醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-上課用-12.基因診斷

1、2022-6-271第十二章 基因診斷Chapter12 Gene Diagnosis 2022-6-272F第一節(jié) 基因診斷基礎(chǔ)F第二節(jié) 遺傳病的基因診斷F第三節(jié) 傳染病的基因診斷F第四節(jié) 腫瘤的基因診斷F第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 本章內(nèi)容提要2022-6-273l基因診斷之父簡悅威 1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家 Kan YW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例地中海貧血進行診斷。Yuet Wai Kan 1936 第一節(jié)第一節(jié) 基因診斷的技術(shù)和方法基因診斷的技術(shù)和方法2022-6-274一、基因診斷的概念、特點及臨床意義一、基因診斷的概念、特點及臨床意義 基因診斷： 就是用分子生物學(xué)技術(shù)，

2、通過檢測基因及基因表達產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測的目標分子是DNA、RNA或者蛋白質(zhì)。 2022-6-275診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)：1. DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達水平從低到高；2. 基因結(jié)構(gòu)變化，如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。2022-6-276基因診斷的特點： 高特異性 高靈敏性 早期診斷性 應(yīng)用廣泛性2022-6-277二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)l核酸分子雜交（Nucleic acid hybridization） l聚合酶鏈式反應(yīng)(PC

3、R) l單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） l限制性片段長度多態(tài)性（RFLP） lDNA序列測定（DNA sequencing） l生物芯片（biochips） lWestern免疫印跡（Western blot） l免疫組織化學(xué)診斷 2022-6-278（一）核酸分子雜交 指兩條單鏈核酸在一定條件（溫度、鹽離子和有機溶劑濃度）下，按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程。2022-6-279核酸分子雜交流程 待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測雜交信號核酸探針制備探針標記加入標記探針2022-6-2710 提取DNA限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特定長度的片段凝膠電泳分離 變性處理DNA轉(zhuǎn)

4、印到膜上并使其牢固結(jié)合將標記的探針與膜上DNA片段雜交，分析雜交信號。1. Southern 印跡雜交2022-6-2711 RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過分子雜交檢測特定的mRNA分子的含量與大小。2. Northern印跡雜交2022-6-27123. 斑點雜交（dot blotting） 將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達產(chǎn)物的定性及定量的研究。2022-6-27134. 反向斑點雜交 先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品RNA或DNA標記變性后進行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限，

5、大大提高了基因診斷的效率。2022-6-2714 寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對正常和突變ASO探針進行反向斑點雜交，檢測點突變，大大提高檢測結(jié)果的可靠性。等位基因特異性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO）2022-6-2715ASO1ASO2NHMGAGCACATGTN：正?；?；：正?；?；H：雜合子基因；：雜合子基因；M：突變基因：突變基因2022-6-27165. 原位分子雜交l熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）2022-6-2717熒光

6、原位雜交（FISH）2022-6-2718（二） 聚合酶鏈式反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR）模板引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶變性延伸退火2022-6-2719基因診斷中常用的PCR衍生技術(shù):lRT-PCRl熒光定量PCRl多重-PCRlPCR-ASOlAS-PCRlPCR-SSCPlPCR-RFLP2022-6-27201. RT-PCR2022-6-27212. 熒光定量PCR熒光標記引物熒光標記引物2022-6-2722 3. 多重PCR 多重多重PCR示意圖示意圖 A：普通：普通PCR；B：多重：多重PCR2022-6-27234.

7、PCR-ASOASO1ASO2NHMGAGCACATGTN：正?；?；：正常基因；H：雜合子基因；：雜合子基因；M：突變基因：突變基因2022-6-27245. AS-PCR（allele specific PCR） 等位基因特異PCR：根據(jù)引物3端的互補與否，設(shè)計一對與正?；蛲蛔兡０迮鋵Φ奶禺愐?2022-6-2725（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single-strand conformation polymorphism， SSCP) DNA 的突變造成DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來。

8、2022-6-2726PCR-SSCP分析原理2022-6-2727正常人純合突變雜合突變+ PCR-SSCP分析 2022-6-2728 （四）限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 由于DNA 變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段。 可借助核酸分子雜交或PCR進行檢測。2022-6-2729ABCDEFGGAATTCCTTAAGF EcoR 限制性內(nèi)切酶位點的變化EBGC +DADEFBGCA2022-6-2730GAATTCCTTAAG基因組DNA

