SRSIM超高分辨率顯微鏡系統(tǒng)操作手冊20頁

1、SR-SIM超分辨率結(jié)構(gòu)照明鏡顯微鏡系統(tǒng)操作手冊SR-SIM 原理：結(jié)構(gòu)照明是一個寬視場技術(shù)，其中，受柵格圖案的衍射級的干擾， 產(chǎn)生通過在拍照圖像的同時疊加在樣品上，柵格圖案被捕捉的每一個 圖像組在步驟之間的移動或旋轉(zhuǎn)。高頻信息用反傅里葉算法處置以 后，能夠從原始數(shù)據(jù)中提取以產(chǎn)生一個重建的圖像，橫向分辨率大約 提高兩倍，衍射限制范圍在150和300納米之間的軸向分辨率。SR-SIM超高分辨率顯微鏡開機步驟:7.打開電腦注意：所有帶三角警示標記的保育器開口都要關(guān)緊，幸免激光照射！Zeiss SR-SIM 鏡頭配有 10X/dry、63X/、63X/、100X/ELYRA軟件大體操作流程SR-SI

2、M Workflow-Acqisition （圖像獲取）1）目鏡找視野選擇 Locate 選項卡4.觀察完畢后點擊Oculars offline3.選擇BF （明場）或者Fset77 （熒光）otijlarfiQrLiine1-fnrwniitcci limAs s i f nFset77為雙色濾片，能同時觀察 488nm，561nm2）圖像獲取= AcquisiflQfi Parameterf AtquisittCHn MndeObjectiveFrame Size；1004Plan-Apo 62x/1.4 Oil M271004 x 1002 standardAveragingert De

3、pthMethodMeanO Scan AreaImge Size; 127-4 pm k 127.1盼日成. 3 notations3 Rotattons Chi5 RoratlansReset AirZSFuwiil1.選擇需要的圖像分辨率2.選擇需要的rotation ,般選5次, ChainnEhTmcta IChmneliTiracklTV18.選擇相應(yīng)的偽彩Track Configuraoi “.t definedTrackl-SIMLasers 4105561 M2o FOVEwpcrsure nrne msjEMCCD SainCannera _femipe舊 tune-63.

4、0 aC9.如有多通道可通過點擊加號增加通道，每個通道重復(fù)步驟1-81.選擇相應(yīng)的激發(fā)波長2.通常設(shè)置激光強度為2,并在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)3.曝光時間為100ms ,并在此基礎(chǔ)上調(diào)節(jié)4. EMCCD增益(EMCCD Gain)為40，并在此基礎(chǔ)上 調(diào)節(jié)10.溫度提示為紅色時，儀器不能使用。等儀器降至相應(yīng)溫度方可使用注意：通常405nm的激光需設(shè)置較高的參數(shù)!7.手動選擇所需的濾片（系統(tǒng)不會自動選擇）3）獲取三維圖像1.選擇 CenterCenterFirst/LestRang-e51山IntervalSmallestKeepCenterOffset5 Use Piezo1.73200.09L6.選擇

5、需要的張數(shù)，一般為AFOFind Focus Set Exposure* Z-Stack21 Slioe5Time Series0.091 punInterval Tsiice13Q-.30:-l.ao:10-215.點擊Smallest數(shù)值4.點擊 Interval2.將圖像調(diào)節(jié)至焦平面，點3.點擊向下箭擊 Center頭EOlLive Cantinuous SnapB , Start Experiment7.點擊 StartWorkflow - Processing （圖像處置）1.點擊 ProcessingI ZEN 2010 D2.選 擇 StructuredIllumination,

6、點擊右邊的小三角，以展開條目.扣_】BKJB LocateAcquisitionFCSProcessing MirkUinlle iflew Acquisition Malntaini Macro Tools windowJApplyMethodrturt- vmugiiiigStntch卜 PALMParticle Tracklriifij Stru-ctu red lllummaticnStructured llluminBtloinTIRF- FilteredExperirnBrital PSFFourle-rTrariisfornnChannel AlignmentDeconvol u

