課題計劃項目以與可行性研究報告

1、WORD格式10/10XX省重點研發(fā)方案工程申報書課題題目為：瓊脂糖自組裝膜基底型免疫芯片載體制備及抗體固定研究工程內(nèi)容摘要：研究意義： 為了提升免疫芯片對抗體的固定效率，建立多糖納米膜基底型芯片載體制備的新方法，為后續(xù)免疫芯片的制備提供實驗參考和理論支持。研究內(nèi)容：本文選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質(zhì)，利用分子自組裝技術(shù)，以玻片為載體，讓瓊脂糖、高碘酸鈉對玻片外表進展修飾，制備瓊脂糖自組裝膜載體。利用SEM、 AFM和FTIR 對載體進展表征，獲得最正確制備條件；利用熒光顯微成像及ImageJ 軟件，研究該載體對 2 種不同種屬來源抗體的固定效率，對瓊脂糖自組裝膜載體和普通醛基修飾載體對抗體的

2、固定效果進展比照分析。WORD格式關(guān)鍵字瓊脂糖; 免疫芯片; 抗體固定WORD格式工程概況1、主要研究開發(fā)內(nèi)容選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質(zhì)，利用分子自組裝技術(shù)，以玻片為載體，讓瓊脂糖、高碘酸鈉對玻片外表進展修飾， 制備瓊脂糖自組裝膜載體。 利用 SEM、AFM和 FTIR 對載體進展表征，獲得最正確制備條件；利用熒光顯微成像及 ImageJ 軟件，研究該載體對 2 種不同種屬來源抗體的固定效率， 對瓊脂糖自組裝膜載體和普通醛基修飾載體對抗體的固定效果進展比照分析。材料：瓊脂糖、 3- 氨基丙基三甲氧基硅烷( APTES) ( Sigma公司，美國 ) ，高碘酸鈉、戊二醛、 36%冰乙酸、無水

3、乙醇等均為分析純( 國藥集團化學(xué)試劑有限公司 ); FITC 標記的驢抗兔抗體 ( XX生工 ) ，F(xiàn)ITC 標記的兔抗人 AFP抗體 ( 上海生工)。器械：超純水機、電子天平、磁力攪拌器、烘干箱，JSM- 6360LV 型上下真空掃描電鏡， FTS3000FX型的傅立葉變換紅外光譜儀，OLYMPUS BX51型倒置熒光顯微鏡， Nanoscope IIIa型原子力顯微鏡?；念A(yù)處理： 25 mm75 mm光學(xué)載玻片用氨水洗液 ( 體積比為氨水過氧化氫水= 115) 置搖床上振搖2 h，取出后用超純水清洗干凈，放入1mol/L HCl 中浸泡過夜，再用超純水超聲10 min，無水乙醇超聲清洗

4、2 次，每次 5 min，置電熱恒溫箱 (120 ) 烘烤 2 h 。實驗組瓊脂糖自組裝膜載體制備，對照組進展普通醛基載體制備。基片外表抗體探針的固定，測定觀察載體外表熒光探針的固定效率。WORD格式2、主要技術(shù)和經(jīng)濟指標限1000字WORD格式主要技術(shù)：瓊脂糖自組裝膜載體制備分別配制0. 6%、0. 8%、1. 0%、1. 2%、1. 4%的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸3 min完全溶解 ;將 2 ml瓊脂糖溶液覆蓋在60預(yù)熱的清潔玻片上 ;瓊脂糖室溫凝固后，置37烤箱烘干2 h;置室溫保存?zhèn)溆?;將上述制備好的瓊脂糖玻片置于50 mmol /L NaIO4溶液中室溫下活化 60 min 。接著用

5、 0. 1 mol /L pH7. 4 PBS洗滌 5 min 3次，氮氣流吹干。WORD格式XX省重點研發(fā)方案工程申報書普通醛基載體制備： 按照文獻中的方法制備普通醛基載體。清洗好的玻片浸APTES活化試劑 ( 丙酮稀釋 ) 中 20 min 后取出，玻片用丙酮、去離子水沖洗，120下烘干，然后放入含 5%戊二醛溶液中室溫下浸泡 2 h ，取出用去離子水沖洗 5 min 3次，烘干后，至枯燥處保存?；獗砜贵w探針的固定：探針為 FITC 標記的驢抗兔 IgG 和兔抗人 AFP 抗體，將探針固定至修飾后的載體外表， 研究載體對不同蛋白探針的固定效率。 取原始濃度為 1mg/ml 的探針溶于含

