DNA重組技術(shù)的工具

1、1目目 錄錄 專題專題1 基因工程基因工程 專題專題2 細(xì)胞工程細(xì)胞工程 專題專題3 胚胎工程胚胎工程 專題專題4 生物技術(shù)的安全性和倫理問題生物技術(shù)的安全性和倫理問題 專題專題5 生態(tài)工程生態(tài)工程專題專題1 基因工程基因工程3本章考綱要求：本章考綱要求：4學(xué)習(xí)重難點(diǎn)學(xué)習(xí)重難點(diǎn)5學(xué)習(xí)目標(biāo) 1、簡述、簡述DNA重組技術(shù)所需三種基本工具的作用重組技術(shù)所需三種基本工具的作用. 2、認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究、認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究 和技術(shù)創(chuàng)新。和技術(shù)創(chuàng)新。學(xué)習(xí)重、難點(diǎn)學(xué)習(xí)重、難點(diǎn) 1、DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用。重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用。 （重點(diǎn)）（重

2、點(diǎn)） 2、基因工程載體所需要具備的條件。、基因工程載體所需要具備的條件。 （難點(diǎn)）（難點(diǎn)）6一、基因工程的概念 是指按照是指按照人們的愿望人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過過體外體外DNADNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。又叫做型和生物產(chǎn)品。又叫做DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)或或基因拼接技基因拼接技術(shù)術(shù)。78思考 思考：思考： 與誘變育種相比，其特點(diǎn)與誘變育種相比，其特點(diǎn)是是 與雜交育種相比，其特點(diǎn)與雜交育種相比，其特點(diǎn)是是是是 是

3、是 ； 與雜交育種相比，其特點(diǎn)是與雜交育種相比，其特點(diǎn)是定向改造生物性狀定向改造生物性狀克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙 9思考 從結(jié)構(gòu)上分析，為什么不同生物的從結(jié)構(gòu)上分析，為什么不同生物的DNA能能夠重組？夠重組？基本單位相同基本單位相同空間結(jié)構(gòu)相同空間結(jié)構(gòu)相同堿基配對(duì)方式相同堿基配對(duì)方式相同101112二、基因工程的誕生和發(fā)展二、基因工程的誕生和發(fā)展離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新離不開理論研究和技術(shù)創(chuàng)新v閱讀課本：科學(xué)探索之路閱讀課本：科學(xué)探索之路v 基礎(chǔ)理論基礎(chǔ)理論v 技術(shù)發(fā)明技術(shù)發(fā)明1319441944年年艾弗里艾弗里證明證明DNADNA是遺傳物質(zhì)是遺傳物質(zhì)DNADNA可從一

4、種生物個(gè)體可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體到另一種生物個(gè)體 19531953年年沃森沃森、克里克克里克提出提出DNADNA的的雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)模型模型19581958年年梅塞爾松梅塞爾松、斯塔爾斯塔爾證明證明DNADNA的的半保留復(fù)制半保留復(fù)制19581958年克里克年克里克等提出等提出中心法則中心法則19631963年年尼倫伯格尼倫伯格和和馬太馬太破譯編碼氨基酸的破譯編碼氨基酸的遺傳密碼遺傳密碼，19661966年年霍拉納霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明用實(shí)驗(yàn)加以證明。1415問題探討問題探討蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌16問題探討：想一想想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？需要做哪些關(guān)鍵工作？基因工

5、程的基因工程的“專用工具專用工具”一一“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶二二“分子縫合針分子縫合針” DNA連接連接酶酶三三“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體18 閱讀課本閱讀課本4-5頁頁“限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀”的的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)自主學(xué)習(xí)主要從原核生物中分離純化而來主要從原核生物中分離純化而來已經(jīng)分離出大約已經(jīng)分離出大約4000種種1、識(shí)別雙鏈、識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定分子的某種特定核核苷酸序列苷酸序列2、使每一條鏈中使每一條鏈中特定部位特定部位的兩個(gè)核的兩個(gè)核苷酸之

6、間的苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵斷開。斷開。（一類酶一類酶）19限制性內(nèi)切酶作用過程20 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯鍵鍵3端5端3端5端磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵2121仔細(xì)觀察各限制酶仔細(xì)觀察各限制酶 識(shí)別的特定序列有識(shí)別的特定序列有何何 特點(diǎn)？特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序列限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：1、呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，2、都可以找到一條中心軸線，、都可以找到一條中心軸線，3、中軸線兩側(cè)的雙鏈中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的上的堿基是堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的排列的 ，稱為稱為回文序列回文序列22中軸線在G與A

7、之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用23黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切開的被限制酶切開的DNA兩條兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫對(duì)，這樣的切口叫黏性末端黏性末端。24高考命題研究高考命題研究 主要考察對(duì)主要考察對(duì)基因工程概念基因工程概念的理解，的理解，結(jié)合實(shí)例考查基因工程的結(jié)合實(shí)例考查基因工程的操作工具操作工具。 分析近五年高考題，命題往往分析近五年高考

