現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展與人類的生存ppt課件

1、第4節(jié) 核酸的研討方法 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院 安建平 教授 聯(lián)絡(luò) 8362524 93853252 一、核酸的分別、提純和定量測(cè)定 二、核酸的超速離心三、核酸的凝膠電泳 四、核酸的核苷酸序列測(cè)定五、DNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒错懥?、DNA 的化學(xué)合成目錄一、核酸的分別、提純和定量測(cè)定 一DNA 的分別 二RNA 的分別 三核酸含量的測(cè)定法一DNA 的分別真核生物中的染色體DNA與堿性蛋白組蛋白結(jié)合成核蛋白DNP)方式存在于核內(nèi)。DNP溶于水和濃鹽溶液如1 mol/L 氯化鈉，但不溶于生理鹽溶液0.14 mol mol/L氯化鈉。利用這一性質(zhì)，可將細(xì)胞破碎后用濃鹽溶液提取，然后用水稀釋至0.14 mol/

2、L鹽溶液，使DNP纖維沉淀出來。使其纏繞在玻璃棒上，再溶解和沉淀多次以純化。 用苯酚抽提，除去蛋白質(zhì)。苯酚是很強(qiáng)的蛋白量變性劑，用水飽和的苯酚與DNP一同振蕩，冷凍離心，DNA溶于上層水相，不溶性變性蛋白質(zhì)殘留物位于中間界面，一部分變性蛋白質(zhì)停留在酚相。如此操作反復(fù)多次以除凈蛋白質(zhì)。將含DNA的水相合并，在有鹽存在的條件下加2倍體積冷的乙醇，可將DNA沉淀出來。用乙醚和乙醇洗沉淀。用此方法可以得到純的DNA。用氯仿一辛醇或異戊醇與DNP溶液振蕩，借助外表變性除去蛋白質(zhì)，反復(fù)多次直至得到不含蛋白質(zhì)的DNA。此操作過程與苯酚法類似。 為了得到大分子DNA，防止核酸酶和機(jī)械振蕩對(duì)DNA的降解，在細(xì)胞

3、懸液中直接參與2倍體積含1% SDS)的緩沖溶液，并參與廣譜蛋白酶如蛋白酶K)最后濃度達(dá)100ug/mL，在65保溫4h，蛋白質(zhì)全部降解，然后用苯酚抽提，除凈蛋白酶和蛋白質(zhì)的部分降解產(chǎn)物。DNA制品中的少量RNA可用純的RNase分解除去。此方法如今比較常用。氯化銫密度梯度離心cesium chloride density gradient centrifugation也是實(shí)驗(yàn)室制備高質(zhì)量DNA常用的方法。 二RNA 的分別RNA比DNA更不穩(wěn)定，而且RNase又無(wú)處不在，因此RNA的分別更為困難。制備RNA通常需求留意3點(diǎn)：一切用于制備RNA的玻璃器皿都要經(jīng)過高溫焙烤，塑料器具經(jīng)過高壓滅菌，

4、不能高壓滅菌的器具要用0.196焦碳酸二乙酰DEPC處置，再煮沸以除凈DEPC。 DEPC能使蛋白質(zhì)乙基化而破壞RNase活性。在破碎細(xì)胞的同時(shí)參與強(qiáng)變性劑如胍鹽使RNase失活。在RNA的反響體系內(nèi)參與RNase的抑制劑如RNasin) 。 目前最常用的制備RNA方法有兩個(gè)：其一，用酸性胍鹽苯酚氯仿抽提。異硫氰胍是極劇烈的蛋白量變性劑，它幾乎使一切遇到的蛋白質(zhì)都被變性。然后用苯酚和氯仿多次除凈蛋白質(zhì)。此法用于小量制備RNA。其二，用胍鹽氯化銫將細(xì)胞抽提物進(jìn)展密度梯度離心。蛋白質(zhì)密度 1.89 g/cm3，沉在底部。用此方法可制備較大量高純度的天然RNA。分別poly(A)十mRNA通常采用寡

