3、醫(yī)療器械的無菌和初始污染菌檢驗ppt課件

1、醫(yī)療器械無菌和初始污染菌檢驗技術(shù)國家食品藥品監(jiān)視管理局北京醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)視檢驗中心醫(yī)療器械無菌檢驗技術(shù)什么是無菌檢查法？ 用于檢查要求無菌的醫(yī)療器械能否無菌的一種方法。假設供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅闡明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。 無菌實驗的目的：將醫(yī)療器械或其浸提液接種于培育基內(nèi)，以檢驗供試品能否有細菌和真菌污染。醫(yī)療器械無菌檢驗規(guī)范GB/T 14233.2 -2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學實驗方法2021年版無菌檢查法醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南2021版 無菌檢驗是無菌醫(yī)療器械產(chǎn)品消費控制過程中的一項重要內(nèi)容。其檢驗方法、檢驗結(jié)果斷定及檢驗人

2、員業(yè)務才干等要素直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量和平安。作為無菌醫(yī)療器械消費企業(yè)，其無菌檢驗任務應由本企業(yè)獨立完成。并要求企業(yè)的檢驗人員能當場操作或口述無菌檢驗的過程。 滅菌: 殺滅或除去特定環(huán)境或物品中一切微生物的過程。目前國際上規(guī)定，滅菌過程必需使滅菌物品污染的微生物存活率減少到10-6及以下。 微生物: 必需用光學顯微鏡或電子顯微鏡才干察看到的微小生物。微生物具有一定的形狀與構(gòu)造,并能在適宜的環(huán)境中迅速地生長和繁衍,如細菌、病毒、真菌等。 無菌：是指某一物體或某一環(huán)境中不含有活的微生物。 無菌技術(shù):是指在微生物實驗任務中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施，其中包括無菌環(huán)境設

3、備、無菌實驗器材以及無菌操作。 無菌操作:是指在無菌環(huán)境條件下，在對無菌制品或無菌器械進展檢驗的過程中，能防止微生物污染與干擾的一種常規(guī)操作方法。 培育條件：用于促進微生物發(fā)育、生長和繁衍的生長培育基和培育方式的組合。 抑細菌/抑霉菌實驗：用選定的微生物來演示某些物質(zhì)的存在可以抑制這些微生物的繁衍。 培育基: 是人工配制的生物營養(yǎng)物質(zhì)，即用人工的方法將多種物質(zhì)按各種微生物生長繁衍的需求配成的一種混合營養(yǎng)物。 促生長實驗：用于證明生長培育基可以支持微生物 生長的技術(shù)操作。 假陰性：實踐陽性的無菌實驗結(jié)果被變成了陰性。 假陽性：實踐陰性的無菌實驗結(jié)果被變成了陽性。 需氧菌：在代謝中，有氧條件下才干

4、生存的微生物。 厭氧菌：在代謝中，沒有氧的條件下才干生存的微生物。 無菌保證程度SAL:滅菌后產(chǎn)品上存在單個活微生物的概率。 細菌：為單細胞微生物,其細胞分化不完善，無完好細胞核及核膜、核仁，直徑普通為1m 10m。 真菌：為多細胞或單細胞微生物，其細胞分化完善，有細胞核和各種細胞器，故易在體外生長繁衍，直徑普通為10m 100m。醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備 超凈任務臺醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備恒溫培育箱至少2臺醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備壓力蒸汽滅菌器醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備電熱枯燥箱醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備集菌儀醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備生物平安柜:從實驗平安性思索，建議陽性對照實驗運用生物平安柜醫(yī)

5、療器械無菌檢驗所需設備電子天平醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備光學顯微鏡醫(yī)療器械無菌檢驗所需設備過濾安裝無油真空泵、濾杯、濾頭、濾瓶、微孔濾膜、夾子 無菌檢查應在環(huán)境干凈度10 000級下的部分干凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進展，其全過程必需嚴厲遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)、任務臺面及環(huán)境應定期按的現(xiàn)行國家規(guī)范進展干凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關的要求進展驗證，其內(nèi)部環(huán)境的干凈度須符合無菌檢查的要求。 無菌檢查人員必需具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓。還應該具有高度的責任心和嚴謹細致的任務作風。環(huán)境及人員要求 無菌檢查法 環(huán)境要

