細菌學檢驗概論

1、臨床細菌學檢驗概述 Introduction on Clinic and Diagnostic Bacteriology學系病原周 天 戟 教 授7/14/20221本章內(nèi)容第一節(jié) 標本的采集和處理原則第二節(jié) 細菌的形態(tài)學檢查第三節(jié) 細菌的分離培養(yǎng)和鑒定第四節(jié) 細菌的非培養(yǎng)檢測方法7/14/20222第一節(jié) 標本的采集和處理原則一、標本采集的一般原則1早期采集 2無菌操作 3根據(jù)目的菌的特性用不同的方法采集4采集量適當 5注意生物安全 7/14/20223第一節(jié) 標本的采集和處理原則二、標本的處理1. 對環(huán)境敏感的細菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌等應(yīng)保溫并立即送檢2. 其他各種標本

2、采集后最好在2h之內(nèi)送到實驗室3. 若不能及時送檢，標本應(yīng)置于一定環(huán)境中保存4. 一般情況下，用于細菌培養(yǎng)的標本保存時間不應(yīng)超過24h7/14/20224.病人標本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護.標本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出.對于烈性傳染病標本運送時更要特別嚴格，必須按規(guī)定包裝，由專人運送.厭氧性標本應(yīng)放在專門的運送瓶或試管內(nèi)運送，有時可直接用抽取標本的注射器運送7/14/20225藥物敏感試驗標本直接涂片鏡檢分離培養(yǎng)形態(tài)學試驗生化試驗免疫學試驗動物試驗明確診斷初步診斷免疫學試驗分子生物學技術(shù)其他檢測技術(shù)細菌感染的檢驗程序輔助診斷7/14/

3、20226第二節(jié) 細菌的形態(tài)學檢查1.鏡檢可以了解有無細菌及大致的菌量2.通過形態(tài)學檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義3.根據(jù)細菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性有助于對病原菌的初步識別和分類，用于細菌鑒定細菌形態(tài)學檢查的意義7/14/20227不染色標本的檢查：初步觀察、細菌動力單染色法：細菌形態(tài)復(fù)染色法：細菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)與鑒別 革蘭染色法（Gram stain） 抗酸染色法（acid-fast stain）特殊染色法：負染色、鞭毛染色細菌的形態(tài)學檢查法7/14/20228一、不染色標本1.細菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態(tài)下細菌的動力及運動狀況2.常用的方法有壓滴法和懸滴

4、法 有動力：可看到細菌自一處移至另一處，有明顯 的方向性位移 無動力：細菌呈現(xiàn)布朗運動，只在原地顫動而無 位置的改變3.有些病原菌通過不染色標本的動力檢查可作出初步鑒定 如疑似霍亂患者，鏡下觀察到來回穿梭似流星狀運動的細菌，制動試驗陽性，可初步推斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。7/14/20229二、染色標本（一）常用染料1堿性染料：堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍等2酸性染料：有伊紅、剛果紅等3復(fù)合染料（中性染料）及熒光染料：復(fù)合染料有瑞氏染料（伊紅美藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料有熒光標記的抗體 7/14/202210（二）常用的染色方法1革蘭染色（gram stain）方法： 1、結(jié)晶紫初染

5、 1 min 2、盧戈氏碘液媒染 1 min 3、95酒精脫色 30sec1 min 4、稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染 1 min原理：G+等電點低，帶正電荷的堿性燃料作色牢固G+細胞壁肽聚糖層多，G-細胞壁脂質(zhì)含量高G+含有較多核糖核酸鎂鹽，與結(jié)晶紫、碘結(jié)合成大分子復(fù)合物意義：鑒定細菌與致病性有關(guān)選擇抗菌藥物參考革蘭陰性桿菌革蘭陽性球菌7/14/202211（二）常用的染色方法2抗酸染色（acid-fast stain） 方法：1、石炭酸復(fù)紅初染加熱35min，水洗2、3% 5%鹽酸酒精脫色30s，水洗3、堿性美藍復(fù)染30s，水洗。原理：分枝桿菌屬的細菌，胞壁脂質(zhì)多，其中的分枝菌酸與石炭酸復(fù)紅結(jié)合成牢

6、固的復(fù)合物，能抵抗脫色意義：可將細菌分為兩大類： -抗酸性細菌 -非抗酸性細菌7/14/202212（二）常用的染色方法3熒光染色 （1）熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。（2）主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。4.鞭毛染色：可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。5.異染顆粒染色：用于白喉棒狀桿菌染色。7/14/202213（二）常用的染色方法6.芽胞染色：7.墨汁染色: 一般用于新型隱球菌檢查7/14/202214第三節(jié) 細菌的分離培養(yǎng)和鑒定選擇培養(yǎng)基接種選擇培養(yǎng)方

