病理檢驗技術(shù)(1)

1、熒光原位雜交 FISH用DNA探針與組織切片上互補的DNA雜交，通過觀察熒光信號在染色體上的位置和顏色來反映相應(yīng)基因的情況 。第一章 病理檢驗技術(shù)概述病理學的作用： 1、研究疾病的病因、發(fā)病機制，認識 疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律 2、為臨床診斷疾病、治療疾病、分析預 后提供依據(jù)等。病理檢驗的定義： -在臨床醫(yī)療實踐中，通過對患者病變組織或細胞進行檢查，以協(xié)助臨床診斷疾病的方法稱為病理檢驗。一、病理檢驗的主要任務(wù)（一）確定疾病的診斷（二）為臨床選擇治療方案提供依據(jù)（三）提供有關(guān)預后因素的信息。（最正確、最可靠、最后的診斷）（四）了解疾病的發(fā)展及分析療效（五）為科學研究積累資料（六）為提高臨床診斷水平服務(wù)

2、二、病理檢驗分類（一）細胞學檢驗（脫落細胞、細針穿刺吸?。ǘ┙M織學檢驗-最后的診斷 活體組織檢驗、手術(shù)標本檢驗、手術(shù)中病理檢驗（三）尸體剖驗病理學技術(shù)： 在病理學臨床及科學研究工作中使用的各種技術(shù)方法統(tǒng)稱為病理學技術(shù)。病理檢驗技術(shù)的質(zhì)量和水平是臨床病理診斷工作中至關(guān)重要的因素?！凹夹g(shù)是病理學之母?！钡诙?jié)、病理檢驗技術(shù)常規(guī)工作收發(fā)工作協(xié)助取材和尸體剖檢工作制作制作切片及細胞學涂片病理資料管理及檢索藥品、物資的管理及儀器維護大體標本的收集和制作第六章 組織制片技術(shù) P39常規(guī)石蠟切片制作程序組織固定取材固定脫水透明浸蠟包埋切片染色封片觀察第一節(jié) 組織塊的處理（一）組織切片制作過程中的各種操作

3、： 1、取材與固定：合理取材、及時固定； 2、洗滌、脫水、透明； 4、浸蠟、包埋； 5、切片、貼片（展片、撈片）和染色： 6、封片：長期保存。 一、取材： -按照病理檢查的目的和要求，切取適當大小和數(shù)量的組織塊，用于制作組織切片的過程。 注意事項： 部位、大小、形狀、方向二、固定和固定液 固定：將組織浸入某些化學試劑，使組織細胞內(nèi)的物質(zhì)盡量保持在生活狀態(tài)時的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置過程。（一）固定目的： （1）防止組織、細胞的自溶與腐?。?（2）凝固或沉淀細胞內(nèi)物質(zhì)； （3）增加組織硬度，便于制片； （4）產(chǎn)生不同的折光率，有利于染色后觀察辨認。（二）固 定 方 法：1、浸泡固定法：病理外檢一般均用此法

4、；2、注射、灌注法：體積過大或整個臟器或尸體的固定；3、微波固定法：應(yīng)用于臨床病理快速診斷，微波固定組織溫度至關(guān)重要。微波固定介質(zhì)可用 生理鹽水或10%甲醛。4、蒸汽固定法：為了固定組織中可溶性物質(zhì)、 血液、細胞涂片等；（三）固定液的特性：1、滲透力強，迅速滲入組織內(nèi)部2、不會使組織過度收縮或膨脹3、能硬化組織，保持細胞形態(tài)和位置4、使組織對染料產(chǎn)生親和力，產(chǎn)生折光率 （四）組織固定注意事項：1、及時固定2、固定容器宜大3、固定液應(yīng)足量：固定組織體積的10-20倍4、防止組織變形5、確定恰當?shù)墓潭〞r間（五）組織固定液常用固定液： 1、4%甲醛（福爾馬林）：配置為市售的40%甲醛1份加水9份混合

