組織學(xué)制片技術(shù)應(yīng)用

1、組織學(xué)制片技術(shù)應(yīng)用 一、組織學(xué)技術(shù)的應(yīng)用組織學(xué)技術(shù)包括、組織學(xué)制片技術(shù)、胚胎學(xué)制片技術(shù)、組織化學(xué)技術(shù)、熒光組化及免疫組化技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、各種特殊顯微技術(shù)、電鏡組織學(xué)技術(shù)。組織學(xué)技術(shù)不但應(yīng)用于組織學(xué)本學(xué)科，并且廣泛應(yīng)用于其他多學(xué)科，如生物學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)、法醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)等。 二、組織學(xué)制片技術(shù)的分類組織學(xué)制片技術(shù)包括普通制片方法和特殊制片方法。制片方法又分為切片法和非切片法兩種。切片法分為石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片、等。非切片法分為鋪片、涂片、分離片、磨片、整裝片、超活體染色等。 三、組織學(xué)制片步驟取材 固定 沖洗 脫水 透明 浸蠟 包埋 修塊 切片 貼片 烤片 染色 封片

2、 觀察結(jié)果 （一）、組織取材1 動物的處死有麻醉放血處死法、有直接放血處死法。 （1）吸入麻醉法 、將浸透乙醚的棉花放入玻璃缸內(nèi),將動物放入玻璃缸內(nèi),蓋上玻璃蓋，觀察動物麻醉情況，放血處死,此法用于小動物。 （2）注射麻醉法、用3%戊巴比妥鈉按每公斤體重12ml靜脈注射或腹腔注射，麻醉后 立即放血處死,此法用于大動物。 （3）直接處死法、用金屬器械猛擊動物的后腦部或直接斷頭放血處死,此法適合于小動物。 2 動物的選擇動物的選擇是組織切片取材的第一步,在組織學(xué)中以人的組織為理想，但人的組織不易得到，根據(jù)教學(xué)的需要,大都以動物的組織來代替。但有些動物的組織器官比人的組織更為典型，如：豬的肝臟、豚鼠

3、胰腺、內(nèi)耳、貓的肋間肌 顯示運動終板，兔的皮下組織和腸系膜作活體染色較為理想 。 （1）猴：神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、雌雄生殖系統(tǒng)和特殊感官等。 （2）狗：呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等。（3）貓：消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉組織等。（4）兔：皮下組織、腸系膜、卵巢、肺、耳殼等。（5）羊：心臟、膀胱、雌雄生殖系統(tǒng)等。（6）豬：肝臟、骨髓、腦垂體等。（7）豚鼠：胰腺、內(nèi)耳、腎上腺等。 3 取材注意事項：（1）動物放血處死后立即取材，最好在心臟還在跳動時立即取材，馬上投入固定液中，（2）切取組織的刀剪必須鋒利，切分組織塊時

4、，不可來回切割。夾取組織時，鑷子要輕，切勿擠壓。以免損傷組織。（3）取材時確定部位和切面的方向。（4）組織塊應(yīng)力求小而薄,一般長為0.5厘米寬為0.5厘米厚為0.2厘米, （5）取材應(yīng)注意清潔，組織塊上如有血液、污物和粘液沾著，應(yīng)用生理鹽水洗滌后再入固定液。（二）固定 1 固定的目的 （1）能迅速阻止死后變化，防止組織的自容與腐敗。 （2）使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)凝固成不溶性物質(zhì),如蛋白質(zhì)、脂肪、酶等。 （3）使組織產(chǎn)生不同的折光率,染色后便于鑒別和觀察。 （4）對組織有媒染作用，使不同組織成分對染料有不同的親和力。 （5）能使組織硬化。 （6）能細(xì)胞各部分清晰。 2 固定的方法 （1）小塊組織固定、從人