6、 20%甘油的 PBS 溶液中稀釋， 使探針終濃度分別為0. 1 、0. 2 、0. 3 、0. 4 、0. 5 、0. 6 mg /ml ，將探針分子分別到修飾后基片上，避光，置于濕盒中， 37固定 3 h ，然后 PBS清洗 3 次，洗掉未結(jié)合的熒光探針，晾干后熒光顯微鏡檢測，獲取熒光圖像。經(jīng)濟指標： 載體對抗體的固定效率多糖納米膜基底型芯片載體成品的銷售3、技術(shù)創(chuàng)新點本研究經(jīng)過前期資料查詢， 數(shù)據(jù)庫內(nèi)相關(guān)資料充足， 課題研究設(shè)計經(jīng)過推敲方案在課題組通過，已經(jīng)組織選拔了課題組相關(guān)工作人員。課題組成員，高級、中級職稱配備合理，有學(xué)科帶頭人，局部工作者有相關(guān)經(jīng)歷。瓊脂糖、 3- 氨基丙基三甲氧

7、基硅烷 ( APTES)( Sigma 公司，美國 ) ，高碘酸鈉、戊二醛、 36%冰乙酸、無水乙醇等均為分析純 ( 國藥集團化學(xué)試劑 ) ; FITC 標記的驢抗兔抗體 ( XX生工 ) ， FITC 標記的兔抗人 AFP抗體 ( XX生工 ) 。特色和創(chuàng)新：在免疫芯片的制備和應(yīng)用過程中，大膽采用瓊脂糖建立一種新的免疫芯片載體制備方法， 既可以改善實驗方法， 又可以提高臨床提高診斷效率。4、獲得成果和知識產(chǎn)權(quán)此處需要作者自己填寫WORD格式1 。XX省重點研發(fā)方案工程申報書以下為工程可行性研究報告一目的意義限1000 字免疫芯片，又稱為抗體微陣列， 是實際應(yīng)用中最重要、 研究最多的一種蛋白質(zhì)

8、芯片。免疫芯片技術(shù)結(jié)合了抗原抗體反響的特異性和芯片高密度集成優(yōu)勢， 只需少量生物樣品，一次檢測便可獲得幾種甚至幾萬種有關(guān)的生物信息或疾病的檢測結(jié)果。與傳統(tǒng)的免疫分析方法相比， 免疫芯片最大的優(yōu)點是能夠?qū)崿F(xiàn)并行、 快速、高通量的檢測 ; 同時極大節(jié)省時間、試劑，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，其在疾病診斷、藥物篩選、食品平安和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。免疫芯片制備中，載體的外表修飾及抗體固定是影響芯片檢測靈敏度的關(guān)鍵因素。目前，免疫芯片載體外表修飾可大致分為兩類 : 二維外表修飾和三維外表修飾。二維外表修飾包括聚賴氨酸修飾、氨基修飾、醛基修飾、巰基修飾、鏈霉親合素修飾等，它們是通過共價鍵

9、或特殊分子間的高親合力把蛋白質(zhì)固定在載體外表，所以對蛋白質(zhì)的固定比擬結(jié)實， 蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化較少， 有利于保持蛋白質(zhì)的天然活性。但是二維外表修飾技術(shù)制備的載體在開展過程中仍存在不少問題，: 引起抗體蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定的問題， 動力學(xué)檢測X圍窄等問題。 三維外表修飾是在玻片外表包被一層凝膠或樹突狀多聚物， 這些凝膠或多聚物又可以通過化學(xué)反響引入活性基團， 以共價結(jié)合和物理吸附的方式把蛋白固定在載體外表。 瓊脂糖一種擁有多種生物活性的高聚物， 生物相容性良好， 有研究推斷瓊脂糖自組裝膜基底可能會提升免疫芯片對抗體的固定效率， 建立多糖納米膜基底型芯片載體制備的新方法，為后續(xù)免疫芯片的制備提供實驗參考