5、聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo (dT)，親和層析法。用寡聚dT)纖維素柱或寡聚dT瓊脂糖凝膠柱吸附mRNA，洗滌后用低離子強(qiáng)度緩沖液回收mRNA，得到較高質(zhì)量的制品。 不同功能RNA常分布于細(xì)胞的不同部位，分別這些RNA常需先用差速離心法，將細(xì)胞核、線粒體、葉綠體、胞質(zhì)體等各部分分開，再?gòu)倪@些部分中分別出RNA.三核酸含量的測(cè)定法 1.紫外分光光度法 2.定磷法 3.定糖法 4.生物資料的處置 2.定磷法磷的測(cè)定最常用的是鉬藍(lán)比色法。此法需先用濃硫酸或過氯酸將有機(jī)磷水解成無(wú)機(jī)磷。在酸性條件下正磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，在復(fù)原劑存在下被復(fù)原成鉬藍(lán)，其最大吸收峰在660 nm處，在一定范圍內(nèi)溶液光

6、密度與磷含量成正比，據(jù)此可以計(jì)算出核酸含量。 3.定糖法定糖法常用的也是比色法。當(dāng)RNA與鹽酸共熱時(shí)核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，它與甲基苯二酚地衣酚反響呈鮮綠色，最大吸收峰在670 nm處，反響需求三氯化鐵作催化劑。DNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，其脫氧核糖可參與反響生成藍(lán)色化合物，最大吸收峰在595nm處。此外，還有一些比色反響也可給出靈敏的結(jié)果。 4.生物資料的處置細(xì)胞或組織中核酸含量的測(cè)定需求先對(duì)生物資料作一定的處置，以便定量提取出核酸的成分。組織預(yù)先處置的目的是除去酸溶性含磷化合物及脂溶性含磷化合物。常用冷的5%10%過氯酸(PCA)或三氯乙酸TCA處置粉碎的生物資料，抽提液為酸溶性部分，包括核苷

7、酸，及相對(duì)分子質(zhì)量小的寡核苷酸等。再將殘留物用有機(jī)溶劑如乙醇、乙醚、氯仿等除去脂溶性含磷物質(zhì)。抽提液中，主要是磷脂類物質(zhì)。留下的殘?jiān)鼮椴蝗苡谒岬姆侵惡谆衔铮―NA、RNA、蛋白質(zhì)及少量其他含磷化合物。二、核酸的超速離心 1.核酸的密度測(cè)定 2.測(cè)定DNA 中G-C 含量 3.溶液中核酸構(gòu)象的研討 4.用于核酸的制備1.核酸的密度測(cè)定以測(cè)定DNA浮力密度為例。將8.0 mol幾的氯化銫溶液裝人離心杯中，DNA樣品溶于氯化銫溶液，裝在離心杯頂部。開動(dòng)離心機(jī)，以每分鐘45000轉(zhuǎn)的速度運(yùn)轉(zhuǎn)16 h以上。此時(shí)離心杯中構(gòu)成線形氯化銫密度梯度，自杯底的1.80 g/cm3,到頂部的1.55 g/

8、cm3。當(dāng)DNA樣品的沉降速度與分散速度到達(dá)平衡形狀時(shí)，DNA構(gòu)成一穩(wěn)定的區(qū)帶，漂浮于氯化銫密度梯度中的一定位置上。此時(shí)DNA所處的位置上的氯化銫密度等于DNA的浮力密度?？梢杂霉街苯佑?jì)算出DNA的浮力密度。 不過更方便的方法是運(yùn)用1一2個(gè)知其浮力密度的規(guī)范DNA樣品作參考，與未知樣品一同離心。待到達(dá)平衡后，經(jīng)過離心機(jī)上的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定DNA與轉(zhuǎn)頭的中心軸之間的間隔，按下式計(jì)算出未知DNA的浮力密度： 04.222一0210-10式中：為未知DNA的密度，0為規(guī)范DNA的密度，為角速度弧度秒，為未知DNA與轉(zhuǎn)軸之間的間隔，0為知DNA的間隔。 2.測(cè)定DNA 中G-C 含量G-C堿基對(duì)比A-T

9、堿基對(duì)之密度大，由于G-C對(duì)中有3個(gè)氫鍵。所以含G-C對(duì)多的DNA，浮力密度大，含G-C對(duì)少的DNA，浮力密度小。而且G-C的百分含量與DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系。因此用這個(gè)方法能迅速而準(zhǔn)確地測(cè)定DNA的堿基成分。Rolfe-Meselson導(dǎo)出了如下計(jì)算公式： 0.100 xG-C1.6583.溶液中核酸構(gòu)象的研討RNA只需部分雙螺旋構(gòu)造，它的浮力密度比雙鏈DNA高。雙鏈DNA又比蛋白質(zhì)的密度高。雙螺旋DNA受熱變性后成為單鏈，密度增高。核酸的不同構(gòu)象具有不同的浮力密度，可利用此技術(shù)研討核酸的構(gòu)象變化及其動(dòng)力學(xué)過程。4.用于核酸的制備運(yùn)用溴化乙錠一氯化銫密度梯度平衡超離心，很容易將不同構(gòu)

