人乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞的影響

1、資助項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81072147）、教育部高校博士點(diǎn)基金（20105503110001）、教育部留學(xué)回國啟動基金（2011508）、重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀博士基金（070025000204）。* 共同第一作者； 通訊作者：柳滿然，電話：86E-mail：manran1122人乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞的影響彭瓊樂1,2* 楊得志3* 趙瀏陽1 王黎陽1 孫艷1 柳滿然1（1. 重慶醫(yī)科大學(xué) 臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016；2. 大慶油田總醫(yī)院集團(tuán) 臨床檢驗(yàn)診斷科，大慶 163000；3. 柳州市中醫(yī)院 病理科，

2、廣西 545001）【摘要】 目的 研究人乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer Associated Fibroblasts, CAFs）對MDA-MB-231細(xì)胞生長、增殖和侵襲的影響。方法 在共培養(yǎng)體系中將CAFs細(xì)胞與MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)，以細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察人乳腺癌CAFs細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測人乳腺癌CAFs細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響；采用條件培養(yǎng)基，通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察人乳腺癌CAFs細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果 與單獨(dú)培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞相比，與CAFs細(xì)胞共培養(yǎng)的MDA-M

3、B-231細(xì)胞的生長速度明顯增強(qiáng)（P0.05），細(xì)胞周期S期百分比（32.354.5）以及細(xì)胞增殖指數(shù)PI（42.912.44）明顯增高（P0.05）；在CAFs細(xì)胞的條件培養(yǎng)基下，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)（P0.01）。結(jié)論 人乳腺癌CAFs細(xì)胞能夠顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的生長、增殖和侵襲?！娟P(guān)鍵詞】乳腺癌微環(huán)境；CAFs；MDA-MB-231細(xì)胞【中圖分類號】 R 730.231 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A腫瘤的生長和侵襲不僅取決于惡性腫瘤細(xì)胞本身，而且與腫瘤微環(huán)境的某些細(xì)胞和胞外基質(zhì)（ECM）密切相關(guān)1。癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞（Cancer Associated Fibrob

4、lasts, CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最主要的宿主細(xì)胞，與腫瘤微環(huán)境的其他成員相比，CAFs所占的比例最大，在某些腫瘤組織中約占基質(zhì)成分的80%2。越來越多的研究表明，CAFs與腫瘤細(xì)胞的相互交流十分密切：一方面通過細(xì)胞-細(xì)胞間的直接接觸；另一方面通路產(chǎn)生一系列分泌成分，如細(xì)胞因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）或表達(dá)某些特殊的受體等，參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)重建、粘膜免疫、腫瘤微環(huán)境和腫瘤干細(xì)胞特有生長環(huán)境的維護(hù)等3,4,5，從而促進(jìn)腫瘤的生長和腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，降低腫瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感性6,7。然而，人乳腺腫瘤中CAFs對乳腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展

5、的影響，仍較復(fù)雜。為此，本研究采用共培養(yǎng)或條件培養(yǎng)基下的Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，研究了CAFs細(xì)胞對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長、增殖和侵襲的影響。1 材料與方法1.1 細(xì)胞人乳腺癌微環(huán)境CAFs細(xì)胞由本課題組培養(yǎng)，均從臨床的乳腺癌組織中原代分離培養(yǎng)8；MDA-MB-231細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2主要試劑胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、DMEM/H培養(yǎng)基和DMED/H無酚紅培養(yǎng)基購自GIBICO公司；DMSO購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自Millipore 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Coster公司；結(jié)晶紫粉末和草酸

6、銨購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3 CAFs與MDA-MB-231細(xì)胞的間接共培養(yǎng)將Transwell小室（0.4 m）放入6孔培養(yǎng)板，癌細(xì)胞和CAFs分別培養(yǎng)于小室和培養(yǎng)板小孔內(nèi)，通過分泌蛋白相互影響，構(gòu)成模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的培養(yǎng)系統(tǒng)，以研究細(xì)胞間的相互作用9。選擇對數(shù)生長期的CAFs和MDA-MB-231細(xì)胞，更換培養(yǎng)基為含0.5%FBS的DMED/H無酚紅培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并記錄；實(shí)驗(yàn)分組如下：MDA-MB-231細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組（對照組），MDA-MB-231和CAFs細(xì)胞共培養(yǎng)組（實(shí)驗(yàn)組）；在六孔板上各個實(shí)驗(yàn)孔接

7、種1x104個MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，3x103個CAFs細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，對照組小室內(nèi)加入相同體積不含細(xì)胞的培養(yǎng)基；0.5%FBS的DMED/H無酚紅培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。每組至少有3個重復(fù)。1.4 CAFs細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）的制備CAFs細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM/H培養(yǎng)基中至細(xì)胞匯合度約80%。用含0.5%FBS的DMEM/H無酚紅培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h，收集細(xì)胞上清液，1200 r/min，離心15min，取上清液（即為條件培養(yǎng)基）。 1.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 10在每個24孔板Transwell小室（8 m）中加入30 l按1:

