農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)系列之課件

1、農(nóng)殘檢測(cè)常用方法技術(shù)要點(diǎn)卞紅正安徽省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（合肥）農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)系列之主要內(nèi)容速測(cè)方法3準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法4當(dāng)前常用檢測(cè)方法2前言1以前農(nóng)殘檢測(cè)方法的頒布：國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)頒布國家標(biāo)準(zhǔn)（GB）;農(nóng)業(yè)部頒布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY）;國家進(jìn)出口商品檢驗(yàn)檢疫總局頒布行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，編號(hào)為SN。已頒布標(biāo)準(zhǔn)截至目前，已頒布的農(nóng)產(chǎn)品和食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)共有390多個(gè)。其中：國家標(biāo)準(zhǔn)92個(gè)，農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)35個(gè)，商檢行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)約270個(gè)。前 言根據(jù)2009年6月1日實(shí)施的中華人民共和國食品安全法第二十一條和第二十二條的規(guī)定，今后凡涉及食品安全的標(biāo)準(zhǔn)（八個(gè)方

2、面），統(tǒng)一由國務(wù)院衛(wèi)生行政部門部制定和頒布，國務(wù)院標(biāo)準(zhǔn)化行政部門提供國家標(biāo)準(zhǔn)編號(hào) 。對(duì)現(xiàn)行的食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)、食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)、食品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和有關(guān)食品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中強(qiáng)制執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)予以整合，統(tǒng)一公布為食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)殘檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)全部統(tǒng)一為食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。前 言1.速測(cè)方法GB/T 5009.199-2003蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)NY/T 448-2001蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)方法一、當(dāng)前常用檢測(cè)方法NY/T 761-2008蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定QuEChERS Method（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)

3、中心）修訂方法NY/T 761-2008 、GB/T 19648-2006水果和蔬菜中500種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法、GB/T 20769-2008水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等方法糅合在一起的實(shí)施細(xì)則2.準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法一、當(dāng)前常用檢測(cè)方法二、速測(cè)方法1快速檢測(cè)程序試樣檢測(cè) 陰性陽性復(fù)測(cè)（兩次以上）陰性陽性根據(jù)市場(chǎng)規(guī)定處理 準(zhǔn)確定量定性分析二、速測(cè)方法GB/T 5009.199-2003NY/T 448-2001適用范圍 蔬菜（蔥蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄含有抑制酶的植物次生物質(zhì)，易導(dǎo)致假陽性；葉綠素高的也會(huì)

4、干擾，這兩類可整株取樣） 適用葉菜(除韭菜)、果菜、豆菜、瓜菜、根菜(除蘿卜、茭白等)方法速測(cè)卡法(紙片法)和酶抑制率法(分光光度法)酶抑制率法(分光光度法)波長412nm4103nm酶乙酰膽堿酯酶（用pH8磷酸緩沖液溶解）（3min吸光度變化值0.3，4冰箱保存不超過4天）丁酰膽堿酯酶（用pH8磷酸緩沖液溶解）3min吸光度變化值0.40.8之間底物硫代乙酰膽堿（蒸餾水溶解，4冰箱保存不超過2周）碘化硫代丁酰膽堿（BTCI）（用pH8磷酸緩沖液溶解）顯色劑二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）+碳酸氫鈉緩沖液溶液，4冰箱保存二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）緩沖液溶解步驟取表面干凈的蔬菜或瓜果，葉菜類取

5、葉片部分，瓜果取表皮帶肉，剪成1cm左右見方碎片。取樣1g置于小燒杯內(nèi)，加入5mL緩沖溶液，振蕩1-2min，倒出并靜置3-5分鐘；于小試管內(nèi)分別加入2.5mL樣本提取液、100uL酶液、100uL顯色劑，搖勻后于37放置15min以上，加入100uL底物，應(yīng)立即倒入儀器比色皿中，記錄3min吸光度變化值。取2g切碎的樣本（非葉菜類取4g）放入提取瓶內(nèi)，加入20mL緩沖液，振蕩1-2min，倒出并靜置3-5分鐘；于小試管內(nèi)分別加入50uL酶液、3mL樣本提取液、50uL顯色劑，于37-38下放置30min后分別加入50uL底物，倒入比色皿中，用儀器測(cè)定。結(jié)果抑制率50%：陽性（陽性樣品需要重復(fù)