7、法選擇可疑菌落選擇鑒定方法7/14/202215細菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇 培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基的選擇二、分離及培養(yǎng) 細菌的分離、細菌培養(yǎng)方法三、生化反應(yīng)和鑒定 碳水化合物的代謝試驗 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗 碳源和氮源利用試驗7/14/202216一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基（culture medium） 是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。 7/14/202217(一)培養(yǎng)基的組成成分1營養(yǎng)物質(zhì) 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、 無機鹽類、雞蛋和動物血清生長因子2凝固物質(zhì) 瓊脂、明膠、卵白3抑制劑和指示劑7/14/20

8、2218（二）培養(yǎng)基種類-按成分和培養(yǎng)目的1基礎(chǔ)培養(yǎng)基（based medium）2營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient medium）3鑒別培養(yǎng)基（differential medium）4選擇培養(yǎng)基（selective medium）5特殊培養(yǎng)基（special medium）7/14/2022191基礎(chǔ)培養(yǎng)基 含有基礎(chǔ)生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。 用于培養(yǎng)一般細菌7/14/2022202營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient medium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等，用于培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高的病原性細菌7/14/202221 3鑒別培

9、養(yǎng)基（differential medium） 在培養(yǎng)基中加入特定底物和指示劑，觀察細菌不同的代謝產(chǎn)物，以鑒別細菌。如糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅-鎂藍瓊脂和動力-吲哚-尿素（MIU）培養(yǎng)基等。7/14/2022224選擇培養(yǎng)基（selective medium）在培養(yǎng)基中加入抑制劑抑制雜菌，以利目的細菌生長，如SS瓊脂使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到7/14/2022235特殊培養(yǎng)基（special medium） 皰肉培養(yǎng)基用于培養(yǎng)厭氧菌巰基乙醇酸納培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細菌L型7/14/202224（二）培養(yǎng)基種類-按物理性狀液體培養(yǎng)基：增菌、制備產(chǎn)物、生化反應(yīng)等固體培養(yǎng)基: 瓊脂平

10、板: 分離培養(yǎng) 瓊脂斜面: 菌種短期保存、生化反應(yīng)等半固體培養(yǎng)基:動力試驗、菌種長期保存、生化反應(yīng)等7/14/202225（三）培養(yǎng)基的選擇目的病原菌：伊紅美藍/麥康凱用于篩選革蘭陰性桿菌，血平板用于分離病原性球菌。標本來源：從血液、骨髓中分離病原菌先用血液肉湯增菌，糞便標本分離培養(yǎng)腸道病原菌用SS瓊脂，7/14/202226二、分離及培養(yǎng)1平板劃線分離法2斜面接種法3液體接種法（一）細菌的接種4穿刺接種法5傾注平板法6涂布接種法7/14/202227（二）細菌培養(yǎng)方法 1一般（需氧）培養(yǎng)法：普通溫箱 2二氧化碳培養(yǎng)法 ：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱 3厭氧培養(yǎng)法：厭氧袋/罐（化學）法、厭氧培養(yǎng)箱（

11、物理學法）、皰肉培養(yǎng)基（生物學）法7/14/202228固體培養(yǎng)基中菌落（S型）菌苔菌落（R型）細菌的生長情況7/14/202229沉淀生長混濁生長表面生長液體培養(yǎng)基中7/14/202230混濁生長沿穿刺線生長生長有鞭毛細菌無鞭毛細菌半固體體培養(yǎng)基中7/14/202231三、生化反應(yīng)和鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗 1. 糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗 是鑒定細菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要7/14/202232氧化型發(fā)酵型產(chǎn)堿型2氧化發(fā)酵試驗（O/F試驗）主要用于腸桿菌科細菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。7/

12、14/2022333半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗） 迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細菌為陰性。本試驗主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。7/14/202234三、生化反應(yīng)和鑒定4七葉苷水解試驗 主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。5甲基紅試驗 主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌。6VP試驗 本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的 細菌，后者通常為陰性。7/14/202235（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗2吲哚(靛基質(zhì))試驗 主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。1.明膠液化試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。3硫化氫試驗培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基 應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種

13、鑒別7/14/202236三、生化反應(yīng)和鑒定4尿素分解試驗 主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。5苯丙氨酸脫氨酶試驗 主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細菌均為陽性，腸桿菌科中其他細菌均為陰性。6氨基酸脫羧酶試驗 主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。7/14/202237（三）碳源和氮源利用試驗1枸櫞酸鹽利用試驗 用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。2丙二酸鹽利用試驗 腸桿菌科中屬間及種的鑒別。7/14/202238（四）各種酶類試驗1氧化酶試驗主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別。2過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）用于革蘭陽性球菌的初步分群。7/14/202239 3硝酸鹽還原試