8、7.5稀釋的ECM膠，使ECM膠均勻平鋪在小室的內(nèi)層，37 C放置15 min使其凝固，加入5000個細(xì)胞；在下室，即24孔培養(yǎng)板小孔中加入600 l含10%FBS的培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；棉簽輕輕擦掉Transwell小室ECM膠和細(xì)胞，0.1%的結(jié)晶紫溶液染色3-5 min，流水漂洗；正置相差顯微鏡下，膜上的細(xì)胞，分別選擇膜的左、右、中、上、下五個視野計(jì)數(shù)遷移到小室外層細(xì)胞，計(jì)算五個視野的平均細(xì)胞數(shù)，繪制柱狀圖。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差（ SD）表示，各組間比較采用方差分析t檢驗(yàn)，P0.05確定為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1

9、CAFs細(xì)胞促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的生長共培養(yǎng)體內(nèi)環(huán)境模擬體系條件下，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)觀察CAFs對MDA-MB-231細(xì)胞的生長影響。與單獨(dú)培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞相比，CAFs與MDA-MB-231細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的生長（P0.05），具有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖1）。在共培養(yǎng)條件下，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)觀察MDA-MB-231細(xì)胞的生長 (* P 0.05)圖1. 在共培養(yǎng)條件下CAFs細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞生長的影響2.2 CAFs細(xì)胞促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的增殖在乳癌細(xì)胞與CAFs模擬體內(nèi)環(huán)境的共培養(yǎng)體系中，本研究進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)

10、分析了MDA-MB-231細(xì)胞細(xì)胞周期分布的特征及增殖指數(shù)PI (%)。研究結(jié)果顯示：與MDA-MB-231細(xì)胞的S期（21.025.21）細(xì)胞百分比和細(xì)胞增殖指數(shù)PI（31.764.94）相比，CAFs細(xì)胞共培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞的S期細(xì)胞百分比（32.354.5）以及細(xì)胞增殖指數(shù)PI（42.912.44）明顯增高（P0.05），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖2和表1）。圖2. 流式細(xì)胞周期檢測CAFs細(xì)胞對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響表1 MDA-MB-231細(xì)胞在共培養(yǎng)條件下細(xì)胞周期各期的分布特征及PI (%, N=3)SampleG1 phaseS phaseG2 phase

11、PI MDA-MB-23168.244.9521.025.2110.740.8731.764.94MDA-MB-231/CAFs57.12.4432.354.510.552.1242.912.442.3 CAFs細(xì)胞促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲在未添加條件培養(yǎng)基的情況下，即Transwell小室的上下層小室均為不添加FBS的培養(yǎng)基，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力較弱，僅少數(shù)細(xì)胞穿到Transwell小室的外層（見圖3 A）；當(dāng)Transwell小室的上層小室或下層小室中加入CAFs條件培養(yǎng)基時，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)（見圖3 B和3D），穿到Transwell小室

12、膜外層的細(xì)胞較多（P0.01），尤其是在Transwell小室的上下層小室均添加CAFs細(xì)胞條件培養(yǎng)基時，MDA-MB-231的侵襲能力最強(qiáng)（見圖3 C和E）。A. 上下層小室均為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基；B. 上層小室為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，下層小室為CAFs的CM；C. 上下層小室均為CAFs的CM；D. 上層小室為CAFs的CM，下層小室為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基；E. 半定量細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果（* P0.01, 100）圖3. CAFs細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響3 討論目前認(rèn)為CAFs對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用11。有報道指出乳腺癌發(fā)生可能與腫瘤微環(huán)境間質(zhì)中CAFs細(xì)胞的活

13、化密切相關(guān)12,13。然而，CAFs細(xì)胞到底與癌細(xì)胞間進(jìn)行著怎樣的交流？這種交流對彼此有什么樣的影響？我們通過Transwell小室共培養(yǎng)觀察CAFs細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的相互作用。在共培養(yǎng)條件下，以細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)觀察到CAFs對MDA-MB-231細(xì)胞生長和增殖起促進(jìn)作用。與單獨(dú)培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞相比，與CAFs共培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞其細(xì)胞生長、增殖增強(qiáng)（P0.05），增殖指數(shù)PI明顯提高，這可能與CAFs細(xì)胞分泌的多種生長因子相關(guān)，如；IGF、KGF、EGF等14。收集CAFs細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（CM），通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察到CAFs細(xì)胞的CM

14、明顯增強(qiáng)MDA-MB-231的侵襲能力。在不含CM和FBS時，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力很弱（見圖3 A）；在Transwell小室的上層小室或下層小室加入CAFs細(xì)胞的CM時，MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)（見圖3 B和D），尤其是在Transwell小室的上下層小室均添加CAFs細(xì)胞的CM時，MDA-MB-231的侵襲能力最強(qiáng)（見圖3 C和E）。綜上所述，CAFs細(xì)胞能夠明顯促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的生長，增殖和侵襲能力，說明CAFs細(xì)胞通過與癌細(xì)胞間的“交叉對話”，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有十分重要的作用。 參考文獻(xiàn)： 1 Nyberg P, Salo T, Ka

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