5、體或動物取出組織，切從小塊投入固定液中固定。 （2）局部注射固定、某些組織和器官其固定液不易滲透或滲透較慢，滲透不均勻，還有些器官為保持外型或卷縮，可采取局部注射固定方法，固定46小時后，再將組織切成小塊繼續(xù)投入固定液中固定。 （3）整體注射固定、此法主要用于科研和大體解剖，亦可用于組織學(xué)教學(xué)制片。3 固定液固定液分為單純固定液和混合固定液兩種。 單純固定液 （1）甲醛、它是一種還原劑，呈酸性,原液濃度為37%40%，配成固定液的濃度為4%，習(xí)慣上稱為10%，配制時取甲醛原液10ml，加D.W或緩沖液至100ml,為甲醛固定液。甲醛滲透力強，固定均勻。但脫水后有較大收縮，在某些方法中要求中性甲

6、醛，可在原裝瓶內(nèi)放入碳酸鎂使其沉淀為2CM，pH為7.6，也可以加粉筆數(shù)根，可長期保持中性。加碳酸鈣pH為6.5,固定后，可以直接進(jìn)入脫水劑脫水，如固定時間較長，需在流水中沖洗2448小時,否則影響染色效果。 （2）酒精、它是一種還愿劑，用于組織固定以95%的濃度為宜，酒精固定后的組織細(xì)胞核著色不良，一般用于糖元的固定， （3）升汞、有稱氯化汞，為劇毒藥品，使用時特別注意，它與其它藥物混合使用對細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)固定良好。 （4）苦味酸、為黃色結(jié)晶，干燥易燃燒、爆炸，通常加入蒸餾水制作飽和液保存，它的滲透力弱，一般不單獨使用，與其它藥物混合使用。 （5）冰醋酸、含量為99%，在低溫時結(jié)成冰狀，對染

7、色質(zhì)固定良好，所以在多種混合固定中液都用它。 （6）重鉻酸鉀、水溶液呈弱酸性，它為強氧化劑，不能與酒精等還原劑混合，但與甲醛混合也不能保存過久一般在1224小時失去作用，重鉻酸鉀固定組織穿透速度快。但必須流水沖洗。 混合固定液、上述某一種單純固定液不能將組織內(nèi)的各種成份保存下來，各種藥物均有選擇性，滲透能力也不同，收縮或膨脹也不相同，因此多配成混合固定液。（1）Zenker氏液 重鉻酸鉀 2.5g 升汞(綠化汞） 5g D.W 100ml 此液為Zenker氏保存液 (在臨用時取保存液100ml,加冰醋酸5ml即為Zenker氏固定液)。 （在臨用時取保存液100ml,加商品甲醛5ml即為He

8、lly氏固定液）此兩種固定液，對細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核固定很好，Helly氏固定液對神經(jīng)系統(tǒng)固定較好，固定時間24小時，流水沖洗24小時，染色時必須去汞處理。 （2）Susa氏液 升汞(氯化汞） 4.5g 氯化鈉 0.5g 三氯醋酸 2g D.W 80ml 冰醋酸 4ml 甲醛 20ml (后兩種成份在臨用時再加入)此固定液滲透速度快，對組織收縮小是一種優(yōu)良的固定液，特別對消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、肌肉組織的固定效果好，固定時間612小時,固定后不經(jīng)沖洗,可直入70%酒精脫水,但組織切片染色時必須去汞。（3）Bouin氏液 苦味酸飽和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml此液為胚胎學(xué)與組織學(xué)常用固

9、定液，滲透速度快，收縮小，組織固定均勻，保持結(jié)構(gòu)完整，適合于各種胚胎連續(xù)切片，對于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定為12-24小時,但固定過久,對堿性染料著色不利。 （4）Regaud 氏液 3%重鉻酸鉀水液 80ml 中性福爾馬林 20ml 此液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，此液為線粒體、嗜鉻細(xì)胞和神經(jīng)膠織細(xì)胞的優(yōu)良固定劑。固定時間2-3天后，再以3%重鉻酸鉀固定5-7天，固定后流水沖洗。（5）Carnoy氏液 純酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml此固定液滲透速度快，2mm以下小塊組織固定時間24小時，它是細(xì)胞極好的固定液適合于細(xì)胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入純酒精脫水。 4

