一、二、三代測序技術(shù)

1、一代、二代、三代測序技術(shù)第一代測序技術(shù)-Sanger鏈終止法一代測序技術(shù)是20世紀70年代中期由Fred Sanger及其同事首先發(fā)明。其基 本原理是，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區(qū) 分開來。一代測序?qū)嶒灥钠鹗疾牧鲜蔷坏膯捂淒NA分子。第一步是短寡聚核 苷酸在每個分子的相同位置上退火，然后該寡聚核苷酸就充當(dāng)弓物來合成與模板 互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核 糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團，所以可被用作鏈終止試劑）通過 聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。測序引物與 單鏈DNA模板分子結(jié)合后，

2、DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組 進行，每一組分別用四種ddNTP （雙脫氧核苷酸）中的一種來進行終止，再用 PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。第二代測序技術(shù)-大規(guī)模平行測序大規(guī)模平行測序平臺（massively parallel DNA sequencing platform ）的出 現(xiàn)不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬 于大型測序中心的“特權(quán)”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測序技術(shù)有 助于人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間 交互作用組的各項數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測序儀

3、產(chǎn)品，例如美國RocheApplied Science公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測序儀、美國Applied Biosystems公司 的SOLiD測序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合 成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光 標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dNTP就會 釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲 得待測DNA的序列信息。以Illumina測

4、序儀說明二代測序的一般流程，（1） 文庫制備，將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百堿基或更短的小片段。用 聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個核苷酸 黏性末端。然后將Illumina測序接頭與片段連接。（2）簇的創(chuàng)建，將模板分子 加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測序循環(huán)。芯片有8個縱向泳道的硅基片。每個泳道 內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變 性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴增使用。 通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。（3）測序，分三步：DNA 聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下

5、一個循環(huán)開始前將結(jié)合的核 苷酸剪切并分解。（4）數(shù)據(jù)分析第三代測序技術(shù)-高通量、單分子測序被稱為第三代的測序的He-licos單分子測序儀，PacificBioscience的SMRT技 術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術(shù)正向 著高通量低成本長讀取長度的方向發(fā)展。不同于第二代測序依賴于DNA模板 與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測序，第三代分子測序，不需要進行PCR擴增。(1)Helico BioScience單分子測序技術(shù)。該測序是基于邊合成邊測序的思想， 將待測序列隨機打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3末端加上poly(A)，以 及在

6、poly(A)的末端進行熒光標(biāo)記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板 雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點加入聚合 酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸， 然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板 位點上是否有熒光信號，然后化學(xué)裂解核苷酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧 核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反應(yīng)。(2)Pacific BioscienceSMRTT技 術(shù)。該測序也是基于邊合成邊測序的原理，這項技于使用了 Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級波導(dǎo))。測序的過程：被熒光標(biāo)記

7、磷酸集團 的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結(jié)合(每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料 標(biāo)記)，被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團被切割并釋放，聚 合酶轉(zhuǎn)移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖，進 行下一個循環(huán)。(3)Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測序 技術(shù)。大多數(shù)納米孔測序技術(shù)的基本原理是當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一 個孔洞經(jīng)過時而檢測到被影響的電流或光信號。OxfordNanopore測序技術(shù)是 以a-溶血素來構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的夕卜表面，一種合成 的環(huán)糊精做為傳感器共價結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個系統(tǒng)被鑲嵌在一個脂雙分 子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測又滿足外切酶活性的物理條件，脂雙分子 層兩側(cè)為不同的鹽濃度在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個堿 基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流， 腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時間是其他 核苷酸的2-3倍所以每個堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來?？偨Y(jié)：第一代指雙脫氧末端終止法，擴增后通過毛細管電泳讀取序列，每次獲取數(shù)據(jù)量 少第二代為高通量測序，采用微珠或高密度芯片邊合成邊測序，代表有454，solexa， s