四-目的基因的檢測與表達產(chǎn)物的測定分析42頁PPT課件

1、基因工程的基本操作程序第二節(jié)四 目的基因的檢測與表達產(chǎn)物的測定基因工程的概念 基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。目的基因供體細胞受體細胞獲得新性狀基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將表達載體導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定為什么非要有載體和目的基因一同進入受體細胞呢？ 研究發(fā)現(xiàn)，單個基因或DNA片段導入另一生物體的細胞后，往往會被細胞內(nèi)的防御系統(tǒng)消滅掉，這樣就大大降低了目的基因的表達效率；如果把目的基因包裝一下，就很容易逃

2、過受體細胞的防御系統(tǒng)，免遭“滅頂之災”。 基因工程：把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。前面三個步驟完成后，在全部的受體細胞中，真正能夠攝入重組DNA分子的受體細胞是很少的。因此，必須通過一定的手段對受體細胞中是否導入了目的基因進行檢測。 檢測的方法有很多種，例如，大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因，當這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒，并被轉(zhuǎn)入受體細胞后，就可以根據(jù)受體細胞是否具有青霉素抗性來判斷受體細胞是否獲得了目的基因。重組DNA分子進入受體細胞后，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達過程。 標記

3、基因的作用在于便于檢測目的基因的情況。因為標記基因和目的基因同位于運載體上，要導入都導入，要表達則都會表達。一般標記基因的DNA序列是已知的，若選用抗氨芐青霉素基因，則可在目的基因?qū)牒笥冒逼S青霉素來處理受體細胞，若無異常，則抗氨芐青霉素已合成，說明基因已得到表達。標記基因 目的基因 啟動子 終止子 復制原點2.基因表達載體的組成基因工程的概念 把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。目的基因的獲得供體細胞基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞獲得新性狀篩選含有目的基因的受體細胞目的基因在受體細胞中是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯出相應的蛋白質(zhì)1.檢

4、測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 這是目的基因能否在真核生物中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。DNA分子雜交檢測方法是：采用DNA分子雜交技術(shù)。先將轉(zhuǎn)基因生物的基因組提取出來；把目的基因的DNA片段用放射性同位素作標記做成探針；使探針與基因組DNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因已插入染色體DNA中。 兩種生物的互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈。即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對進行。因此，當用探針與轉(zhuǎn)基因生物的目的基因雜交時，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置能看到），則說明目的基因已經(jīng)插入受體細胞的染色體DNA中?；蛱结槪菏且恍《螁捂湹腄NA或RNA,帶有

5、放射性同位素標記，并能與目的基因的一條鏈堿基互補配對2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 這是檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步。分子雜交采用DNA與RNA分子雜交技術(shù)。從轉(zhuǎn)基因生物中提取出mRNA，把目的基因的DNA片段用放射性同位素作標記做成探針；使探針與mRNA雜交，如果出現(xiàn)雜交帶，就表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體（對抗進行同位素標記）進行抗原抗體雜交；如果出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。 如：一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛毎?，是否具有了抗蟲或抗病特性，需要做抗蟲或抗病的接種實驗，觀察害

6、蟲的存活情況或植物的患病情況以確定是否具有抗性及抗性的程度。 又如：有的基因工程產(chǎn)品需要與天然產(chǎn)品的功能進行活性比較，以確定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的功能中否與天然產(chǎn)品相同，甚至超過天然產(chǎn)品。2.形態(tài)檢測:檢測轉(zhuǎn)基因生物是否表達出相應的性狀 目標性狀或標記基因的性狀1.分子檢測2.形態(tài)檢測:檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測轉(zhuǎn)基因生物是否表達出相應的性狀 目標性狀或標記基因的性狀DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交 目的基因的檢測與鑒定檢查是否成功歸納步驟檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因DNA與DNA雜交檢測目的

7、基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNADNA與RNA雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交檢測抗蟲棉是否翻譯出毒蛋白：從蘇云金芽孢桿菌中提取毒蛋白，注入某種動物體內(nèi)，從動物的血清中分離出相應的抗體，并用熒光標記該抗體，然后用標記的抗體與抗蟲棉的細胞提取液混合，如出現(xiàn)雜交帶，則表明抗蟲基因已經(jīng)在棉花細胞中表達。歸納: 基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR技術(shù)人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因、復制原點將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法、基因槍法；顯微注射法；氯化鈣法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯、個體水平的檢測1.利用大腸桿菌可以生