10、和理論支持二國內(nèi)外同類產(chǎn)品和技術(shù)情況限 500 字已有大量研究證明 2 ，三維構(gòu)造的載體對蛋白質(zhì)的固定量比二維平面載體大得多，而且凝膠的固 - 液環(huán)境使固定在上面的蛋白質(zhì)不易失去活性。所以三維修飾外表是近年來較受關(guān)注的修飾方法。研究說明3 ，多糖膜具有三維多孔構(gòu)造，經(jīng)水化后可在內(nèi)部形成固 - 液狀態(tài)的水凝膠構(gòu)造，這種三維、多孔構(gòu)造以及濕潤的微環(huán)境不但能固定足夠的蛋白質(zhì)，同時還可以防止蛋白質(zhì)變性失活。瓊脂糖是一種擁有多種生物活性的高聚物， 有著很好的生物相容性， 其在載玻片外表形成的自組裝構(gòu)造具有類似于聚丙烯酰胺的水凝膠特征， 這三維自組裝構(gòu)造又可以通過化學(xué)反響引入醛基基團，即可與抗體分子的氨基

11、發(fā)生共價偶聯(lián)。具有這種三維構(gòu)造的載體對蛋白質(zhì)的固定量比二維平面載體大得多，而且凝膠的- 液濕潤環(huán)境使固定在上面的蛋白質(zhì)不易失去活性，因此更有利于固定抗體探針分子。有研究說明4 : 殼聚糖氧化自組裝膜修飾玻片與抗體結(jié)合效率高，熒光信號強，點的密度及數(shù)量等都要優(yōu)于普通醛基化玻片。 瓊脂糖是一種多糖， 加熱后易溶于水，不同濃度的瓊脂糖在玻片上形成的膜的厚度和孔徑大小也有差異，膜的厚度和孔徑的大小會直接影響蛋白質(zhì)的固定。參考文獻1Serg， Mattsson C ，Andersson E ， et al Exploration of high-den-sityproteinmicroarraysfor

12、antibodyvalidationandautoimmunityprofiling J New Biotechnol ，2021，33(5): 582-592.2ThkSM，Bonabi A， Nordberg ME，et al Thiol-enemicrofluidicdevicesfor microchip electrophoresis: Effects of curing conditions and monomercompositionon surface propertiesJJ Chromatog-raphy A，2021 ，1426:WORD格式XX省重點研發(fā)方案工程申報書2

13、33-240.3Klimushina MV，Gumanova NG， Metelskaya VA. Direct labeling ofserum proteins by fluorescent dye for antibody microarrayJ Bio-chem Biophy es Commun，2021， 486(3): 824-826.4Chang SY ，Bong JH， Yoo G，et alActivity control of autodisplayedproteins on the same outer membrane layer of E. coli by using

14、 Z-domainstreptavidinand lipasefoldasesystemsJEnzymeMi-crobialTechnology ，2021，96:85-95.三市場預(yù)測和開展趨勢限500 字未來，在免疫芯片的制備和應(yīng)用過程中， 載體的選擇以及載體外表修飾是制備質(zhì)量好、結(jié)合力高的芯片將是重要環(huán)節(jié)， 最后建立了一種新的免疫芯片載體制備方法，為后續(xù)免疫芯片的制備和應(yīng)用不斷提供實驗參考和理論支持。二、研究開發(fā)內(nèi)容、方法、技術(shù)路線一具體研究開發(fā)內(nèi)容和要重點解決的技術(shù)關(guān)鍵問題限1000 字本文選擇多糖中水溶性的瓊脂糖為基質(zhì)， 利用分子自組裝技術(shù)， 以玻片為載體，讓瓊脂糖、高碘酸鈉對玻片外

15、表進展修飾，制備瓊脂糖自組裝膜載體。利用SEM、 AFM和 FTIR 對載體進展表征，獲得最正確制備條件；利用熒光顯微成像及 ImageJ 軟件，研究該載體對 2 種不同種屬來源抗體的固定效率，對瓊脂糖自組裝膜載體和普通醛基修飾載體對抗體的固定效果進展比照分析。材料：瓊脂糖、3- 氨基丙基三甲氧基硅烷 ( APTES) ( Sigma 公司，美國 ) ，高碘酸鈉、戊二醛、36%冰乙酸、無水乙醇等均為分析純( 國藥集團化學(xué)試劑有限公司 );FITC 標記的驢抗兔抗體 ( XX生工 ) ，F(xiàn)ITC 標記的兔抗人 AFP抗體 ( 上海生工 )。JSM- 6360LV 型上下真器械：超純水機、電子天平