6、求隔離系統(tǒng)無菌檢查法 環(huán)境要求 無菌室在消毒處置終了后，應檢查空氣中的菌落數(shù)。 無菌檢查法 環(huán)境要求TSA瓊脂平皿在30 35培育48h證明無菌取3只放無菌操作臺或超凈任務臺平均位置翻開上蓋，暴露30min后蓋好3只培育皿上生長的菌落數(shù)平均應不超越1個無菌實驗過程中也應檢查空氣中的菌落數(shù)，方法要求同上無菌檢查法 實驗前預備 器具滅菌：與供試液接觸的一切器具應采用可靠方法滅菌，置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)12130min，或置電熱枯燥箱內(nèi)1602h。 培育基：可按藥典中的處方制備培育基，亦可運用按該處方消費的符合規(guī)定的脫水培育基。應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培育基應保管在2 25，普通在3周內(nèi)運

7、用。無菌檢查法 實驗前預備 配制培育基所需器具: 無菌檢查法 實驗前預備常用器具與稀釋液: 無菌檢查法 實驗前預備培育基: 無菌檢查法 實驗前預備 硫乙醇酸鹽流體培育基: 在供試品接種前, 培育基氧化層的高度不得超越培育基深度的1/5，否那么,須經(jīng)100水浴加熱至粉紅色消逝不超越20分鐘迅速冷卻,只限加熱一次，并應防止被污染。其裝量與容器高度的比例應符合培育終了后培育基氧化層粉紅色不超越培育基深度的 1/2。30 35培育14天。 需氧菌生長厭氧菌生長無菌檢查法 實驗前預備100水浴加熱無菌檢查法 實驗前預備培育基: 無菌檢查法 實驗前預備 改良馬丁培育基： 23 28培育14天無菌檢查法 實

8、驗前預備培育基: 無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培育基及改良馬丁培育基等應符合培育基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。無菌性檢查每批培育基隨機不少于5支瓶，培育14天，應無菌生長。培育基的適用性檢查靈敏度檢查：菌種培育基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超越5代從菌種保管中心獲得的冷凍枯燥菌種為第0代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證實驗菌株的生物學特性。 金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)CMCCB 26003銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)CMCCB 10 104枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)CMCCB 63 501生孢梭

9、菌(Clostridiumsporogenes)CMCC(B)64 941白色念珠菌 (Candidaalbicans)CMCC(F)98 001 黑曲霉(Aspergillus niger )CMCC(F)98 003培育基的適用性檢查菌液制備： 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新穎培育物至營養(yǎng)肉湯培育基中或營養(yǎng)瓊脂培育基上，接種生孢梭菌的新穎培育物至硫乙醇酸鹽流體培育基中，3035培育18小時24小時；接種白色念珠菌的新穎培育物至改良馬丁培育基中或改良馬丁瓊脂培育基上，2328培育2448小時，上述培育物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL 含菌數(shù)小于100cfu菌落構(gòu)成單

10、位的菌懸液。培育基的適用性檢查 菌液制備：接種黑曲霉的新穎培育物至改良馬丁瓊脂斜面培育基上，2328培育57天，參與35mL含0.05v/v聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05v/v聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL 含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。 菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)運用，假設保管在28可在24小時內(nèi)運用。黑曲霉孢子懸液可保管在28，在驗證過的儲存期內(nèi)運用 。培育基的適用性檢查 平板劃線法-斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培育基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動培育皿70

11、角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后經(jīng)過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法經(jīng)過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。培育基的適用性檢查 平板劃線法-曲線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培育基上作延續(xù)劃線。培育基的適用性檢查血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌大的金黃色菌落在劃線過程中，細胞逐漸分散，培育后可構(gòu)成單個菌落。 定期移植法:亦稱傳代培育保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培育基上，最適條件下培育，完成培育于(46)進展保管并間隔一定時間進展移植培育的一種短期菌種保藏方法。 操作步驟： 斜面制備 接種 培育 保藏培育基的適用性檢查 接 種培育基應符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。