8、產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。2.-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的-珠蛋白，想一想，應如何進行設(shè)計？思考與探究（2019福建）32現(xiàn)代生物科技專題肺細胞中的let-7基因表達減弱，癌基因RAS表達增強，

9、會引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將let-7基因?qū)敕伟┘毎麑崿F(xiàn)表達，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如圖。（）進行過程時，需用 _ 酶切開載體以插入let-7基因。載體應有RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，以驅(qū)動let-7基因轉(zhuǎn)錄，該部位稱為 。限制性核酸內(nèi)切酶（或限制） _ 啟動子 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標記。（2019福建） 32現(xiàn)代生物科技專題 肺細胞中的let-7基因表達減弱，癌基因RAS表達增強，會引發(fā)肺癌。研究人員利用基因工程技術(shù)將l

10、et-7基因?qū)敕伟┘毎麑嶒灡磉_，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的增殖受到抑制。該基因工程技術(shù)基本流程如圖。（）進行過程時，需用 酶處理貼附在培養(yǎng)皿壁上的細胞，以利于傳代培養(yǎng)。胰蛋白 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標記。（）研究發(fā)現(xiàn)，let-7基因能影響癌基因RAS的表達，其影響機理如圖。據(jù)圖分析，可從細胞中提取 進行分子雜交，以直接檢測let-7基因是否轉(zhuǎn)錄。肺癌細胞增殖受到抑制，可能是由于細胞 （RASmRNA/RAS蛋白）含量減少引起的。RNA RAS蛋白 “漢水丑生的生物同行”超級群

11、大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標記。（5）基因工程中除質(zhì)粒外，和 也可作為運載體。 （4）反轉(zhuǎn)錄作用的模板是 ，產(chǎn)物是 。若要在體外獲得大量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，常采用技術(shù)。（6）若用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，一般情況下，不能直接用未處理的大腸桿菌作為受體細胞，原因是 mRNA（或RNA） cDNA （或DNA） 噬菌體 未處理的大腸桿菌吸收質(zhì)粒（外源DNA）的能力極弱 PCR 動植物病毒等 （1）從小鼠中克隆出-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。（2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上 抗四環(huán)

12、素的基因，構(gòu)建成一個表達載體。（3）將表達載體導入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有 四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達載體未進入大 腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如 果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明-珠蛋白基因已 進入其中。（4）培養(yǎng)進入了-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎 后從中提取-珠蛋白?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。30.在培育轉(zhuǎn)基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作為標記基因，只有含卡那霉素抗性基

13、因的細胞才能在卡那霉素培養(yǎng)基上生長。下圖為獲得抗蟲棉的技術(shù)流程?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。請據(jù)圖回答：（1）A過程需要的酶有_。（2）B過程及其結(jié)果體現(xiàn)了質(zhì)粒作為運載體必須具備的兩個條件是 ?！皾h水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶 具有標記基因；能在宿主細胞中復制并穩(wěn)定保存 “漢水丑生

14、的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。“漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。（3）C過程的培養(yǎng)基除含有必要營養(yǎng)物質(zhì)、瓊脂和激素外，還必須加入_。（4）如果利用DNA分子雜交原理對再生植株進行檢測，D過程應該用 作為探針。 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修

15、改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記?？敲顾?放射性同位素（或熒光分子）標記的抗蟲基因 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。（5）科學家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。將轉(zhuǎn)基因植株與_雜交，其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為1：1。非轉(zhuǎn)基因植株 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019

16、年1月15日，漢水丑生標記。（5）科學家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。若該轉(zhuǎn)基因植株自交，則其后代中抗卡那霉素型與卡那霉素敏感型的數(shù)量比為_。 3:1 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。（5）科學家發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的卡那霉素抗性基因的傳遞符合孟德爾遺傳規(guī)律。若將該轉(zhuǎn)基因植株的花藥在卡那霉素培養(yǎng)基上作離體培養(yǎng)，則獲得的再生植株群體中抗卡那霉素型植株占_%。100 練習1：(2019理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三

17、角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所 用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的 處， DNA連接酶作用于 處。（填“a”或“b”）aa練習1：(2019理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化法和 法。（3）由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用 技術(shù)（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放 射性同位素標記的 作探針進行分子雜交檢 測，又要用 方 法從個體水平鑒