10、 組織固定應(yīng)注意的問題（1）所取的組織材料必須新鮮，動物死后在半小時內(nèi)固定為最好，組織塊不能太大。必須在0.5cm長、0.5cm寬、0.2cm厚（2）根據(jù)所取的材料要求和實驗的需要，選擇合適的固定液，（3）固定時間，根據(jù)組織塊的大小和氣溫可按具體情況增減，一般以24小時為宜，（4）固定液的量，一般以組織的大小30倍為宜，可在固定組織的器皿底下墊上脫脂棉或紗布，使固定液滲透組織均勻。 （5）柔軟的新鮮組織不易切成小塊，先整體固定或注射固定，使組織硬化后再切成小塊繼續(xù)固定。（二）組織沖洗組織經(jīng)固定液固定后，一般必須用水沖洗，沖洗的目的。一方面是停止固定液對組織繼續(xù)固定，另一方面是除去組織中的固定液

11、，（1）瓶裝沖洗法、將固定好的組織放入廣口瓶內(nèi)，在瓶口上系好紗布，用一根橡皮管，一頭插入瓶口內(nèi)，一頭接上水龍頭上，開啟一定的水流量，沖洗24小時。（2）水槽沖洗法、用一個有機玻璃制作的水槽盒，將固定好的組織倒入水槽盒內(nèi)，在水龍頭下，開啟一定的水流量，沖洗24小時。（四）組織脫水 組織經(jīng)水沖洗后,含有較多的水分，必須用脫水劑除去組織內(nèi)所含的的水分，才能進(jìn)行下一步組織透明和石蠟包埋，在普通組織學(xué)制片中，脫水劑的種類很多，通常多用酒精脫水，脫水劑在任何條件下必須都能與水混合，同時又能與透明劑混合，為了減少組織的收縮和硬脆，脫水劑由低濃度到高濃度逐級上升，脫水的時間應(yīng)根據(jù)組織塊體積和厚度而定。組織脫水

12、過程和時間23mm厚的組織脫水時間50% 6-8小時 95% （2）2-4小時 70% 6-8小時 100%（1）1-2小時 80% 4-6小時 100%（2）1-2小時 95%（1） 2-4小時（五）組織透明組織經(jīng)酒精脫水后，還不能進(jìn)行浸蠟包埋，因組織內(nèi)含有酒精成分，酒精不能與石蠟混合，需要經(jīng)過一種酒精與石蠟之間的媒浸物，即透明劑，透明劑即能與酒精混合又能與石蠟混合，透明劑則能取代酒精，使組織成透明狀態(tài)，液狀石蠟?zāi)苋〈该鲃┒虢M織間隙中，這樣便十順利的達(dá)到組織埋藏的目的。在組織學(xué)中透明劑的種類很多，一般常用的透明劑是二甲苯，易揮發(fā)，有一定毒性，透明力強，組織在二甲苯中時間不宜過久，否則組

13、織易收縮變硬變脆，在浸入二甲苯透明之前，組織必須經(jīng)二甲苯和純酒精各半的混合液中過度，然后再進(jìn)入二甲苯透明，透明時間二甲苯純酒精液中2-3小時二甲苯（1）中 1-2小時二甲苯（2）中 1-2小時（六）組織浸蠟浸蠟是石蠟包埋的重要過程,將透明的組織進(jìn)入熔化的石蠟中,讓液狀石蠟通過組織的間隙浸透到組織中去,然后包埋成組織蠟塊,便于石蠟切片。石蠟分為軟蠟和硬蠟,熔點在54-56為軟蠟,熔點在56-58或60-62為硬蠟，組織浸蠟先軟蠟后硬蠟。組織浸蠟的過程和時間組織浸蠟的全過程必須在60的恒溫箱中進(jìn)行，在恒溫箱內(nèi)放入2-4個蠟杯，分別放入軟蠟和硬蠟使之熔化，將已透明的組織放入軟蠟浸20分鐘，然后移硬蠟