6、檢測(cè)2次以上，若不合格, 用色譜、質(zhì)譜等進(jìn)一步定性定量分析）抑制率70%：陽性（陽性樣品應(yīng)有2次以上的重復(fù)檢測(cè)，若不合格, 用色譜、質(zhì)譜等進(jìn)一步定性定量分析）備注1、當(dāng)溫度低于37時(shí)，酶反應(yīng)速度放慢，加入酶液和顯色劑后反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該延長，延長時(shí)間的確定，應(yīng)以空白對(duì)照測(cè)試3min吸光度變化值0.3方可進(jìn)行下一步操作。2、3min吸光度變化值0.3原因：酶的活性不夠；酶的活性太低。3、樣品檢測(cè)放置時(shí)間與空白的時(shí)間應(yīng)該一致。1、樣品檢測(cè)放置時(shí)間與空白的時(shí)間應(yīng)該一致。2、丁酰膽堿酯酶對(duì)樂果、甲基對(duì)硫磷、毒死蜱、二嗪磷等農(nóng)藥不太靈敏，檢出濃度均在10mg/kg以上。二、速測(cè)方法2結(jié)果計(jì)算抑制率（%）= 抑

7、制率：酶被抑制的程度Ac 對(duì)照組3min 后與3min 前吸光值之差; As 樣本3min 后與3min 前吸光值之差。二、速測(cè)方法3注意事項(xiàng)2011年首屆全省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)人員大比武現(xiàn)場(chǎng)操作評(píng)分細(xì)則（農(nóng)殘速測(cè)類） (2011年)中對(duì)取樣部位、處理方法等內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)的分項(xiàng)打分，這些打分項(xiàng)都是平時(shí)檢測(cè)中需要注意的地方。適用范圍：蔬菜（蔥蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄含有抑制酶的植物次生物質(zhì)，易導(dǎo)致假陽性；葉綠素高的也會(huì)干擾，這兩類可整株取樣） ；農(nóng)藥：有機(jī)磷和氨基甲酸酯類。所有操作步驟順序、加液量、處理時(shí)間一定要嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。建議使用同一批比色皿，不同批次的比色皿對(duì)結(jié)果可

8、能存在影響。一批上機(jī)樣品同時(shí)檢測(cè)，共用一個(gè)對(duì)照。 檢測(cè)前一定要檢查酶液活性（3min吸光度變化值0.3）；酶液反復(fù)解凍最多不超過兩次,否則會(huì)影響酶活性。二、速測(cè)方法4如何看待農(nóng)殘快速測(cè)定方法 何為快速檢測(cè)方法？ 指檢測(cè)速度相對(duì)較快、便于現(xiàn)場(chǎng)篩查的檢測(cè)方法。其主要適合于定性和半定量測(cè)定，檢測(cè)準(zhǔn)確度相對(duì)要差一些。 法律地位 中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法第三十六條規(guī)定“采用國務(wù)院農(nóng)業(yè)行政主管部門會(huì)同有關(guān)部門認(rèn)定的快速檢測(cè)方法進(jìn)行農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督抽查檢測(cè)，被抽查人對(duì)檢測(cè)結(jié)果有異議的，可以自收到檢測(cè)結(jié)果時(shí)起四小時(shí)內(nèi)申請(qǐng)復(fù)檢。復(fù)檢不得采用快速檢測(cè)方法?！?二、速測(cè)方法5農(nóng)殘速測(cè)與色譜、質(zhì)譜等方法的結(jié)果

9、比較 時(shí)間：從2005年至2007年。 項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部開展的省份間農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測(cè)互查。 要求：承擔(dān)任務(wù)的37個(gè)部級(jí)中心分別用農(nóng)殘速測(cè)進(jìn)行初步篩查，并把所有樣品用NY/T 761等方法進(jìn)行色譜、質(zhì)譜定量檢測(cè)。 目的：想驗(yàn)證速測(cè)與色譜檢測(cè)的相關(guān)性，如果有相關(guān)性，就可以先用速測(cè)初步篩查，然后把陽性（超標(biāo)的）樣品再用色譜等方法準(zhǔn)確定量，那樣可以大大減少工作量。 結(jié)論：速測(cè)結(jié)果和色譜等定量檢測(cè)結(jié)果幾乎沒有任何相關(guān)性。說白了就是速測(cè)超標(biāo)的，色譜檢測(cè)不出來，速測(cè)不超標(biāo)的，色譜可能會(huì)超標(biāo)。因?yàn)闆]有什么相關(guān)性，農(nóng)業(yè)部在省部級(jí)檢測(cè)中心這個(gè)層級(jí)最終導(dǎo)致放棄速測(cè)方法。所以，速測(cè)僅僅是法律認(rèn)可的一項(xiàng)工作，不要較真

