶進(jìn)行連接成環(huán)。隨后，利用DNA聚合酶29以環(huán)狀DNA為模板，加入單引物進(jìn)行PCR。在隨后擴(kuò)增的線性模板上，就含有多處目標(biāo)片斷。此時(shí)，再進(jìn)行上述的熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大。就可以大大提高信號(hào)強(qiáng)度。圖9-1熒光信號(hào)積累原理圖9-2加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大原理3.2與磁珠技術(shù)相結(jié)合的DNA檢測(cè)熒光技術(shù)磁珠技術(shù)，使得DNA分子的捕捉和釋放變?yōu)榭赡?。通過(guò)DNA特異性雜交，可以特異性的獲取DNA分子。2005年，HuiXu等就將磁珠技術(shù)與熒光技術(shù)相結(jié)合，建立新型的DNA檢測(cè)系統(tǒng)29。首先，將標(biāo)記生物素的DNA1與磁珠相結(jié)合。通過(guò)目標(biāo)DNA3，可以使DNA1、2、3相互雜交，

30、形成復(fù)合體。在DNA3上標(biāo)記有熒光集團(tuán)。通過(guò)磁珠分離，將捕獲的DNA2和目標(biāo)DNA3洗脫。由于DNA分子本省帶有負(fù)電荷，于是可以與帶有正電荷的水溶性聚乙烯（被標(biāo)記有特殊基團(tuán)）吸附。此時(shí)就會(huì)產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生熒光，并被檢測(cè)（如圖10所示）。圖10與磁珠技術(shù)相結(jié)合的DNA檢測(cè)熒光技術(shù)原理3.3與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)DNA的構(gòu)象會(huì)隨著PH值的變化而改變。利用這一特性，2005年，DongShengLiu等構(gòu)建了一種隨PH值變化的DNA熒光裝置30。整個(gè)裝置是由DNA寡核苷酸陣列構(gòu)成的。在每個(gè)寡核苷酸的5端標(biāo)記有-SH，隨后是由-CCCC-4個(gè)胞嘧啶組成的DNA序列，在3端標(biāo)記有若丹明

31、綠色熒光基團(tuán)。每個(gè)DNA寡核苷酸被固定在金表面。當(dāng)PH值較低時(shí)（4-9之間），有些胞嘧啶會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，從而與其他胞嘧啶產(chǎn)生分子間非經(jīng)典配對(duì)。此時(shí)，寡核苷酸鏈就會(huì)形成蜷縮狀結(jié)構(gòu)，而不會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交（如圖11-1所示）。在這種狀態(tài)下，熒光集團(tuán)非常靠近金表面（約1nm），此時(shí)就不能被激發(fā)光激發(fā)。隨著PH值的增大，胞嘧啶質(zhì)子化程度降低，其分子間非經(jīng)典配對(duì)也隨之降低。若加入互補(bǔ)鏈，在金表面，展開(kāi)的寡核苷酸會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交，使得寡核苷酸3端的熒光集團(tuán)遠(yuǎn)離金表面（約8nm）。當(dāng)有激發(fā)光激發(fā)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生綠色熒光，實(shí)驗(yàn)還證實(shí)這種熒光的變化是可逆的。通過(guò)控制PH值，可以有效地進(jìn)行熒光變化。圖11-1原理圖圖11-2

32、隨著PH值熒光可逆地進(jìn)行變化。a：PH值4.5；b：PH值9.0；：PH值4.5；：PH值4.5；3.4與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù)miRNAs在真核生物的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。但是miRNAs的含量很低，檢測(cè)起來(lái)比較困難。結(jié)合DNA寡核苷酸微列陣技術(shù)、熒光技術(shù)、酶切、酶聯(lián)技術(shù)，2004年P(guān)eterTNelson等發(fā)明了一種稱為RAKE的檢測(cè)miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列陣。每個(gè)寡核苷酸由三部分組成：支架序列、數(shù)個(gè)胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補(bǔ)序列。將寡核苷酸鏈5端共價(jià)連在芯片玻璃表面。其次，當(dāng)miRNAs特異性雜交在寡核苷酸上時(shí)，用核酸外切酶處理，將沒(méi)有特異性雜交上