9、的E.coR酶切電泳圖譜2022-6-2731lPCR-RFLP 設(shè)計適當(dāng)?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。2022-6-2732（五） DNA序列測定（DNA sequencing）2022-6-2733DNA序列測定原理(雙脫氧末端終止法)2022-6-2734左側(cè)：正常；右側(cè)：突變 序列分析用于基因診斷2022-6-2735（六）生物芯片（biochip）l基因芯片（gene chip）l蛋白質(zhì)芯片（protein chip）基因芯片雜交流程示意圖2022-6-2736基因診斷中常

10、用的分子生物學(xué)方法比較基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法基本原理核酸分子雜交錯配時雜交信號減弱或消失PCR變異引起擴增產(chǎn)物不同SSCP突變引起核酸二級結(jié)構(gòu)改變RFLP基因變異改變酶切圖譜DNA測序序列比對尋找差異生物芯片多元雜交尋找信號差異2022-6-2737三、基因診斷技術(shù)路線與方法三、基因診斷技術(shù)路線與方法l直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達是否異常l間接診斷：利用多態(tài)性遺傳標志與致病基因進行連鎖分析2022-6-2738（一）直接診斷途徑必要條件：l被檢測基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系;l被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定;l被檢基因致病的分子機制（突變位點或表達變化）已知.20

11、22-6-27395/5/3/3/RFLP1. 點突變的檢測 （1）有限制性內(nèi)切酶位點改變40 -珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子17突變的檢測 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：A/ A； 3： A/ T； 4： T/ T注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量標準中低于200 bp的片段太小，在0.8的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障礙性貧血癥 2022-6-2741斑點雜交、反向斑點雜交AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、PCR產(chǎn)物直接測序5 5 3 3 （2）無限制性內(nèi)切酶位點改變2022-6-2742

12、 在DNA序列上有一段較長序列的重新排布。包括數(shù)十個堿基到數(shù)千個堿基的丟失、插入、替換、重復(fù)和倒位等，以及染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等. 2. 基因重排的檢測 核酸分子雜交與PCR. 43-基因不同程度缺失引起不同類型的-地貧12正?；菊?輕度貧血 + +輕度貧血0高度貧血 + 0Hb Barts綜合征 0 02022-6-2744BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障礙性貧血的直接基因診斷-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同類型的 -珠蛋白生成障礙性貧血2022-6-2745 -珠蛋白生成障礙性貧血的直接基因診斷

13、aa/aaaa/a-aa/- -a -/a -a -/- - -/- -14kb10kb正常正常缺缺1缺缺2缺缺2缺缺3缺缺42022-6-27463. 基因表達異常的檢測p mRNA的定量或長度分析：RT-PCR、Northern印跡雜交、定量RT-PCR等。p 蛋白質(zhì)變化：Western Blot .2022-6-2747（二）間接診斷途徑1. 采用原因：(1) 致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定(2) 致病突變機理不清(3) 致病位點不便檢測間接診斷：檢測與致病基因連鎖的遺傳標記。2022-6-2748 2. 遺傳標記 DNA多態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個體間同一染色

14、體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異或變異。 多在進化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。 2022-6-2749三代遺傳標記： RFLP VNTR; STR SNP2022-6-27507.6 kb13 kb患者正常(1) RFLP標記的連鎖分析鐮狀紅細胞性貧血病(HBS)的間接基因診斷Hpa7.6 kb13 kbSouthern印跡雜交N H PN：正常；H：雜合子；P：患者（純合子）；黃色區(qū)域為探針2022-6-2751l重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。l串聯(lián)重復(fù)序列散在分布于染色體

15、上。l重復(fù)單位為625 bp，稱為小衛(wèi)星DNA。重復(fù)單位為26 bp，如（TA）n, (CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。（2）串聯(lián)重復(fù)序列長度多態(tài)性分析2022-6-2752串聯(lián)重復(fù)序列長度多態(tài)性分析 串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)含有一些核酸限制性內(nèi)切酶的酶切位點，切割后產(chǎn)生不同長度的DNA片段。 串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)序列是保守的，可設(shè)計特定引物進行PCR，PCR產(chǎn)物長度不同。2022-6-2753 第二節(jié)第二節(jié) 遺傳病的基因診斷遺傳病的基因診斷一、血紅蛋白?。╤emoglobinopathy） （一）鐮狀細胞貧血病 （二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥 二、血友?。℉emophilia） 甲型血友病 三、脆性X綜