10、象的DNA, RNA及蛋白質(zhì)分開。這個(gè)方法是目前實(shí)驗(yàn)室中純化質(zhì)粒DNA時(shí)最常用的方法。假設(shè)運(yùn)用垂直轉(zhuǎn)頭，每分鐘65000轉(zhuǎn)Beckman L一70超離心機(jī)，只需6h可以完成分別任務(wù)。但是假設(shè)采用角轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速為每分鐘45 000轉(zhuǎn)時(shí)，那么需16h。離心終了后，離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚圖15一2),蛋白質(zhì)漂浮在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉降較快，開環(huán)及線型DNA沉降較慢。 經(jīng)染料-氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒DNA及各種雜質(zhì)的分布超螺旋DNA閉環(huán)質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)及線型DNA蛋白質(zhì)石蠟油用注射針頭從離心管側(cè)面在閉環(huán)質(zhì)粒DNA區(qū)帶部位刺人，搜集這一區(qū)帶的DNA

11、,用異戊醇抽提搜集到的DNA以除去染料，然后透析除去CsCI，再用苯酚抽提1-2次，即可用乙醇將DNA沉淀出來。這樣得到的DNA有很高的純度，可供DNA重組，測(cè)定序列及限制酶圖譜等之用。在少數(shù)情況下，需求特別純的DNA時(shí)，可以將此DNA樣品再進(jìn)展一次氯化銫密度梯度超離心分別。 三、核酸的凝膠電泳 一脂糖電泳 二聚丙烯酰胺凝膠電泳一脂糖電泳 1.影響電泳遷移率要素 2.DNA分析 3.DNA 分子片斷的測(cè)定 4.樣品的回收1.影響電泳遷移率要素1核酸分子大小遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比；2膠濃度遷移率與膠濃度成反比，常用1%膠分別DNA;3DNA的構(gòu)象普通條件下超螺旋DNA的遷移率最快，線型D

12、NA其次，開環(huán)DNA最慢。但在膠中加人過多的澳化乙錠時(shí)，上述分布次序會(huì)發(fā)生改動(dòng)； 4電壓普通采用5V/cm,在適當(dāng)?shù)碾妷翰罘秶鷥?nèi)，遷移率與電壓大小成正比；5堿基組成有一定影響，但影響不大；6溫度4-30都可以，常在室溫進(jìn)展，電流量過大時(shí)凝膠溫度升高，溶液蒸發(fā)，會(huì)呵斥電泳異常。2.DNA分析電泳終了后，將膠在熒光染料溴化乙錠的水溶液中染色(0.5 ug/mL。溴化乙錠為一扁平分子，很易插人DNA中的堿基對(duì)之間。DNA與溴化乙錠結(jié)合后，經(jīng)紫外光照射，可發(fā)射出紅一橙色可見熒光。1ngDNA即可用此法檢出，所以此方法非常靈敏。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以大體判別DNA樣品的濃度。假設(shè)在同一膠上加一知濃度的DNA作

13、參考，那么所測(cè)得的樣品濃度更為準(zhǔn)確?？梢杂渺`敏度很高的負(fù)片將凝膠上所呈現(xiàn)的電泳圖譜在紫外光照射下拍攝下來，作進(jìn)一步分析與長(zhǎng)期保管之用。 3.DNA 分子片斷的測(cè)定運(yùn)用凝膠電泳可以正確地測(cè)定DNA片段的分子大小。適用的方法是在同一膠上加一知其相對(duì)分子質(zhì)量的樣品如圖15-3中的A DNA/Hind皿的片段。電泳終了后，經(jīng)澳化乙錠染色，照相，從照片上比較待測(cè)樣品中的DNA片段與規(guī)范樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。目前許多試劑公司都能提供各種不同相對(duì)分子質(zhì)量的規(guī)范樣品。 4.樣品的回收膠上某一區(qū)帶在紫外光照射下，切割下來，將切下的膠條放在透析袋中，裝上電泳液，在程度電泳槽中進(jìn)