12、檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進展。靈敏度檢查所用菌種藥典2021版規(guī)定金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新穎培育物至相應培育基中培育，將培育物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液濃度小于100cfu/mL硫乙醇酸鹽流體培育基12mL9支：分別接種小于100cfu的金葡、銅綠、枯草、生孢各2支，另一支不接種做空白對照，培育3天改良馬丁培育基9mL 5支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，另1支不接種做空白對照，培育5天逐日察看結(jié)果：空白對看管應無菌生長，假設加菌的培育基管均生長良好，那么靈敏度符合規(guī)定。培育基的適用性檢查

13、對起始樣品進展延續(xù)10倍稀釋，將高稀釋倍數(shù)的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培育基倒入無菌平皿后混合均勻，培育后獲得單菌落。培育基外表菌落為圓形，而培育基內(nèi)部菌落呈豆狀或透鏡狀。培育基的適用性檢查無菌檢驗有兩種方法：直接接種法、薄膜過濾法直接接種法:將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培育基內(nèi)培育。薄膜過濾法:含抗菌、抑菌成分的供試品會抑制某些微生物的生長繁衍,所以用常規(guī)方法檢查會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果, 但并不等于產(chǎn)品中沒有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜過濾法來去除供試品中可溶的抑菌性成分,把細菌等微生物截留在濾膜上,然后再經(jīng)過處置培育使所含微生物生長繁衍, 從而使微生物檢出。方法驗證實驗

14、 當建立產(chǎn)品的無菌檢查法時，應進展方法的驗證，以證明所采用的方法適宜于該產(chǎn)品的無菌檢查。假設產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改動時，檢查方法應重新驗證。驗證時，按“供試品的無菌檢查的規(guī)定及以下要求進展操作。對每一實驗菌應逐一進展驗證。方法驗證實驗 菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌Escherichia coliCMCC(B) 4 4102外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培育基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。 方法驗證實驗與靈敏度檢驗一切菌種區(qū)別：大腸埃希菌替代銅綠假單胞菌。方法驗證實驗 取每種培育基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次

15、的沖洗液中參與小于100cfu的實驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培育基或改良馬丁培育基中，或?qū)⑴嘤又翞V筒內(nèi)。另取一裝有同體積培育基的容器，參與等量實驗菌，作為對照。按規(guī)定溫度培育3天 5天。各實驗菌同法操作。方法驗證實驗：薄膜過濾法方法驗證所用菌種藥典2021版規(guī)定金黃色葡萄球菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉分別接種各菌種新穎培育物至相應培育基中培育，將培育物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成菌懸液濃度小于100cfu/mL硫乙醇酸鹽流體培育基8支：分別接種小于100cfu的金葡、大腸、枯草、生孢各2支，其中1管接入每支培育基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培育3天

16、。改良馬丁培育基4支：分別接種小于100cfu的白念、黑曲霉各2支，其中1管接入每支培育基規(guī)定的供試品接種量，另1管作為對照，培育5天。方法驗證實驗：直接接種法 與對看管比較，如含供試品各容器中的實驗菌均生長良好，那么闡明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢查條件進展供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，那么闡明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用添加沖洗量，或添加培育基的用量，或運用中和劑或改換濾膜種類等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進展方法驗證。 方法驗證實驗也可與供試品的無菌檢查同時進展。 方法驗

17、證實驗：結(jié)果判別 供試品數(shù)量的選擇： 檢驗數(shù)量是指一次實驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。普通情況下，供試品無菌檢查假設采用薄膜過濾法，應添加1/2的最小檢驗數(shù)量作陽性對照用；假設采用直接接種法，應添加供試品1 支或瓶作陽性對照用。供試品的無菌檢查 檢驗量是指一次實驗所用的供試品總量g或ml。假設每支瓶供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培育基，那么應分別接種硫乙醇酸鹽流體培育基和改良馬丁培育基。采用薄膜過濾法時，檢驗量應不少于直接接種法的總接種量，只需供試品特性允許，應將一切容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。供試品的無菌檢查 供試品包裝須完好無損，尤其是只需一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品假設有兩層或兩層