8、題，命題往往給出具體的給出具體的限制酶及切割位點(diǎn)限制酶及切割位點(diǎn)圖示圖示，通過分析切割的結(jié)果考查，通過分析切割的結(jié)果考查限制酶限制酶的作用的作用。25回顧回顧1 1、基因工程的概念、基因工程的概念2 2、限制性核酸內(nèi)切酶、限制性核酸內(nèi)切酶 來源、種類、作用特點(diǎn)、作用結(jié)果來源、種類、作用特點(diǎn)、作用結(jié)果限制酶識(shí)別的限制酶識(shí)別的核苷酸序列核苷酸序列、斷裂的、斷裂的化學(xué)鍵化學(xué)鍵、產(chǎn)生的、產(chǎn)生的末末端端26一、基因工程的概念 通俗地說，就按照通俗地說，就按照 ，通過嚴(yán)格，通過嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過的設(shè)計(jì)，并通過 和和 等技術(shù)，賦予生物以新等技術(shù)，賦予生物以新的的 ，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的，從而創(chuàng)造出更符

9、合人們需要的新的新的 和和 。由于基因工程。由于基因工程是在是在 水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此基基因工程又叫做因工程又叫做 或或 。人們的意愿人們的意愿體外體外DNA重組重組轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因遺傳特性遺傳特性生物類型生物類型生物產(chǎn)品生物產(chǎn)品DNA分子分子DNA重組技術(shù)重組技術(shù)基因拼接技術(shù)基因拼接技術(shù)27基因工程概念的理解基因工程概念的理解 別名：別名： 操作對(duì)象：操作對(duì)象： 操作水平：操作水平： 操作環(huán)境：操作環(huán)境： 操作目的：操作目的： 原理：原理： 結(jié)果：結(jié)果：基因拼接技術(shù)、基因拼接技術(shù)、DNA重組技術(shù)重組技術(shù)基因基因DNA分子水平分子水平生物體外生物體外定向改造生物

10、的遺傳性狀定向改造生物的遺傳性狀不同生物間不同生物間的基因重組的基因重組人類需要的新的人類需要的新的生物類型生物類型和和生物產(chǎn)品生物產(chǎn)品28二、限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性核酸內(nèi)切酶分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀(1)來源：主要從來源：主要從_生物中分離純化出來生物中分離純化出來。(2)種類：迄今已分離出約種類：迄今已分離出約 4 000 種。種。(4)結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或_。(3)作用：識(shí)別特定的作用：識(shí)別特定的_序列，切割序列，切割 特定的特定的兩個(gè)核苷酸之間的兩個(gè)核苷酸之間的_。原核原核核苷酸核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵平末端平末端特異性特異性專一性專一性29限制酶的命名限制酶的命

11、名根據(jù)細(xì)菌種類而定，以根據(jù)細(xì)菌種類而定，以EcoRI為例為例：30三、限制酶識(shí)別的核苷酸序列的特點(diǎn)三、限制酶識(shí)別的核苷酸序列的特點(diǎn)1、呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱；呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱；2、都可以找到一條中心軸線；、都可以找到一條中心軸線；3、中軸線兩側(cè)的雙鏈、中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是上的堿基是 反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列 大多數(shù)限制酶識(shí)別大多數(shù)限制酶識(shí)別6個(gè)核苷酸序列，少數(shù)限制個(gè)核苷酸序列，少數(shù)限制酶識(shí)別酶識(shí)別4、5或或8個(gè)核苷酸序列個(gè)核苷酸序列31黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割32黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端33SmaISmaI只能識(shí)別C

12、CCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G與C之間切割34SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割 當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處中心軸線處切開時(shí)，切開的切開時(shí)，切開的DNADNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末平末端端。3536思考思考1 1、要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性( (平平) )末端？末端？、用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵

13、？酯鍵？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性( (平平) )末端。末端。個(gè)個(gè)3、如果把兩種來源不同的如果把兩種來源不同的DNADNA用同一種限制酶用同一種限制酶切割，結(jié)果如何切割，結(jié)果如何？產(chǎn)生相同黏性（平）末端產(chǎn)生相同黏性（平）末端37思考 4000種限制酶識(shí)別種限制酶識(shí)別85種核苷酸序列。種核苷酸序列。 一種一種限制酶限制酶只能識(shí)別一種只能識(shí)別一種核苷酸序列核苷酸序列。 一種一種核苷酸序列核苷酸序列可以被多種不同可以被多種不同限制酶限制酶識(shí)識(shí)別。別。38 原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)在

14、長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。制，以防止外來病原物的侵害。限制酶限制酶就是細(xì)就是細(xì)菌的一種菌的一種防御性工具，防御性工具，當(dāng)外源當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶利用限制酶將外源將外源DNA切割掉，切割掉，以保證自身的以保證自身的安全。所以，安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。目的。 你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？用是什么嗎？尋根問底尋根問底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的為什么限制酶不剪切

15、細(xì)菌本身的DNA？ 通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其酶的細(xì)胞，其DNADNA分子中分子中不具備這種限制不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列酶的識(shí)別切割序列，或者，或者通過甲基化酶將通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的某種限制酶也不會(huì)使自身的DNADNA被切斷，被切斷，并且可以防止外源并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被