14、浸40分鐘，組織體積的大小與浸蠟的時間有關(guān)，請參看組織學(xué)與組織化學(xué)一書的34頁表格。（七）組織包埋組織浸蠟完畢后，要進(jìn)行石蠟包埋，石蠟包埋操作過程（1）組織進(jìn)入硬蠟后，開始作包埋準(zhǔn)備。（2）將金屬包埋框裝好在保溫臺上。（3）將熔點為60-62石蠟置電爐上熔化，溫度控制在65左右，（4）點燃酒精燈，準(zhǔn)備好無齒鑷，需作標(biāo)記的寫好標(biāo)簽，（5）包埋開始，將熔化的包埋石蠟（溫度在65左右）倒入金屬包埋框內(nèi)，倒?jié)M為即可，（6）用無齒鑷從60恒溫內(nèi)把浸好硬蠟的組織取出迅速放入包埋框內(nèi)，待冷卻凝固。石蠟包埋注意事項（1）組織從硬蠟中取出放入包埋框內(nèi)要快,不能在空間停留過久，否則組織表面上的蠟會被凝固.（2）組

15、織包埋時,要確定組織切面和方向。（八）組織修塊將已凝固的蠟條從包埋框取出，修成蠟塊,在修塊時刀子不能挨著組織切下去,蠟塊四周要留0.2cm的蠟邊.蠟塊修好后放入冰箱中保存?zhèn)溆?(九)組織切片（1）磨好切片刀，刀口要鋒利，用顯微鏡檢查刀口有無缺口，（2）把被切的蠟塊固定在切片機的載物頭上，調(diào)整蠟塊平面。（3）把切片刀固定在切片機的刀架上，調(diào)整好蠟塊與刀口的距離，調(diào)整切片厚度，一般4-6微米，搖動切片機切片。石蠟切片常遇到的問題和解決的方法，見組織學(xué)與組織化學(xué)技術(shù)一書的40-41頁。（十）組織貼片貼片方法有三種（1）直接貼片法（2）伸展器貼片法（3）溫水漂浮貼片法（十一）烤片（十二）組織染色染色的

16、步驟（1）組織脫蠟（二甲苯1）10-15分鐘（2）組織脫蠟（二甲苯2）3-5分鐘（3）組織進(jìn)入100%酒精 2-3分鐘（4）組織進(jìn)入95%酒精 2-3分鐘（5）組織進(jìn)入70%酒精 2-3分鐘如固含有汞的固定液固定的組織必須進(jìn)入碘酒精去汞，（6）組織進(jìn)入1%碘酒精 2-3分鐘（7）自來水洗 0,5-1分鐘（8）5%硫代硫酸鈉 1-2分鐘（9）自來水洗 0,5-1分鐘（10）蒸餾水洗 0.5-1分鐘（11）組織進(jìn)入蘇木精染色 10-15分鐘（12）自來水洗 0,5-1分鐘（13）0.5%鹽酸酒精分色 10-20秒（14）自來水洗 0,5-1分鐘（15）在普通水中藍(lán)化 10-15分鐘（16）進(jìn)入伊紅

17、染色 3-5分鐘（17）進(jìn)入95%酒精 （1）分色 1-3分鐘（18）進(jìn)入95%酒精 （2）脫水 2-3分鐘（19）進(jìn)入100%酒精（1）脫水 2-3分鐘（20）進(jìn)入1005酒精（2）脫水 2-5分鐘（21）進(jìn)入二甲苯（1）透明30分鐘-1小時（22）進(jìn)入二甲苯（2）透明30分鐘（23）用中性樹膠封固（24）結(jié)果觀察四玻璃器皿的清洗（1）臟的玻璃器皿在水中浸泡1-2天（2）用毛刷和肥皂粉刷洗干凈，在流水下沖洗干凈晾干,入硫酸洗滌劑中浸泡1-2天，（3）從硫酸洗滌劑中撈出，在流水下沖洗數(shù)小時，盡量把酸沖洗干凈，然后再一個一個的在流水沖洗干凈，最后用雙蒸水刷洗1-2次，進(jìn)入60的烤箱烤干備用。五、蓋玻片的清洗（1）將蓋玻片放入濃鹽酸中浸泡2-3天，（2）從濃鹽酸中撈出蓋玻片，在流水下沖洗數(shù)小時,盡量把酸沖洗干凈。（3）將沖洗好的蓋玻片放入燒杯中，用蒸餾水刷洗2-3次，盡量把水瀝干。（4）將95%或100%的酒精倒入燒杯中進(jìn)行脫水處理1-2次，在燒杯口