33、miRNAs的寡核苷酸鏈降解。此時(shí)保留下來(lái)的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。與此同時(shí)，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs為引物，以保留下來(lái)的寡核苷酸鏈為模板，再加入共價(jià)連接有生物素的dATP進(jìn)行擴(kuò)增。最后，加入共價(jià)連接有熒光基團(tuán)的鏈合霉素，使其與連接有生物素的DNA鏈結(jié)合。通過(guò)激發(fā)熒光，保留下來(lái)的、并被擴(kuò)增了的寡核苷酸區(qū)域就會(huì)發(fā)出熒光。其熒光量的多少，還能顯示該miRNAs量的多少。圖12RAKE原理示意圖4展望在生物技術(shù)高速發(fā)展的今天，DNA計(jì)算的研究也是日新月異。近年來(lái)，在高水平科學(xué)研究刊物上，發(fā)表了大量DNA計(jì)算方面的研究成果。DNA計(jì)算一直是世界科研領(lǐng)域的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。DN

34、A計(jì)算發(fā)展至今，已經(jīng)從開(kāi)始的實(shí)驗(yàn)階段逐漸轉(zhuǎn)入實(shí)用階段；從單一型技術(shù)逐漸發(fā)展為多元化技術(shù)；從簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)逐漸擴(kuò)增為復(fù)雜結(jié)構(gòu)。熒光技術(shù)作為一種生物技術(shù)，其發(fā)展較早，且應(yīng)用廣泛。因其體積小，便于標(biāo)記，反應(yīng)速度快，變化靈敏，所以在核酸標(biāo)記和檢測(cè)方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于DNA計(jì)算這種精細(xì)化、定量化、復(fù)雜化的發(fā)展，熒光技術(shù)的種種特性都可以滿足并適用于DNA計(jì)算的發(fā)展。比如近兩年，關(guān)于DNA鏈置換熒光技術(shù)的研究，這種鏈置換過(guò)程都屬于單分子間的變化，如果使用常規(guī)生物實(shí)驗(yàn)手段根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)。而熒光技術(shù)的單個(gè)分子標(biāo)記，熒光激發(fā)和湮滅性質(zhì)，及其實(shí)時(shí)超高靈敏性檢測(cè)都表明其在DNA計(jì)算中的天然優(yōu)勢(shì)。因此，熒光技術(shù)的進(jìn)步

35、必然推動(dòng)DNA計(jì)算的發(fā)展。同時(shí)，熒光技術(shù)在DNA計(jì)算的應(yīng)用也拓寬了其自身應(yīng)用領(lǐng)域。這種跨學(xué)科、跨領(lǐng)域的融合貫通是推動(dòng)整個(gè)科學(xué)前進(jìn)的原動(dòng)力。一方面，應(yīng)該關(guān)注熒光技術(shù)與其他生物技術(shù)（如基因芯片技術(shù)、磁珠技術(shù)等）最新的發(fā)展和聯(lián)系；另一方面，必須深刻的認(rèn)識(shí)和了解計(jì)算科學(xué)所亟需解決的重要問(wèn)題。只有充分的將兩個(gè)方面有機(jī)地結(jié)合，通過(guò)提出創(chuàng)造性想法，才能將DNA計(jì)算轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)用、穩(wěn)定的計(jì)算手段；才能發(fā)揮DNA計(jì)算天然的優(yōu)勢(shì).參考文獻(xiàn)許進(jìn)等.DNA計(jì)算機(jī)原理、進(jìn)展及難點(diǎn)()分子生物計(jì)算中的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)與特性.計(jì)算機(jī)學(xué)報(bào)，2007，30（6）：869-880HaoYan.NucleicAcidNanotechnolog

36、y.Science,306,2048-2049JonathanBath,AndrewJ.Turberfield.DNAnanomachines.naturenanotechnology,2,275-284許進(jìn),譚鋼軍,范月科,郭養(yǎng)安.DNA計(jì)算機(jī)原理_進(jìn)展及難點(diǎn)_論DNA計(jì)算機(jī)模型.計(jì)算機(jī)學(xué)報(bào)，2007，30（6）：881-893黃曉峰，張遠(yuǎn)強(qiáng)，張英起.熒光探針技術(shù).人民軍醫(yī)出版社，2004RavinderjitS.Braich,NickolasChelyapov,CliffJohnson.Solutionofa20-variable3-SATproblemonaDNAcomputer.Sci

37、ence,296,499-502QinghuaLiu,LimanWang,AnthonyG.Frutos.DNAcomputingonsurfaces.nature,403,175-179XingpingSu,LloydM.Smith.DemonstrationofauniversalsurfaceDNAcomputer.NucleicAcidsResearch,32(10),3115-3123KristianeA.Schmidt1,ChristiaanV.Henkel1,GrzegorzRozenberg.DNAcomputingusingsingle-moleculehybridizati