18、定水稻植株的耐鹽性。基因槍/花粉管通道法植物組織培養(yǎng)耐鹽基因一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）3.下圖為采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)AFB1解毒酶的流程圖據(jù)圖回答問題： 在甲、乙條件下培養(yǎng)含AFB1解毒酶基因的菌株經(jīng)測定甲菌液細胞密度小、細胞含解毒酶：乙菌液細胞密度大、細胞不含解毒酶過程l 應選擇_菌液的細胞提取總RNA ，理由是_ 過程中，根據(jù)圖示，可以看出與引物結(jié)合的模版是_ 檢測酵母菌工程菌是否合成了AFB1解毒酶，應采用_方法。甲甲菌液細胞的AFB1基因的表達已轉(zhuǎn)錄形成mRNA，而在已菌夜細胞中該基因未轉(zhuǎn)錄AFB1解毒酶基因的cDNA抗原-抗體雜交“漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年

19、高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，不得以任何形式用于商業(yè)目的。2019年1月15日，漢水丑生標記。（2019江蘇）27、下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答下列問題：（1）一個圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割前后，分別含有_個游離的磷酸基團。（2）若對圖中質(zhì)粒進行改造，插入的Sma酶切位點越多，質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性越 _。（3）用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Srna切割，原因是_。（4）與只使用EcoR I相比較，使用BamH和Hind 兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止_。0、2高 Sma會破壞質(zhì)

20、粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化（5）為了獲取重組質(zhì)粒，將切割后的質(zhì)粒與目的基因片段混合，并加入_酶。（6）重組質(zhì)粒中抗生素抗性基因的作用是為了 _。（7）為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，將重組質(zhì)粒導入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在_的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以完成目的基因表達的初步檢測。DNA連接鑒別和篩選含有目的基因的細胞蔗糖為唯一含碳營養(yǎng)物質(zhì)（2019重慶）31.（16分）擬南芥是遺傳學研究的模式植物，某突變體可用于驗證相關(guān)的基因的功能。野生型擬南芥的種皮為深褐色（TT），某突變體的種皮為黃色（tt）,下圖是利用該突變體驗證油菜種

21、皮顏色基因(Tn)功能的流程示意圖。 “漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。（1）與擬南芥t基因的mRNA相比，若油菜Tn基因的mRNA中UGA變?yōu)椋淠┒诵蛄谐蔀椤啊?，則Tn比多編碼個氨基酸（起始密碼子位置相同，、為終止密碼子）。（2）圖中應為 。若不能在含抗生素Kan的培養(yǎng)基上生長，則原因是 。若的種皮顏色為 ，則說明油菜Tn基因與擬南芥T基因的功能相同。2重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒未導入 深褐色 （3）假設(shè)該油菜Tn基因連接到擬南芥染色體并替換其中一個t基因，

22、則中進行減數(shù)分裂的細胞在聯(lián)會時的基因型為_ ；同時，的葉片卷曲（葉片正常對葉片卷曲為顯性，且與種皮性狀獨立遺傳），用它與種皮深褐色、葉片正常的雙雜合體擬南芥雜交，其后代中所占比列最小的個體表現(xiàn)_ 取的莖尖培養(yǎng)成16顆植珠，其性狀通常_（填 “不變”或“改變”）。（4）所得的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥_（填“是”或者“不是”）同一個物種。TnTnt t 黃色正常、 黃色卷曲 不變 是 （2019山東）35【生物現(xiàn)代生物科技專題】人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型常用于致病機理的探討及治療藥物的篩選。利用正常大鼠制備遺傳性高血壓轉(zhuǎn)基因模型大鼠的流程如圖所示。“漢水丑生的生物同行”超級群大型公益活動：歷年高考題PPT版制作。本課件為公益作品，版權(quán)所有，未經(jīng)允許不得擅自修改或用于任何形式的商業(yè)用途。2019年1月15日，漢水丑生標記。（1）卵母細胞除從活體輸卵管中采集外，還可以從已處死的雌鼠_中獲取。 （2）圖中的高血壓相關(guān)基因作為 ，質(zhì)粒作為_二者需用 切割后連接成重組載體，該過程與質(zhì)粒上含有 有關(guān)。（3）子代大鼠如果 和_