7、tion Copy* ICSMethod ParametersInput Ern-ageSelsctRun BatchFlirt - lest *ii :Processing Automatic / Mode 3D 叩Output SR-SIM + Wide FieFd nrr. hiirnr-r.3.最亮點投影projectionColor-roded projectionLinear unMivinBIon Con cent rati anCorrelationM o d ifv SeriesHDR- imagin呂5titchj Structured IlluminationMethod

8、Ma?(innunn intcnsity prafettionIm 日且已 ca Ieu latorInput innage1.點擊 Maximum intensity2.點擊需要處理的圖像現(xiàn)在取得的圖片為不同Z軸上最亮點的投影。Zeiss ELYRA S1 通道校正(Channel Alignment)操作流程Acquire:利用200nm熒光小球獲取SIM圖像Process： SIM 圖像處置Process： Channel Alignment 通道校正Use:利用校正結(jié)果樣品為具有四種熒光通道、200nm直徑的標準熒光小球。有以下 兩個樣片:樣品編號所匹配的物鏡0000-1783-455

9、63X/ Oil， 100X/ Oil0000-1788-601100X/ Oil注意：物鏡及樣片需要認真清洗！在實驗前。需將樣品放置在開啟的系統(tǒng)中穩(wěn)固30分鐘至60分鐘。需利用與物鏡折射率相匹配的鏡油。具體操作流程見以下圖：1. Acquire SIM Image 獲取 SIM 圖像利用200nm的熒光小球ZEN) ZEN 2011File View Acquisition Maintain Macro Tools Window見aLocateAcquisitionProcessingMaintainExperiment Managerangle:Acquisition Parameter

10、Acquisition ModeShow All 由Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27Find Focus Set ExposureContinuousFrame SizeX* Y Y 100221 SlicesTime Series Format1004 x 1002 standardTile ScanPositionsRegionsA Start ExperimentAveragingNumberBit Depth 16 Bit:Setup ManagerMethodMeanHDRLaser Lines nmPowerA HR DPSS 561-1OC

11、561 (Elyra)A HR Diode 642-1(642 (Elyra)Image Size:Pixel Size:127.4 pm x 127.1 pm0.13 pmA HR Diode 405-5(405 (Elyra)A HR Diode 4S8-1(438 (Elyra)Q Laser Properties區(qū) Light PathZSlwwAll 國Reset Al!Laser WFGrating 5 RotationsSwitch track every Z-Stack船 Channels show All 囪Tracks red yelloe Green blueTracks

12、ChannelsV yelloe5 Green5 blueExpand All Collapse AllTrack Configuration not definedSIM 34.0 呻 G3LP655Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27Exposure Time ms H100.0QStage FocusEMCCD GainCamera Temperature -63.0 ,C stableAperture 0.55O DisplayFocusV Focus Devices and Strategy:Multidimensional Acquisition1

13、選擇需要的物鏡2.選擇 5 rotation3.建議案順序依次設(shè)置4.激光強度：488nm, 561nm：2 5%;405nm, 642nm： 4 10%time： 100msGain： 30-507.選擇 Center12. z-stack 選擇 slice 為 21 張11.點擊Smallest數(shù)值8.點擊 Interval9.點擊 Center10.點擊向下箭頭2.生成SIM圖像1.選擇 Processing 選卡3.選擇先前拍攝的SIM原始圖像7.點擊 ApplyPirtcle Trackingt Strunured MurninatKHi . smnnd aunHiHiMnTIBF-

14、 Fite ndEcperintemai PSFFourier Transform Oianrtel Allenmerat Decanvnlutian Copy ICS.Ailiiicr2.選擇 Structure Illumination5.選擇Automatic模式6.選擇 SR-SIMModflysenKHDiR-rTHgingcorreiEnoni通道校正1. 選擇Processing選卡it mLMPnrtweirartneIt Structyred lumnaticn CTmmd A電rnnerTt Deconva I ution3.選擇先前拍攝的SIM圖像啊攻*ton bn C6.點擊 Apply5.選擇校正模式AffineH火業(yè)郵,FALKlFankMTraa：f bKimdF4.點擊SelectOwv PALMParticle Tracking k Structured IlluminationChanne