10、，如被檢方有異議，更不能拿速測(cè)陽性結(jié)果進(jìn)行處罰和仲裁。二、速測(cè)方法6為什么采用農(nóng)殘快速檢測(cè)法 （非官方解釋最實(shí)在的理解） 鮮活農(nóng)產(chǎn)品不宜長時(shí)間保存，快速檢測(cè)方法克服了當(dāng)前所有準(zhǔn)確定量方法（色譜、質(zhì)譜方法等）檢測(cè)周期過長的問題?！緯r(shí)限性考慮】 我國研究院所和各地市針對(duì)特殊樣品，采用酶抑制法取得了與準(zhǔn)確定量方法（色譜、質(zhì)譜方法等）一致性結(jié)果?！舅^的科學(xué)依據(jù)】 快速檢測(cè)方法是經(jīng)過農(nóng)業(yè)部會(huì)同有關(guān)部門認(rèn)定發(fā)布的，經(jīng)法律認(rèn)可的方法，具有權(quán)威性和統(tǒng)一性（不過可靠性談不上）?！痉梢罁?jù)】 快速檢測(cè)方法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，易掌握，平時(shí)運(yùn)營成本相對(duì)較低，選用該法主要是從我國從業(yè)人員素質(zhì)、經(jīng)濟(jì)狀況的國情出發(fā)來考慮的（不

11、可能要求大家都去買質(zhì)譜、色譜等設(shè)備）?！痉椒ń?jīng)濟(jì)性、操控性】 明知快速檢測(cè)方法準(zhǔn)確度不高，選用該法，主要是在縣級(jí)、鄉(xiāng)鎮(zhèn)等一級(jí)進(jìn)行普及，讓經(jīng)營戶、老百姓發(fā)現(xiàn)有人在抓農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，更主要的是起到震懾作用。【震懾作用】【案例】河南省鄭州市農(nóng)殘快速檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)【案例】河南省鄭州市農(nóng)殘快速檢測(cè)網(wǎng)絡(luò)三、準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法1基本步驟：檢測(cè)前工作準(zhǔn)備提取凈化、濃縮定容標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和測(cè)定結(jié)果計(jì)算三、準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法2提取條件的優(yōu)化：QuEChERS方法選擇單一乙腈為提取溶劑。含水量低或含糖量高的樣品應(yīng)加入一定量的水后再進(jìn)行提取，以提高提取效率。乙腈對(duì)N-三鹵甲硫基殺菌劑類農(nóng)藥，具有降解作用，如克菌丹、抑菌靈等；

12、通過加入1%的醋酸，調(diào)節(jié)pH值，能夠抑制上述農(nóng)藥的分解。三、準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法3鹽析：鹽析劑種類：氯化鈉、醋酸鈉和硫酸銨等；鹽析劑能與水結(jié)合使游離水分子減少，減少了農(nóng)藥在水相中的溶解度；鹽析劑能減少有機(jī)溶劑在水中的溶解度；鹽析劑能使水相的比重增大，有助于分離。三、準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法4脫水劑的選擇：無水硫酸鎂吸水能力比無水硫酸鈉高3倍。無水硫酸鎂吸水的同時(shí)也放熱，促進(jìn)農(nóng)藥的萃取。無機(jī)鹽加入量（g）乙腈中的水分（加入前，%）乙腈中的水分（加入后，%）NaCl2g / 27mL276.0Na2SO40.8g / 4mL63.9MgSO40.8g / 4mL60.6三、準(zhǔn)確定性定量檢測(cè)法5凈化劑的選擇

13、：PSA提供伯氨基和仲氨基，相比氨基更能去除基質(zhì)干擾；主要用來消除各種有機(jī)酸、色素以及一些糖和脂肪酸。為了減少儀器的維護(hù)，往往在PSA的基礎(chǔ)上加C18凈化。PSA可去除90以上的脂肪酸和50左右的色素。GCB可去除90以上的色素，但對(duì)脂肪酸的凈化能力僅有10左右。對(duì)于一些含色素高的樣品，將兩者聯(lián)合使用。但用量要適當(dāng)，否則會(huì)吸附一些平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥，影響回收率，如六氯苯、百菌清等。凈化劑去雜種類PSA糖、有機(jī)酸、色素等C18油脂、非極性干擾物等GCB色素、甾醇、非極性干擾物等方法1：NY/T 761-2008方法名稱及來源：蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留檢測(cè)方法NY