14、驗 本試驗在細菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。7/14/202240三、生化反應(yīng)和鑒定4脂酶試驗 主要用于厭氧菌的鑒別。5卵磷脂酶試驗 主要用于厭氧菌的鑒定。6 DNA酶試驗 在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。7/14/202241三、生化反應(yīng)和鑒定8 CAMP試驗 在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。7 凝固酶試驗作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。7/14/202242

15、（五）抑菌試驗1 O/129抑菌試驗 用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。2桿菌肽試驗用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別。3奧普托欣（Optochin）試驗主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。7/14/202243第四節(jié) 細菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學技術(shù) 抗原檢測、抗體檢測二、分子生物學技術(shù) 核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、生物芯片技術(shù)三、細菌毒素的檢測 內(nèi)毒素、外毒素四、動物實驗 7/14/202244一、免疫學技術(shù)概念辨析免疫學檢測免疫學診斷免疫學反應(yīng)免疫學技術(shù)血清學檢測血清學反應(yīng)血清學技術(shù)血清學診斷抗原 不區(qū)分 抗體7/14/202245（一）細菌Ag

16、檢測菌體Ag： IFA、熒光菌球法、凝集試驗游離Ag ： ELISA 免疫熒光技術(shù)是利用免疫學特異性反應(yīng)與熒光示蹤技術(shù)相結(jié)合的顯微鏡檢查手段。既保持了血清學的高特異性，又極大地提高了檢測的敏感性，在細菌鑒定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、間接法和免疫熒光菌球法。血清學試驗的對照設(shè)計+/0？7/14/202246（二）抗體檢測-血清學診斷 抗體的量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價的升高。因此用已知的細菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。主要適用于抗原性較強的致病菌和病程較長的感染性疾病。7/14/202247標本：雙份血清標本，恢復(fù)期比急

17、性期血清標本抗體效價升高4倍方有意義方法原理：用已知的細菌或其特異性抗原檢測患者體液中相應(yīng)特異性抗體和其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。凝集試驗：沉淀試驗：補體結(jié)合試驗：中和試驗：肥達試驗、外斐試驗梅毒VDRL、RPR試驗等抗鏈“O”試驗等Q熱柯克斯體抗體檢測等細菌的血清學診斷7/14/202248二、分子生物學技術(shù)（一）核酸雜交 DNA可進行變性、復(fù)性、雜交。利用這一特性，制備特定序列DNA片段，進行標記后用作探針，在一定條件下，按照堿基互補配對原則與標本中已變性的細菌DNA進行雜交，通過檢測雜交信號確定是否發(fā)生雜交反應(yīng)，從而鑒定標本中有無相應(yīng)的病原菌基因。探針的種類： 克隆片段

18、DNA探針、寡核苷酸針、質(zhì)粒DNA探針、rRNA探針、7/14/202249（一）核酸雜交 2核酸雜交在臨床細菌檢測中的應(yīng)用（1）細菌分類鑒定（2）細菌快速鑒定（3）細菌耐藥性的檢測（4）細菌毒素的檢測（5）細菌流行病學調(diào)查7/14/202250（二）聚合酶鏈反應(yīng)（ polymerase chain reaction, PCR ）1. 特異性DNA體外擴增技術(shù)2. 特異、靈敏、快速、操作簡便3. 廣泛應(yīng)用于細菌的鑒定PCR在臨床細菌檢測中的應(yīng)用1. 細菌的快速檢測 2. 細菌毒素的檢測 3. 細菌耐藥性的檢測 4. 細菌流行病學調(diào)查 7/14/202251（三）生物芯片技術(shù) 1. 通過微加工技

19、術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建微型生物化學分析系統(tǒng)。 2. 對細胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組的準確、快速、大信息量的檢測。 3. 常用的生物芯片分為二大類：即基因芯片和蛋白芯片。7/14/202252三、細菌毒素的檢測 （一）內(nèi)毒素內(nèi)毒素的測定，主要用于確診病人是否發(fā)生革蘭陰性細菌感染。另外，還可用于檢測注射用液和生物制品有無內(nèi)毒素污染。 方法：鱟試驗。 7/14/202253三、細菌毒素的檢測（二）外毒素 外毒素的測定可用于待檢菌的鑒定， 同時可區(qū)分產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株。 方法： 1. 體內(nèi)毒力試驗：動物試驗 ，如破傷風毒素試驗 2. 體外毒力試驗 ：Ag-Ab反應(yīng)，如ELEK平板毒力測定7/14/202254其他成分檢測酶試驗：脲酶 (HP)、血漿凝固酶試驗 (葡萄球菌)、自溶酶(肺炎球菌)等毒素檢測：溶血毒素(鏈球菌) 、腸毒素(葡萄球菌) 、 神經(jīng)毒素(肉毒桿菌)等特殊成