16、合征 2022-6-2754l正常（N）的ASO探針： 5-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 l突變（M）的ASO探針： 5-ACT CCT GTG GAG AAG TCT GC-31. 鐮狀細胞貧血病的ASO雜交法檢測 一、血紅蛋白?。ㄒ唬╃牋罴毎氀?022-6-2755斑點雜交結(jié)果，N：正常；M：突變N-ASOM-ASO正常 突變 突變純合子 雜合子 純合子2022-6-275653正?；?.15 kb(CCT GAG G)53突變基因1.35 kb(CCT GTG G)Mst酶切位點（CCTNAGG）2. 鐮狀細胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析2022-6-27

17、570.2 kb1.15 kb1.35 kb正常人攜帶者 患者 鐮狀細胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析2022-6-27583. 鐮狀細胞貧血病的的PCR-RFLP分析 正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng) Mst 消化可生成54 bp和56 bp兩個片段（1），而鐮狀細胞貧血癥患者的DNA片段不被酶切，仍為110 bp（2），雜合子可見三條帶（3）2022-6-27591. PCR-RFLP分析 -珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子17突變的檢測 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量標

18、準中低于200 bp的片段太小，在0.8的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二） -珠蛋白生成障礙性貧血癥2022-6-2760 -珠蛋白生成障礙性貧血癥的反相斑點雜交分析2. 反相斑點雜交2022-6-2761二、血友?。℉emophilia）l甲型血友病是由于血漿凝血因子V（FV）缺陷造成。l甲型血友病的基因突變類型已有300余種，其中點突變占174種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子22的基因倒位所致。2022-6-27621. FV基因倒位的DNA印跡分析 將基因組DNA用Nco I，Dra I或Bcl I等內(nèi)切酶（酶切位點位于交換點兩側(cè)）消化，用特異探針進行雜交分析，正常人表現(xiàn)為21

19、.5 kb、14 kb和16 kb三種類型。I型倒位患者表現(xiàn)為20、17.5和14 kb三種類型；型倒位患者表現(xiàn)為20、16和15.5 kb三種帶型。在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。 2022-6-27632. FV基因突變的檢測（1）依賴于FV基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標記的連鎖分析（2）RFLP連鎖分析（3）VNTR分析（4）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）的連鎖分析64三、脆性X綜合征l脆性 X 智力低下基因1（FMR1）5非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)定的(CGG)n 重復(fù)序列的異常擴增以及相鄰CpG 島的異常甲基化。l正常人中約為 850 拷貝。l攜帶者增多到52200拷貝，相鄰的CpG 島未被

20、甲基化，稱為前突變.l男性患者和脆性部位高表達的女性中，達到2001000拷貝，相鄰的CpG島也被甲基化，稱為全突變.l全突變可關(guān)閉相鄰FMR1基因的表達，F(xiàn)MR1 mRNA在幾乎所有患者不表達或只有低表達，從而出現(xiàn)臨床癥狀。2022-6-2765脆性X綜合征常用基因診斷方法：1PCR-ASO 2DNA連鎖分析 3Southern印跡雜交法4PCR擴增 2022-6-2766 一、病毒性疾病l甲型肝炎病毒（HAV） HAV系RNA病毒，利用RTPCR技術(shù)可從糞便中檢測出甲型肝炎病毒的基因組RNA。 l乙型肝炎病毒（HBV） 設(shè)計保守區(qū)序列引物，擴增各型HBV DNA片段；設(shè)計位于可變區(qū)的引物擴

21、增某一亞型HBV DNA，以便分型。l丙型肝炎病毒（HCV） HCV為正鏈RNA病毒，先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行巢式PCR檢測HCV。 第三節(jié)第三節(jié) 傳染病的基因診斷傳染病的基因診斷2022-6-2767二、細菌引起的疾病l結(jié)核分枝桿菌 先設(shè)計一對特異性引物，用PCR技術(shù)擴增出一383 bp序列，再用探針雜交，靈敏度可達到100個細菌水平。l幽門螺桿菌（HP） 主要采用PCR技術(shù)：檢測HP染色體DNA特異片段；檢測HP尿素酶A基因；用PCR-RFLP鑒別HP菌株。2022-6-2768三、寄生蟲及衣原體感染l瘧原蟲 l卡氏肺孢子蟲l衣原體感染 診斷方法：核酸雜交和PCR技術(shù) 2022-6-27