18、以上包裝的，需將外包裝在傳送窗或緩沖間撤除后，傳入實驗室。 操作人員預備：帶口罩、帽子、穿公用無菌服、鞋進入無菌室。供試品的無菌檢查 供試品的無菌檢查 在100級超凈臺內(nèi)，酒精燈火焰周圍，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培育基不少于15ml/管和改良馬丁培育基不少于10ml/管的容器中。 正確的無菌操作，既不能引入外來菌污染培育物呵斥假陽性，也要留意接觸供試品的實驗器具溫度不可過高以免將能夠存在的菌燙死。陰性對照目的是驗證實驗能否存在污染 ：供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。陽性對照目的是驗證實驗可靠性，防止假陰性：應根據(jù)

19、供試品特性選擇陽性對照菌；無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。陽性對照實驗的菌液制備同方法驗證實驗，加菌量小于100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培育基接種的樣品量。陽性對看管培育(48 72)小時應生長良好。供試品的無菌檢查無菌檢查法-直接接種法供試品數(shù)量：同一批號3個 11個單位供試品 優(yōu)先采用將供試品或其有代表性的各部分直接投放入培育基內(nèi)培育。如：棉簽、導尿包中的導尿管、注射器中的液體等無菌檢查法 直接接種法不適宜直接投放的可制備供試液：浸提介質(zhì)：9g/L無菌氯化鈉溶液生理鹽水、0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、根據(jù)供試品的特性，可選用其他驗證過的適

20、宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。管類器具： 按管內(nèi)外表積每10cm2流過管內(nèi)腔1mL浸提介質(zhì)，流量約為10mL/min。容器類器具： 已有液體的直接取液；空容器每10cm2參與浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。實體類器具：外表積每10cm2參與浸提介質(zhì)1mL，振搖數(shù)次。 供試液制備應按無菌操作法進展，在制備后2h內(nèi)運用。無菌檢查法 直接接種法 直接接種法：每個供試品按規(guī)定量分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培育基和改良馬丁培育基的容器中。除另有規(guī)定外，每個容器中培育基的用量應符合接種的供試品體積不得大于培育基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培育基每管裝量不少于15mL，改良馬丁培育基每管裝量不少于10mL。

21、無菌檢查法-薄膜過濾法 2021年版規(guī)定:只需供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法一樣。 在蠕動泵的作用下，被測產(chǎn)品經(jīng)過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染。 無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應不大于0.45m，直徑約為50mm。水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立刻過濾。供試液經(jīng)薄膜過濾后，假設需求用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超越1000mL，以免濾膜上微生物受損傷。無菌檢查法-薄膜過濾法沖洗后分別將

22、100mL硫乙醇酸鹽流體培育基及改良馬丁培育基參與相應的濾筒內(nèi)，培育。無菌檢查法 培育及察看 上述含培育基的容器按規(guī)定的溫度培育14天。培育期間應逐日察看并記錄能否有菌生長。如在參與供試品后或在培育過程中，培育基出現(xiàn)渾濁，培育14天后，不能從外觀上判別有無微生物生長，可取該培育液適量轉(zhuǎn)種至同種新穎培育基中，細菌培育2天、真菌培育3天，察看接種的同種新穎培育基能否再出現(xiàn)渾濁；或取培育液涂片，染色，鏡檢，判別能否有菌。 假設供試品管均廓清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明實驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品

23、所含。 實驗假設經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，假設無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。 陽性對看管應生長良好，陰性對照不得有菌生長。否那么，實驗無效。無菌檢查法 結(jié)果判別 當符合以下至少一個條件時，方可判實驗結(jié)果無效：1無菌檢查實驗所用的設備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；2回想無菌實驗過程，發(fā)現(xiàn)有能夠引起微生物污染的要素。3供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌實驗中所運用的物品和或無菌操作技術(shù)不當引起的。無菌檢查法 結(jié)果判別 實驗假設經(jīng)確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，假設無菌生長，判供試品符合規(guī)定

24、；假設有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。 無菌檢查法 結(jié)果判別醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南2021版 由于無菌檢驗時間跨度較長，因此過程的記錄應可以完好表達實驗的全過程，對于在實驗過程中出現(xiàn)的各種情況，均應在記錄中客觀反映。直接接種法實驗結(jié)果 薄膜過濾法實驗結(jié)果 無菌檢查法 斷定實驗報告中宜給出以下信息： 供試品稱號；消費批號和或滅菌批號；供試液制備方法；接種方式；每日察看結(jié)果包括陰、陽性對照；結(jié)果斷定實驗報告1培育基配制記錄2滅菌器、天平等儀器的運用記錄3培育基無菌性檢查、靈敏度檢查記錄4菌種購買、傳代、運用記錄5方法學驗證記錄6無菌實驗記錄7滅菌物品制造8廢棄物處置記錄9干凈間監(jiān)測記錄醫(yī)療器械