16、修飾序列已經(jīng)被修飾,盡管細(xì)菌中含有某種限制盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以被切斷，并且可以防止外源防止外源DNA的入侵的入侵。39請(qǐng)寫出請(qǐng)寫出EcoRIEcoRI限制酶限制酶切割形成黏性末端的過程。切割形成黏性末端的過程。4041下列下列DNA片段屬于同種限制酶切割的是片段屬于同種限制酶切割的是42類型來源功能相同點(diǎn)差別EcoliDNA連接酶連接酶T4DNA連接酶連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低) 閱讀課本第閱讀課本第5頁頁“分子縫合針”DNA連接酶的相關(guān)內(nèi)的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表容，填寫下表自主學(xué)習(xí)

17、自主學(xué)習(xí)43 將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNADNA連接酶的作用連接酶的作用44兩兩DNADNA片段要具有片段要具有互補(bǔ)互補(bǔ)的黏性末端的黏性末端才能拼起來才能拼起來DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的可把黏性末端之間的縫隙縫隙“縫合縫合”起來起來，注意：注意： DNADNA連接酶可連接雙鏈連接酶可連接雙鏈DNADNA中的中的DNADNA單鏈缺口，但單鏈缺口，但不能連接單鏈不能連接單鏈DNADNA（目前未發(fā)現(xiàn)目前未發(fā)現(xiàn)）！）！4546 T T4 4 DNA DNA連接酶連接酶還可把還可把平末端之間的縫隙平末端之間的縫隙“縫合縫合”起來，但效率較低起來，但

18、效率較低DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用47DNADNA連接酶與連接酶與限制酶的聯(lián)系限制酶的聯(lián)系DNA連接酶的作用： 將雙鏈DNS片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二脂鍵。48同一種同一種49都能催化形成都能催化形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)都是蛋白質(zhì)不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重組組DNA分子分子形成形成DNA的一條的一條鏈鏈基因工程基因工程DNA復(fù)制復(fù)制DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較聚合酶的比較只能將只能將單個(gè)核苷單個(gè)核苷酸酸連接到已有的連接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵在在兩個(gè)兩個(gè)DNADNA

19、片片段之間段之間形成磷形成磷酸二酯鍵酸二酯鍵50幾種工具酶的作用比較幾種工具酶的作用比較51以下是兩種限制酶切割后形成的以下是兩種限制酶切割后形成的DNA片段，試分析：片段，試分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和其中和 是由一種限制酶切割形成的是由一種限制酶切割形成的 末端，兩者要重組成一個(gè)末端，兩者要重組成一個(gè)DNA 分子，所用分子，所用DNA連接連接酶通常是酶通常是 。 （2） 和和 是由另一種限制酶切割形成的是由另一種限制酶切割形成的 末端，兩者要形成重組末端，兩者要形成重組DNA片段，所用的連接酶通常片段，所用的連接酶通常是是 。反饋練習(xí)：反饋練習(xí)

20、：T4DNA連接酶連接酶EcoliDNA連接酶連接酶52【應(yīng)城一中生物】 如圖，就下列與核酸相關(guān)酶的作用機(jī)理填空：限制酶 解旋酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_B.連接a處的酶為_C.切斷b處的酶為_D.連接b處的酶為_無53載體的作用載體的作用載體的必載體的必要條件要條件載體的種類載體的種類閱讀課本第閱讀課本第6頁頁“分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車”運(yùn)載體運(yùn)載體的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)自主學(xué)習(xí)質(zhì)粒（存在于許多質(zhì)粒（存在于許多細(xì)菌細(xì)菌以及以及酵母菌酵母菌等生物細(xì)胞中）等生物細(xì)胞中）病毒：病毒：、動(dòng)植物病毒等。、動(dòng)植物病毒等。 54有有標(biāo)記基因標(biāo)記

21、基因的存在，可的存在，可用用含青霉素含青霉素的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基鑒鑒別別。有有切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)能能復(fù)制復(fù)制并帶并帶著插入的著插入的目目的基因的基因一起一起復(fù)制復(fù)制最常用運(yùn)載體最常用運(yùn)載體質(zhì)粒質(zhì)粒5556天然天然DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？分子可以直接用做基因工程載體嗎？基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有專一性具有專一性(識(shí)別序列識(shí)別序列)切開切開DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵種類種類E.coliDNA連接酶連接酶T4 DNA連接酶連接酶運(yùn)載運(yùn)載工具工具具備的具備的條件條件結(jié)構(gòu)簡單結(jié)構(gòu)簡單,大小適中大小適中能在宿主細(xì)胞中自能在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因具標(biāo)記基因質(zhì)粒、質(zhì)粒、噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒58 已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性已知某種限制性內(nèi)切酶在一線性DNA分子上有分子上有3個(gè)酶?jìng)€(gè)酶切位點(diǎn)，如圖中箭頭所指，如果該線性切位點(diǎn)，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在分子在3個(gè)酶切個(gè)酶切位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生位點(diǎn)上都被該酶切斷，則會(huì)產(chǎn)生a、b