16、、磁力攪拌器、烘干箱，空掃描電鏡， FTS3000FX型的傅立葉變換紅外光譜儀，OLYMPUS BX51型倒置熒光顯微鏡， Nanoscope IIIa 型原子力顯微鏡?；念A(yù)處理：25 mm75 mm光學(xué)載玻片用氨水洗液 ( 體積比為氨水過氧化氫水 = 115)置搖床上振搖2 h，取出后用超純水清洗干凈，放入 1mol/L HCl 中浸泡過夜，再用超純水超聲10 min，無水乙醇超聲清洗 2 次，每次 5 min，置電熱恒溫箱 (120 ) 烘烤 2 h 。瓊脂糖自組裝膜載體制備分別配制 0. 6% 、 0. 8%、1. 0% 、1. 2% 、1. 4% 的瓊脂糖溶液，微波爐煮沸 3 mi

17、n 完全溶解 ; 將 2 ml 瓊脂糖溶液覆蓋在WORD格式XX省重點研發(fā)方案工程申報書60預(yù)熱的清潔玻片上 ;瓊脂糖室溫凝固后，置37烤箱烘干2 h;置室溫保存?zhèn)溆?;將上述制備好的瓊脂糖玻片置于50 mmol /L NaIO4溶液中室溫下活化 60 min 。接著用 0. 1 mol /L pH7. 4 PBS洗滌 5 min 3次，氮氣流吹干。普通醛基載體制備： 按照文獻中的方法制備普通醛基載體。清洗好的玻片浸APTES活化試劑 ( 丙酮稀釋 ) 中 20 min 后取出，玻片用丙酮、去離子水沖洗，120下烘干，然后放入含 5%戊二醛溶液中室溫下浸泡 2 h ，取出用去離子水沖洗 5 m

18、in 3次，烘干后，至枯燥處保存?；獗砜贵w探針的固定： 探針為 FITC 標記的驢抗兔 IgG 和兔抗人 AFP 抗體，將探針固定至修飾后的載體外表， 研究載體對不同蛋白探針的固定效率。 取原始濃度為 1mg/ml 的探針溶于含 20%甘油的 PBS 溶液中稀釋， 使探針終濃度分別為 0. 1 、0. 2 、0. 3 、0. 4 、0. 5 、 0. 6 mg /ml ，將探針分子分別到修飾后基片上，避光，置于濕盒中， 37固定 3 h ，然后 PBS清洗 3 次，洗掉未結(jié)合的熒光探針，晾干后熒光顯微鏡檢測，獲取熒光圖像。不同基片對抗體分子固定效率的比擬： 利用最正確條件分別制備普通醛基化

19、載體，瓊脂糖自組裝膜載體， 分別固定最正確濃度的抗體探針分子， 根據(jù)平均熒光強度比擬兩種載體對抗體的固定效果。 載體外表的形貌用 JSM-6360LV型上下真空掃描電鏡 ( SEM) 與原子力顯微鏡 ( AFM) 觀察 ; 在 IRPrestige-21 型傅里葉變換紅外光譜儀上測定紅外光譜 ( FTI ) ，用來分析載體外表存在的化學(xué)鍵 ; 用 OLYMPUS BX51型倒置熒光顯微鏡觀察載體外表熒光探針的固定效率。重點解決的技術(shù)關(guān)鍵：瓊脂糖自組裝膜載體的制備。二工程的特色和創(chuàng)新之處限1000 字在免疫芯片的制備和應(yīng)用過程中， 載體的選擇以及載體外表修飾是制備質(zhì)量好、結(jié)合力高的芯片將是重要環(huán)節(jié)， 采用瓊脂糖建立一種新的免疫芯片載體制備方法。三要到達的技術(shù)、經(jīng)濟指標及社會、經(jīng)濟效益限1000 字測定載體對抗體的固定效率多糖納米膜基底型芯片載體成品銷售獲得的經(jīng)濟效益WORD格式四采用的方法、技術(shù)路線以及工藝流程、合作方式WORD格式XX省重點研發(fā)方案工程申報書三、工程總體目標及考核指標、實施年限、年度方案安排與階段目標時間進度作者可以自行調(diào)整，半年為一個進度，一般是研究周期是2 年一總體目標及考核指標1、申報工程與所屬指南方向的關(guān)聯(lián)關(guān)系包括工程與所屬指南方向的匹配性，對指南方向目標的支撐作用。限 1000 字起止時間半年為時主要工作內(nèi)容及階