25、無菌檢驗應有記錄 一、適用范圍 二、檢查內(nèi)容1.選擇的無菌檢驗方法 2.檢驗人員 資質(zhì)3.現(xiàn)場察看無菌實驗室環(huán)境4.設備和器具 5.管理制度、操作規(guī)程等相關技術(shù)文件 6. 查閱實驗記錄 三、其它應留意的問題 醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南2021版 1培育基制備 2供試品的無菌檢查 3培育及察看 4結(jié)果判別1樣品記錄 2滅菌物品制造記錄 3原始實驗記錄 4廢棄物處置記錄醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南2021版其它應留意的問題還包括： 消費企業(yè)應確保樣品具有代表性：實驗樣品應從常規(guī)產(chǎn)品中可以代表加工過程和條件的批中選擇。選擇樣品是隨機的。實驗樣品的選擇和處置技術(shù)應明確，以免對樣品上所含的微生物的數(shù)量

26、和種類呵斥污染和改動。實驗樣品可以選擇制造過程中的不合格產(chǎn)品，它們應該代表這個消費批的加工程序和條件。用于實驗的不合格產(chǎn)品應不會影響無菌測試的有效性。醫(yī)療器械無菌實驗檢查要點指南2021版其它應留意的問題還包括： 消費企業(yè)對于供試品的選取、轉(zhuǎn)移過程要采取防止污染措施，確保實驗結(jié)果的可靠性。選取制造供試品的實驗樣品時，樣品包裝須完好無損，尤其是只需一層包裝的樣品。進入無菌檢驗室的樣品假設有兩層或兩層以上包裝的，需將外包裝在傳送窗或緩沖間撤除后，傳入實驗室。 無菌實驗要點器具滅菌：一切器具高壓滅菌12130min，硫乙醇酸鹽流體培育基: 接種前, 培育基氧化層的高度不得超越培育基深度的1/5，30

27、 35培育14天。改良馬丁培育基： 23 28培育14天。兩種培育基要符合無菌性檢查及靈敏度檢查的要求；無菌實驗要點 供試品包裝完好。培育基、供試品消毒后帶入無菌室。采用驗證過檢查方法直接接種法或薄膜過濾法在干凈度10 000級下的部分100級區(qū)域內(nèi)，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品或供試液分別接種至兩種培育基中，同時做陰性對照和陽性對照；按規(guī)定的溫度培育14天。逐日察看并記錄。如在培育過程中，培育基出現(xiàn)渾濁，培育14天后，不能從外觀上判別有無微生物生長，可取該培育液適量轉(zhuǎn)種至同種新穎培育基中，細菌培育2天、真菌培育3天，察看接種的同種新穎培育基能否再出現(xiàn)渾濁；或取培育液涂片，染色，鏡檢，判別能否

28、有菌。無菌實驗要點 陽性對看管應生長良好，陰性對照不得有菌生長。供試品管均應廓清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；假設供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明實驗結(jié)果無效，即生長的微生物非供試品所含。 出具實驗結(jié)果后，一切培育物121高壓滅菌30分鐘處置。 做好相應實驗記錄。實例：薄膜過濾法調(diào)查沖洗量 實驗菌： (1)生孢梭菌64941 (2)銅綠假單胞菌10104 (3)枯草芽孢桿菌 63501 (4) 金黃色葡萄球菌26003總?cè)恿浚?5g / 每株實驗菌+:對看管; 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml; 3:沖洗液體積400ml.3

29、5,培育24小時.+:對看管; 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml.35,培育48小時.結(jié)論:1.紅霉素對生孢梭菌生長無抑制造用.2.紅霉素對銅綠假單孢菌生長無抑制造用. :對看管; 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml; 3:沖洗液體積400ml.35,培育72小時.1.紅霉素對枯草芽孢桿菌有抑制造用.每筒加樣量5g(相當于紅霉素25mg)。2. 沖洗液體積400ml,枯草芽孢桿菌48小時后可見微弱生長,72小時生長良好。3. 在該檢驗條件下,沖洗400ml,三天內(nèi)可檢出枯草芽孢桿菌.結(jié)論:+:對看管; 1:沒有沖洗; 2:沖洗液體積200ml;3:沖洗液體積400ml.35,培育

