醋酸纖維薄膜電泳實驗總結課件

1、血 清 蛋 白 的 醋 酸 纖 維 薄 膜 電 泳生 物 化 學 實 驗一、實驗目的學習醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術的一般原理二、實驗原理電泳是指帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定pH條件下，不同的質(zhì)點由于具有不同的等電點而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離影響電泳遷移率的外界因素：電場強度、溶液的pH值、溶液的離子強度和電滲現(xiàn)象影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點所帶凈電荷的量、質(zhì)點的大小和形狀采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便

2、、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于有機溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結構，厚度約為120 m，有很強的通透性，對分子移動阻力很小三、實驗儀器1、DYY-8C型常壓電泳儀：北京六一儀器廠生產(chǎn)，1套/2組2.醋酸纖維薄膜（2 cm8cm）：2片/人。 3.培養(yǎng)皿：一排桌子（即4組）公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.點樣器：一個/組。 5.濾紙：公用。 6.玻璃板：一塊/組。 7.鑷子：一個/組。 8.玻棒：公用。 四、實驗試劑1巴比妥緩沖液

3、（pH8.6，離子強度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g，用蒸餾水定容至1000mL。 2染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重復使用）。 3漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混勻。4.人或動物血清：從醫(yī)院或自制，冰凍保存，現(xiàn)取現(xiàn)用五、實驗過程浸泡：將28 cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。將粗糙面朝上置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡20min方可用于點樣點樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一載玻片上滴一滴血清，點樣器（用蓋玻片的一邊）在血

4、清上蘸一下（可來回移動一次），再將點樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線五、實驗過程電泳槽的準備：根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，裁剪尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒入等體積的電泳緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電泳緩沖液中。當濾紙全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上，即為濾紙橋五、實驗過程電泳：將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10 min。通電，調(diào)節(jié)電壓至160 V，電流強度為0.40.6 mA/

5、cm膜寬度，電泳時間約25 min 染色：電泳完畢后將薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中浸泡5 min漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜 六、注意事項保持薄膜清潔，務必戴上塑料手套，勿用手指接觸薄膜表面，以免油污或污物沾上，影響電泳結果。注意醋酸纖維膜的質(zhì)量，至少浸泡10分鐘，浸泡很久仍有大塊白色硬點者須棄之不用。加樣時一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊、不歪。以免影響蛋白質(zhì)區(qū)帶圖譜的完美。電泳槽兩邊的緩沖液應保持液面在同一水平面上，槽里的緩沖液要保持清潔。電泳電壓大小，時間長短與緩沖液的離子強度

6、都有一定的關系。一般電流約0.40.6mA/cm,電壓110160V，通電時間4060min。電壓高，電流大，電泳速度加快，時間可縮短，但薄膜上蒸發(fā)嚴重，因此不能無限增大電流。使用比色皿時要潤洗。染色的同時也是蛋白質(zhì)的固定，所以，不要將很多蛋白條重疊在一起。注意薄膜正負極不要搭反，注意簿膜的正反不要放反。放的時候注意血樣不要與濾紙接觸了。通電完畢時，必須切斷電源，以防觸電事故。七、實驗結果從左至右分別為血清蛋白、1-球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白、點樣處04060709八、失敗圖譜分析拖尾狀：點樣量過多，被分離的血清蛋白不能分離成5條區(qū)帶或產(chǎn)生拖尾。有斑點：點樣不均勻，不整齊，導致被

7、分離的區(qū)帶出現(xiàn)斑點。邊流現(xiàn)象：點樣板蘸取血清一邊多一邊少，導致區(qū)帶分離不清，出現(xiàn)邊流現(xiàn)象。區(qū)帶模糊：薄膜過濕，樣品擴散迅速，導致樣品分離不成區(qū)帶。鋸齒狀：薄膜用濾紙吸水過度（薄膜上出現(xiàn)白斑）或點樣過慢，又未及時大橋，導致薄膜過于干燥，使區(qū)帶成鋸齒狀。區(qū)帶傾斜：薄膜搭載濾紙上的位置歪斜，彎曲，與電流方向不平行，或點樣一邊多一邊少，區(qū)帶容易泳斜。顯色過淺：點樣太少，區(qū)帶顯色不明顯。區(qū)帶重疊：染色時，醋酸纖維薄膜不是一張一張放入染色液的，在染色固定前，薄膜與薄膜之間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。區(qū)帶過密：電泳時電壓，電流或電泳過小或時間不夠，造成區(qū)帶未分離。實驗結果既有清晰的圖譜，也有模糊不清的圖譜九、實驗思考1、為什么要將點樣一端放在電泳槽的負極？答：帶電質(zhì)點在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動。因為血清樣品帶負電荷，在電場中將向正極泳動，所以點樣端要置于負極。2、電泳時電壓表顯示的電壓是否等于加在膜條兩端的實際電壓，為什么？答：不相等。因為在實際中緩沖液兩邊離子不平衡。九、實驗思考3、根據(jù)人血清中蛋白各組分的等電點，估計它們在pH8.6的巴比妥電極緩沖液中電泳移動的相對位置。答：蛋白名稱等電點血清蛋白4.881-球蛋白5.062-球蛋白5.06-球蛋白5.12-球蛋白6