22、69 第四節(jié)第四節(jié) 腫瘤的基因診斷腫瘤的基因診斷一、原癌基因與抑癌基因的檢測 如原癌基因K-ras第12密碼子點突變：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT ；抑癌基因p53密碼子130290之間的基因突變。二、常見腫瘤的基因診斷 BRCA基因突變與乳腺癌的易感性有關(guān)。 APC是結(jié)腸癌發(fā)生過程中第一個突變基因。 2022-6-2770一、原癌基因與抑癌基因的檢測1原癌基因的檢測： ras 基因家族由H-ras、K-ras和N-ras組成。最常見的突變是第12、13、59或第61位密碼子的點突變。 胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以K-ras突變?yōu)橹?，如?2位密碼子突變，由編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)門GT、

23、GTT或GAT，少數(shù)突變?yōu)镚CT。 急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病等以N-ras突變?yōu)橹鳎?泌尿系統(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹鳌?022-6-2771 2. ras原癌基因突變常用的檢測方法： PCR 及PCR-SSCP分析：擴增ras 基因第12位密碼子點突變部位，再用SSCP技術(shù)進行分析，或者直接測序確定患者ras原癌基因的點突變。 核酸雜交技術(shù)（如ASO）：檢測ras基因第12位密碼子點突變。2022-6-27723抑癌基因p53的檢測：lp53基因以密碼子第175位、第248位、第249位、第273位及 第282位點突變率最高。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、小細胞肺癌，都可見異常的p53

24、基因蛋白。lp53的基因診斷方法有： （1）PCR-SSCP （2）DNA序列分析 （3）PCR-RFLP2022-6-2773（一）乳腺癌1乳腺癌常見基因變異l5%10%乳腺癌患者有家族遺傳性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（breast cancer gene）的突變。lBRCA1突變易致乳腺癌。突變分布于整個編碼序列，沒有明顯的突變簇或突變熱點。70%的缺失或插入導(dǎo)致編碼序列的框移和翻譯提前終止。lBRCA1在N端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險相關(guān)；而在C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。lBRCA2基因在30%40%的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失（LOH）。突變提高乳腺癌

25、易感性。二、常見腫瘤的基因診斷2022-6-2774 2乳腺癌基因診斷方法 （1）PCR法檢測BRCA1基因突變 （2）熒光原位雜交（FISH）檢測BRCA2基因擴增。2022-6-2775（二）結(jié)腸癌1. 結(jié)腸癌常見基因變異l在癌發(fā)展過程的不同階段發(fā)生不同的基因突變。lAPC是結(jié)腸癌發(fā)生過程中第一個突變基因。K-ras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。lDCC基因失活是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能會因18q等位基因丟失而失活。lp53基因的突變是結(jié)腸癌發(fā)展過程的晚期現(xiàn)象。lDNA修復(fù)基因也與結(jié)腸癌有關(guān)。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突變

26、所致的DNA錯配修復(fù)缺陷與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。2022-6-2776 2結(jié)腸癌基因診斷方法 （1）PCR-SSCP法：對腺瘤樣息肉病人APC基因PCR-SSCP技術(shù)進行分析。 （2）異源雙鏈PCR法：檢測APC基因變異。 （3）蛋白質(zhì)免疫印跡法：檢測因基因突變而縮短了的APC蛋白。2022-6-2777 第五節(jié)第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用2022-6-2778l重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。l串聯(lián)重復(fù)序列散在分布于染色體上。l重復(fù)單位為625 bp，稱為小衛(wèi)星DNA。重復(fù)單位為26 bp，如（TA）n, (CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。一、DNA指紋與多態(tài)性遺傳標記2022-6-2779l可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR) 人類染色體上小衛(wèi)星DNA的高度可變區(qū)（HVR）是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeat，TR）組成，TR的核心序列同源性很高，等位HVR的長度由于TR的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別，具高度多態(tài)性。2022-6-2780 DNA長度多態(tài)除可用Southern印跡雜交法檢測外