植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用

1、植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用課題1 菊花的組織培養(yǎng)一、原理：課題1：菊花的組織培養(yǎng)細(xì)胞的全能性定義： 已經(jīng)分化的細(xì)胞，仍然具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。原理： 生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因。受精卵生殖細(xì)胞體細(xì)胞全能性的比較:二、植物組織培養(yǎng)細(xì)胞離體必要條件：一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件原理:細(xì)胞的全能性從活植物體上切下進(jìn)行培養(yǎng)的那部分細(xì)胞、組織或器官相關(guān)概念:外植體植物組織培養(yǎng)流程圖脫分化：再分化：愈傷組織:細(xì)胞排列疏松而無(wú)規(guī)則,是高度液泡化的、成無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程，稱為植物細(xì)胞的脫分化，或

2、去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或者芽等器官，這個(gè)過(guò)程叫做再分化。人參的愈傷組織菠蘿的愈傷組織1、影響植物組織培養(yǎng)的因素（1）植物材料的選擇煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)比較難同一植物材料的年齡、保存時(shí)間的長(zhǎng)短會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開(kāi)花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝（2）培養(yǎng)基的配置MS培養(yǎng)基主要成分包括：大量元素: N、P、 S 、 K、Ca、Mg等微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、 Co等有機(jī)物、植物激素討論：你能說(shuō)出各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？答：微量元素

3、和大量元素提供植物細(xì)胞生活所必需的無(wú)機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，同時(shí)能夠維持細(xì)胞的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，無(wú)機(jī)鹽混合物包括植物生長(zhǎng)必須的大量元素和微量元素兩大類。 常用的植物激素：生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素生長(zhǎng)素類：（2，4D）、（IAA）、（NAA）、（IBA）細(xì)胞分裂素類：激動(dòng)素（KT）、6芐基嘌呤（ 6BA）、玉米素（ZT）赤霉素類：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影響生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素作用植物中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和

4、再分化的關(guān)鍵性激素。在生長(zhǎng)素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)的趨勢(shì)使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果先使用生長(zhǎng)素，后使用細(xì)胞分裂素有利于細(xì)胞分裂，但不利分化先使用細(xì)胞分裂素后使用生長(zhǎng)素細(xì)胞既分裂也分化同時(shí)使用分化頻率高生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：有利于根的分化生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素：生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素生長(zhǎng)素再分化植物細(xì)胞培養(yǎng)1、培育無(wú)病毒植株2、 培養(yǎng)紫草愈傷組織,提取紫草素（治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）4、基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法4、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用： 3、誘導(dǎo)離體的植物組織形成具有生根發(fā)芽能力的胚狀體結(jié)構(gòu)，包裹上人造種皮，制成人工種子，可以解決有些作物品種繁殖能力差，結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問(wèn)

5、題人工種子二、實(shí)驗(yàn)操作（一）制備MS固體培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基包括20多種營(yíng)養(yǎng)成分，實(shí)驗(yàn)室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來(lái)制備1、配置各種母液無(wú)機(jī)物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存激素類、維生素類以及用量較小的有機(jī)物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨(dú)配制成母液用母液配制培養(yǎng)基時(shí)，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量2、配置培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml 配制培養(yǎng)液 調(diào)PH培養(yǎng)基的分裝 由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素3、滅菌分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進(jìn)行高壓蒸汽滅菌1、選材：菊花莖段，取生長(zhǎng)旺盛的嫩枝（二）外植體消毒2、消毒流水

6、沖洗菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右 酒精處理用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70的酒精中搖動(dòng)23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無(wú)菌水中清洗 消毒液處理取出后用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無(wú)菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液（三）接種污染的主要來(lái)源是空氣中的細(xì)菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒， 酒精或新潔爾滅搽洗工作臺(tái)并用紫外線照射20分鐘1、接種室消毒2、無(wú)菌操作要求操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即

7、蓋好瓶蓋。3、材料的切取和接種4、接種注意事項(xiàng)每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分?jǐn)?shù)為75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜34塊，菊的莖或葉68塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和光照條件插入時(shí)應(yīng)注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分思考：你打算做幾組重復(fù)？你打算設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)嗎？答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復(fù)。設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以取用一個(gè)經(jīng)過(guò)滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格，沒(méi)有被雜菌污染。（四）培養(yǎng)1、愈傷

8、組織的培養(yǎng)從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過(guò)2周時(shí)間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長(zhǎng)出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時(shí)，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見(jiàn)光，因?yàn)樵跓o(wú)光條件下愈傷組織長(zhǎng)的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下，將愈傷組織連同原來(lái)的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會(huì)分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長(zhǎng)到直徑為11.5cm時(shí)，就可以進(jìn)行試管苗培養(yǎng)，否則還需進(jìn)行第二代繼代培養(yǎng)2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開(kāi)，讓愈傷組織見(jiàn)光，愈傷組織見(jiàn)光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色3、試管苗的培養(yǎng)當(dāng)愈傷組織長(zhǎng)到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進(jìn)行試管苗的見(jiàn)光培養(yǎng)（五）移栽移栽生根的菊花試管苗之前，應(yīng)先打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長(zhǎng)幾日1、打開(kāi)封口膜2、清洗轉(zhuǎn)移用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過(guò)毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時(shí)間