38、ondetection.NucleicAcidsResearch,32(17),4962-4968LimanWang,JeffG.Hall,ManchunLu1.ADNAcomputingreadoutoperationbasedonstructure-specificcleavage.Naturebiotechnology.2001,19,1053-1059MillianN.Stojanovic,Darkostefanovic.Adeoxyribozyme-basedmolecularautomaton.Naturebiotechnology.2003,21,1069-1074Bernard

39、Yurke,AndrewJ.Turbereld,AllenP.MillsJr.ADNA-fuelledmolecularmachinemadeofDNA.Nature,2000,406,605-608A.J.Turberfield,J.C.Mitchell.DNAFuelforFree-RunningNanomachines.Physicalreviewletters,90(11),118802-1-118802-4Jong-ShikShin,andNilesA.Pierce.RewritableMemorybyControllableNanopatterningofDNA.NanoLette

40、rs,2004,4(5),905-909GeorgSeelig,BernardYurke,andErikWinfree.CatalyzedRelaxationofaMetastableDNAFuel.J.AM.CHEM.SOC.2006,128,12211-12220SimonJ.Green,DanielLubrich,AndrewJ.Turberfield.DNAHairpinsFuelforAutonomousDNADevices.BiophysicalJournal,2006,91,29662975DavidYuZhang,AndrewJ.Turberfield,BernardYurke

41、.EngineeringEntropy-DrivenReactionsandNetworksCatalyzedbyDNA.Science,2007,318,1121-1125Suvirvenkataraman,RobertM.Dirks,Paulw.K.Rothemund.AnautonomouspolymerizationmotorpoweredbyDNAhybridization.naturenanotechnology,2007,2,490-494GeorgSeelig,DavidSoloveichik,DavidYuZhang,ErikWinfree.Enzyme-FreeNuclei

42、cAcidLogicCircuits.Science,314,1585-1588PengYin,HarryM.T.Choi,ColbyR.Calvert.Programmingbiomolecularself-assemblypathways.Nature,2008,451,318-322KellerRinaudo,LeonidasBleris,RohanMaddamsetti.AuniversalRNAi-basedlogicevaluatorthatoperatesinmammaliancells.Naturebiotechnology,2007RussellP.Goodman,Mikeh

43、eilemann,Sorendoose.Reconfigurable,braced,three-dimensionalDNAnanostructures.Naturebiotechnology,2008,3,93-96YossiWeizmann,AdamB.Braunschweig,OferI.Wilner.ApolycatenatedDNAscaffoldfortheone-stepassemblyofhierarchicalnanostructures.PNAS,2008,105(14),5289-5294EbbeS.Andersen,MingdongDong,MortenM.Nielse

44、n,KasperJahn,RameshSubramanietal.Self-assemblyofananoscaleDNAboxwithacontrollablelid.Nature,459,73-77ChengdeMao,WeiqiongSun,ZhiyongShen.AnanomechanicaldevicebasedontheBZtransitionofDNA.Nature,1999,397(14),144-146GaryKGeiss,RogerEBumgarner,BrianBirditt.Directmultiplexedmeasurementofgeneexpressionwith

45、color-codedprobepairs.Naturebiotechnology,2008,26(3),317-325ErnestK.Lewis,WadeC.Haaland,FreddyNguyen.Color-blindfluorescencedetectionforfour-colorDNAsequencing.PNAS,2005,102(15),53465351JianweiJefferyLi,YizhuoChu,BenjaminYi-HungLee.EnzymaticsignalamplificationofmolecularbeaconsforsensitiveDNAdetecti

46、on.NucleicAcidsResearch,2008,36(6)HuiXu,HaipingWu,FeiHuang.MagneticallyassistedDNAassayshighselectivityusingconjugatedpolymersforamplifiedfluorescenttransduction.NucleicAcidsResearch,2005,33(9)DongshengLiu,AndreasBruckbauer,ChrisAbell.AReversiblepH-DrivenDNANanoswitchArray.J.AM.CHEM.SOC.2006,128,206

47、7-2071PeterTNelson,DonABaldwin,LMarieScearce.Microarray-basedhigh-throughputgeneexpressionprofilingofmicroRNAs.Naturemethods,2004,1(2)DevelopmentandapplicationoffluorescencetechnologyinDNAcomputingZHANGChengYANGJingWANGShuDong(SchoolofElectronicEngineeringandComputerScience,KeylaboratoryofHighConfid

48、enceSoftwareTechnologies,MinistryofEducation,PekingUniversity,Beijing100871)Abstract:DNAcomputing,asafocusofscientificfields,hasdevelopedfromsimpletocomplex,fromtheorytoapplication.Inthiscourse,thefluorescence,whichcanbehandledeasilyandhasasensitiverespond,playsanimportantrole.ThispaperpaysmoreattentionstoDN