傷寒菌苗制造及檢定規(guī)程

1、傷寒菌苗制造及檢定規(guī)程本品系用傷寒菌培育后取菌苔制成懸液，加甲醛殺菌，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成每ml含菌3億制成。用于預(yù)防傷寒。1菌種1.1菌種來源制造傷寒菌苗用的菌種及檢定菌種用的診斷血清，應(yīng)由中國藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。1.2菌種檢定定菌種可用pH7.27.4的肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。1.2.1培養(yǎng)特性制造菌苗的菌株應(yīng)具有典型的形態(tài)、培養(yǎng)和生化特性。1.2.2血清凝集試驗(yàn)用37培育1820小時的培養(yǎng)物以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成含菌6億/ml，與傷寒菌診斷血清作定量凝集試驗(yàn)，充分混合后放37過夜，以肉眼見到凝集（+）之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)之效價。凝集價不應(yīng)低于血清

2、原效價之半。并用傷寒Vi及O血清做凝集試驗(yàn)，應(yīng)與Vi血清有凝集，與O血清不凝集，或僅有較低凝集。1.2.3毒力試驗(yàn)用37培育1216小時的瓊脂培養(yǎng)物以生理鹽水稀釋成6億/ml、3億/ml、1.5億/ml及0.75億/ml等濃度的菌液（根據(jù)菌種毒力情況稀釋度可作更改也可增加稀釋度）。每1稀釋度的菌懸液腹腔注射體重1416g之小白鼠，最少5只，每只0.5ml，觀察3天。使小白鼠于感染后3天內(nèi)全部死亡的最小劑量為1個致死量（LD），1LD應(yīng)不超過1.5億菌。1.2.4毒性試驗(yàn)用37培育1820小時之瓊脂培養(yǎng)物混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，56加溫1小時（或其他方法殺菌）。不加防腐劑。殺菌試驗(yàn)合格后稀釋

3、為每ml含菌60、30及15億共3個濃度，每個濃度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重1518g小白鼠5只，觀察3天，注射7.5億菌之小白鼠應(yīng)全部生存，注射15億菌之5只小白鼠可有3只死亡。1.2.5免疫力試驗(yàn)按傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗制造及檢定規(guī)程1.2.5項(xiàng)進(jìn)行。1.2.6抗原性試驗(yàn)選體重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力試驗(yàn)所用之菌液靜脈注射3次，每次0.5ml，第1次注射7億菌，第2次14億菌，第3次21億菌，每次間隔7天。末次注射后1014天采血做定量凝集試驗(yàn)測定效價，2/3家兔血清之凝集效價不低于112800為合格。1.3菌種保存菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于28菌種凍干后應(yīng)抽取

4、樣品按1.2項(xiàng)進(jìn)行檢查，合格后可使用3年，以后每次生產(chǎn)前必須檢查全部特性一次，合格者可繼續(xù)使用2年。2菌苗制造制造傷寒菌苗應(yīng)選用2個菌株。2.1菌種凍干菌種啟開后應(yīng)檢查菌形、純度及玻片凝集試驗(yàn)（包括用Vi血清做玻凝集反應(yīng)），合格后即可使用，每啟開1支凍干菌種用于生產(chǎn)不應(yīng)超過6代。2.2制造用培養(yǎng)基用pH7.27.4的馬丁瓊脂或肉湯瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。2.3原液制造2.3.1接種可采用涂種，接種后置37培育1824小時。2.3.2采集采集前應(yīng)逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。刮取菌苔混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水中。2.3.3純菌試驗(yàn)原液采集后應(yīng)逐瓶取樣接種瓊脂斜面1管，于37培育2天，24261天，如有雜

5、菌生長應(yīng)廢棄。2.3.4殺菌原液中加入不超過1.1%0.1%(ml/ml)的甲醛溶液殺菌。加殺菌劑后的原液應(yīng)放在37，不得超過7天，以后保存于28。2.3.5無菌試驗(yàn)純菌試驗(yàn)合格的原液，應(yīng)取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及普通瓊脂斜面各1管，放37培育5天，如有本菌生長，可加培量復(fù)試一次；如有雜菌生長應(yīng)廢棄。2.3.6原液合并無菌試驗(yàn)合格的原液按不同菌株或不同制造日期分別過濾合并。合并后應(yīng)加不超過0.5%（g/ml）苯酚或其他適宜防腐劑，保存于28。2.4原液檢定2.4.1鏡檢菌形應(yīng)正常，無雜菌。2.4.2凝集試驗(yàn)原液與相應(yīng)血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，其凝集效價不應(yīng)低于血清原效價之半。2.4.3無菌試

6、驗(yàn)按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。2.4.4濃度制定應(yīng)按中國細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量檢定部門會同測定濃度。2.4.5免疫力試驗(yàn)原液于無菌試驗(yàn)合格后與質(zhì)量檢定部門會同進(jìn)行，抽檢批數(shù)不應(yīng)少于生產(chǎn)批數(shù)的1/5。方法同1.2.5項(xiàng)，唯所用小白鼠每組至少15只，保護(hù)60%免疫小白鼠活存為合格。2.5原液保存原液應(yīng)保存于28。原液自采集之日起至用于菌苗稀釋時不得少于4個月，保存效期自采集之日起為2年半。2.6菌苗稀釋2.6.1原液配合稀釋前應(yīng)先將不同菌株所制之原液按菌數(shù)等量混合，但每個菌株所加的菌數(shù)與應(yīng)加菌數(shù)在總菌數(shù)不變的原則下允許兩個菌株之間在40%范圍內(nèi)互有增減。2.6.2菌苗稀釋稀釋菌苗用含0.25%0.5%

7、（g/ml）苯酚或其他適宜的防腐劑之磷酸鹽緩沖生理鹽水。2.6.3菌苗濃度每ml含傷寒菌3億2.7菌苗分批同組配合的原液用同一批稀釋液在同一日稀釋的各瓶菌苗為1批。大罐稀釋的應(yīng)按大罐分批，并按分裝機(jī)分為亞批。2.8檢定稀釋后每批應(yīng)逐瓶抽樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)及測定防腐劑含量（大罐稀時除外）。2.9分裝分裝后每亞批應(yīng)抽樣送質(zhì)量檢定部門進(jìn)行成品檢定。3成品檢定3.1物理化學(xué)檢查菌苗應(yīng)為乳白色懸液，pH值為6.87.4，不應(yīng)有搖不散的菌塊及異物。苯酚含量應(yīng)為0.25%0.5%（g/ml）。3.2菌形及純度染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個視野，平均每個視野內(nèi)不得有10個以上非典型菌（線狀、粗大或染色可穎桿菌），并不應(yīng)有雜菌。3.3無菌試驗(yàn)按生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。3.4安全試驗(yàn)3.4.1毒性試驗(yàn)用體重1820g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用體重350450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗1.5ml，觀察7日，應(yīng)無死亡。3.4.2防腐劑試驗(yàn)用體重1820g之健康小白鼠2只，每只皮下注射菌苗0.5