30、72小時.500:沖洗液體積500ml; 700:沖洗液體積700ml.35,培育72小時.結(jié)論:1.紅霉素對金黃色葡萄球菌有抑制造用。2.在該檢驗條件下,沖洗700ml,殘留的紅霉素不影響金黃色葡萄球菌的生長。醫(yī)療器械初始污染菌檢驗技術(shù)GB 15979-2002 一次性運用衛(wèi)生用品衛(wèi)生規(guī)范初始污染菌的檢驗 初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細菌總數(shù)，可判明檢品受細菌污染的程度以及消費單位所用的原料、工具設備、工藝流程、消費人員的衛(wèi)生情況，是對檢品進展衛(wèi)生學評價的綜合根據(jù)。 GB 15979-2002 一次性運用衛(wèi)生用品衛(wèi)生規(guī)范 初始污染菌：產(chǎn)品消毒、滅菌前的細菌總數(shù)，可判明檢品受細菌污染的程度以

31、及消費單位所用的原料、工具設備、工藝流程、消費人員的衛(wèi)生情況，是對檢品進展衛(wèi)生學評價的綜合根據(jù)。 微生物限制檢查法：檢查非規(guī)定滅菌產(chǎn)品受微生物污染程度的方法。 消毒與滅菌的區(qū)別:消毒是殺滅去除傳播媒介上病原微生物。但不能殺死芽孢等全部微生物。所以消毒是不徹底的，不能替代滅菌。初始污染菌的檢驗 初始污染菌的檢驗 部分一次性運用衛(wèi)消費品微生物學目的要求產(chǎn)品種類微生物指標初始污染菌cfu/g細菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL大腸菌群致病性化膿菌真菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL口罩 普通級 消毒級10 00020020不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出100不得檢出尿布等 普通級 消毒級10 00

32、020020不得檢出不得檢出不得檢出不得檢出100不得檢出注：致病性化膿菌指綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。初始污染菌的檢驗預備：平皿洗凈、烘干；牛皮紙包好滅菌 營養(yǎng)瓊脂培育基配制、滅菌。步驟：采樣，供試液制備，培育，菌落計數(shù) 在100級凈化條件下用無菌方法翻開至少3個包裝； 從每個包裝中取樣，準確稱取10g1g樣品；剪碎后參與200mL無菌生理鹽水中，充分混勻。 液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。初始污染菌的檢驗取上清液共接種5個平皿，每個平皿中參與1mL供試液用冷卻至45左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培育基15 20mL，倒入每個平皿內(nèi)混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置35 2 培育48h后，計算平板

33、上的菌落數(shù)。稀釋度 5細菌菌落總數(shù)=5塊平板上的細菌菌落總數(shù)cfu/g或cfu/mL如：取10g樣品入200mL生理鹽水中，那么稀釋20倍當菌落數(shù)在100以內(nèi)，按實有數(shù)報告，大于100時采用二位有效數(shù)字。初始污染菌的檢驗計數(shù)方法：將平板置菌落計數(shù)器或從平板的反面直接以肉眼用標志筆點計，以投射光襯以暗色背景，仔細察看，計數(shù)。必要時可以借助于放大鏡、菌落計數(shù)器。菌落特征： 形狀特征：常為白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黃色。 邊緣整齊或不整齊，外表有光滑、粗糙，皺褶、突起或扁平。 大小差別很大。初始污染菌的檢驗 假設樣品菌落總數(shù)超越本規(guī)范的規(guī)定，應將留存的復檢樣品依前法復測2次， 2次結(jié)果平均值都到達本規(guī)范的規(guī)定，那么斷定被檢樣品合格；其中有任何一次結(jié)果平均值超越本規(guī)范的規(guī)定，那么斷定被檢樣品不合格。大腸菌群檢測方法樣液5mL接種至50mL乳糖膽鹽發(fā)酵管，