14、展電泳，讓膠上的DNA釋放出來并進(jìn)一步粘在透析袋內(nèi)壁上，電泳3-4 h后，將電極倒轉(zhuǎn)，再通電30-60 s，粘在壁上的DNA重又釋放到緩沖液中。取出透析袋內(nèi)的緩沖液丟棄膠條，用苯酚抽提1一2次，水相用乙醇沉淀。這樣回收的DNA純度很高，可供進(jìn)一步進(jìn)展限制酶分析、序列分析或作末端標(biāo)志?；厥章试?0%以上。 二聚丙烯酰胺凝膠電泳以聚丙烯酰胺作支持物。單體丙烯酰胺在加人交聯(lián)劑后，就成聚丙烯酰胺。由于這種凝膠的孔徑比瓊脂糖膠要小，所以可用予分析相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 bp的DNA片段和RNA的電泳。聚丙烯酰胺中普通不含有RNase，用于RNA的分析不會(huì)分解樣品。但仍要留心緩沖液及其他器皿中所帶的R

15、Nase。聚丙烯酰胺凝胺強(qiáng)度較好，常用垂直板電泳。聚丙烯酰胺凝膠上的RNA樣品，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外光照射下，也能發(fā)出熒光，但較暗。這是由于RNA的雙螺區(qū)較少，其熒光遠(yuǎn)比DNA為弱，濃度很低的樣品不能用此法檢測(cè)出來，需求用亞甲藍(lán)或銀染來顯示。四、核酸的核苷酸序列測(cè)定1.Sanger等人提出的酶法雙脫氧鏈終止法 2.Maxam和Gilibert提出的化學(xué)降解法比較常用的是Sanger的雙脫氧鏈終止法五、DNA 聚合酶鏈?zhǔn)椒错?1.概述 2.步驟 3.運(yùn)用1.概述聚合酶鏈反響PCR體外擴(kuò)增DNA已成為運(yùn)用最廣泛的一種生物技術(shù)。1985年K. Mullis在研討DNA聚合酶反響時(shí)發(fā)明了這項(xiàng)技術(shù)。最

16、初采用Klenow酶來擴(kuò)增DNA，但每次加熱變性DNA時(shí)都會(huì)使酶失活，需求重新添加DNA聚合酶，因此運(yùn)用不方便。1988年Saiki等人用耐熱的Taq DNA聚合酶取代Klenow酶之后，才使這項(xiàng)技術(shù)成熟，從而得到各方面的運(yùn)用。2.步驟1設(shè)計(jì)一對(duì)引物以便有效擴(kuò)增所需求的DNA序列，并盡量減少能夠產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物。2優(yōu)化反響體系，以便獲得最好的擴(kuò)增效果。該反響體系應(yīng)包括適量模板(1 ng0.001 ng)，引物100 pmol/100 ul,4種dNTP(200 umol/LTaq DNA聚合酶2 u/100 ul，和適量Mg0.055 mmol/L)。3選擇3個(gè)溫度進(jìn)展熱循環(huán)。這3個(gè)溫度為：變

17、性，94，4560 s；退火根據(jù)引物與模板的Tm值來定，普通為兩引物中較低Tm值減2， 1 min；延伸，72，1 min,開場(chǎng)時(shí)熱變性510 min，熱循環(huán)25，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。最普通的檢測(cè)方法是進(jìn)展凝膠電泳，用澳化乙錠染色，在紫外光下檢查結(jié)果。 PCR技術(shù)非常靈敏，少數(shù)幾個(gè)模板分子即可檢查出來。它的擴(kuò)增效率非常高，通?？蓴U(kuò)增106倍。其擴(kuò)增產(chǎn)量可按以下公式計(jì)算： y1xn y產(chǎn)量 x擴(kuò)增效率 n=循環(huán)次數(shù)3.運(yùn)用1遺傳病和某些疑問病的診斷以及孕婦的產(chǎn)前檢查。2病原體的檢測(cè)。某些惡性疾病用普通微生物學(xué)、生化和免疫學(xué)技術(shù)無(wú)法查出病原體時(shí)，可用PCR來檢查。 3法醫(yī)和刑偵鑒定。PCR可靈敏檢測(cè)出親屬間的親緣關(guān)系，并對(duì)生物殘留的痕量樣品進(jìn)展鑒定，因此，對(duì)刑偵極為有用。 4癌基因的檢查。 5基因探針的制備。 6基因組測(cè)序、染色體巡視。 7cDNA庫(kù)的構(gòu)建。 8基因突變的分析和定位誘變。 9 DNA重組。 10基