14、/T 761-2008。農(nóng)藥種類和個(gè)數(shù)：有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥等共104種。使用儀器：GC、LC。檢測(cè)步驟：加入2 mL丙酮丙酮定容至5.0 mLGC檢測(cè)（ FPD）加入2 mL正己烷5 mL丙酮正己烷(1090)淋洗，重復(fù)一次依次5mL丙酮+正己烷(10+90), 5mL正己烷預(yù)淋弗羅里矽柱50 水浴氮吹近干正己烷定容5.0 mLGC檢測(cè)（ECD）加入2 mL甲醇二氯甲烷(1+99)2 mL甲醇二氯甲烷(1+99)淋洗，重復(fù)一次4 mL甲醇二氯甲烷(1+99)預(yù)淋氨基柱50 水浴氮吹近干甲醇定容2.50 mLHPLC檢測(cè)（柱后+熒光）過2 m濾膜25 g樣品 ，加入50

15、 mL乙腈高速勻漿2 min過濾到添加57 g氯化鈉的100 mL具塞量筒劇烈震蕩1 min后靜置30 min（實(shí)踐中10min即可）分取10mL有機(jī)相，旋蒸近干，洗耳球吹干或80 水浴氮?dú)鈸]干方法1：NY/T 761-2008方法2：NY/T 761、GB/T 19648和GB/T 20769等綜合法方法名稱及來源： NY/T 761-2008、GB/T 19648-2006和GB/T 20769-2008等，其中以GB/T 19648-2006為主。農(nóng)藥種類和個(gè)數(shù)： 有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯類和苯并咪唑類農(nóng)藥等800多種。使用儀器： GC、LC、GC-MS/MS和LC-MS/

16、MS。檢測(cè)步驟：所有洗脫液氮吹儀吹干；或旋蒸近干，洗耳球吹干5mL乙腈+甲苯預(yù)淋石墨化炭黑氨基柱（色素少，可用氨基柱代替）丙酮定容5.0 mL移取2.5 mL氮吹儀吹干，正己烷定容2.5 mLGC-MS/MS和GC檢測(cè)用2 mL乙腈甲苯(3+1)涮洗濃縮瓶并倒入SPE小柱，重復(fù)2次剩余約20mL乙腈+甲苯分次或1次倒入，淋洗小柱移取2.5 mL氮吹儀吹干，用甲醇+水（1+1）定容2.5 mLLC-MS/MS和HPLC檢測(cè)過0.22 m濾膜25 g樣品 ，加入50 mL乙腈高速勻漿2 min過濾到添加57 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中劇烈震蕩1 min后靜置30 min（實(shí)踐中10min即可

17、）分取10mL有機(jī)相，旋蒸或50 水浴氮?dú)庵两?，加? mL乙腈甲苯(3+1)洗脫液用量約為25mL方法2：NY/T 761、GB/T 19648和GB/T 20769等綜合法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和GB/T 20769等綜合法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和GB/T 20769等綜合法方法2：NY/T 761、GB/T 19648和GB/T 20769等綜合法方法3：優(yōu)化后的QuEChERS Method方法名稱及來源： 在美國農(nóng)業(yè)部的QuEChERS Method基礎(chǔ)上做了優(yōu)化和調(diào)整。 農(nóng)藥種類： 有機(jī)磷，有機(jī)氯，氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等多殘

18、留檢測(cè)。使用儀器： GC-MS/MS、LC/MS/MS。方法3：優(yōu)化后的QuEChERS Method原理： 與固相萃取(SPE)相似，都是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。優(yōu)點(diǎn)： 回收率高，對(duì)大量極性及揮發(fā)性的農(nóng)藥品種的回收率大于85%；精確度和準(zhǔn)確度高；可分析的農(nóng)藥范圍廣；速度快；溶劑使用量少，污染小，價(jià)格低廉且不使用含氯化物溶劑；操作簡(jiǎn)便；使用很少的玻璃器皿，裝置簡(jiǎn)單。方法3：優(yōu)化后的QuEChERS Method檢測(cè)步驟：(1)樣品粉碎；(2)單一溶劑乙腈提取分離；(3)加入MgSO4等鹽類除水；(4)加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)等吸附劑除雜；(5)上清液進(jìn)行GC-MS/MS、LC-MS/MS 檢測(cè)。檢測(cè)步驟：稱取10g樣品于50mL離心管中，加20mL乙腈,高速均質(zhì)2 min吸取0.5mL上層提取液于15mL離心管中，加入0.5 mL50%甲醇水溶液，渦旋混勻振搖后,5000