5、即成； 2、酒精（乙醇）：高濃度組織硬化顯著，先用80%固定數(shù)小時，再用95%固定； 3、中性緩沖甲醛液：可提高免疫組化陽性率。 4、酒精-甲醛液（A-F固定液）： 5、Zenker固定液：1、4%甲醛（福爾馬林）：久置能產(chǎn)生白色沉淀（三聚甲醛），容易氧化變成甲酸，嚴重影響細胞核著色。 固定陳舊多血臟器如肝脾，易產(chǎn)生黑色色素，叫甲醛色素。2、酒精（乙醇）： 高濃度組織硬化顯著，先用80%固定數(shù)小時，再用95%固定； 50%以上濃度的乙醇可溶解脂肪和類脂質(zhì)，也可以溶解血色素和損害其他色素。中性甲醛液配置：40%甲醛150-200ml，蒸餾水800-850ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g。

6、常用的固定液或標本保存液，是免疫組化最常用的固定液。選擇性固定液：1、丙酮：廣泛用于組織化學中酶的固定；2、戊二醛固定液：廣泛用于電鏡標本的固定，應(yīng)采用緩沖液配制固定液3、醋酸：不能保存糖，也不能固定脂肪及類脂，5%醋酸pH23可抑制細菌和酶的活性；4、苦味酸：強酸，易燃易爆，酒精溶液可固定糖類；5、氯化汞：只宜固定薄片組織，2mm3mm厚的組織需固定618小時；6、重鉻酸鉀：固定高爾基體、線粒體，對酸性染料著色良好；7、鋨酸：濃度為1%2%水溶液用于電鏡制片；骨組織脫鈣液： 在脫鈣前，先將骨或鈣化組織鋸成4mm5mm厚的簿片，按常規(guī)充分固定，然后進行脫鈣。組織脫鈣的方法及應(yīng)用：（一）酸性溶液

7、脫鈣： 1、脫鈣液配制：（1）5%10%硝酸水溶液：濃硝酸5ml10ml，蒸餾水加至100ml；（2）硝酸甲醛液：濃硝酸10ml，10%福爾馬林90ml；（3）Schridde液：濃硝酸20ml，10%福爾馬林100ml。對組織無明顯損害，迅速、安全；（4）5%10%甲酸水溶液：甲酸5ml10ml，蒸餾水加至100ml（5）甲酸酒精液：脫鈣速度較硝酸慢，但破壞組織也輕。（6）Plank-Rychlo液：脫鈣比5%硝酸液快3倍。Jenkins混合酸脫鈣液、鹽酸氯化鈉液、枸櫞酸鈉、甲酸脫鈣液等2、脫鈣方法：骨片懸于脫鈣液中，敞開瓶口，每日更換一次新液，最好早晚各一次。（二）螯合劑脫鈣：速度很慢，但

8、對組織成分幾乎沒有損害。用于免疫組化染色較理想。1、脫鈣液配制：取乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）25g，溶解于200ml蒸餾水中，氫氧化鈉（NaOH）調(diào)整pH至7.0（大約加2.5g NaOH）。EDTA與鈣可形成一種可溶性非離子化的復合物。2、脫鈣法：將骨片浸入脫鈣液中，每周更換一次新液。一般致密骨脫鈣需要68周，含有少量骨渣的組織約需一周。（三）電解脫鈣法： 此法即在脫鈣液中通過電流，電解加速脫鈣。1、電解脫鈣液配制： 25%鹽酸50ml，25%甲酸200ml，蒸餾水750ml；2、脫鈣方法：直徑30cm電解槽內(nèi)盛大量電解液，將骨組織放在一個四周多孔的塑料小容器內(nèi)放入電解液內(nèi)，此容器通入白金

9、絲或鎢絲作陽極，在電解液內(nèi)再放一白金絲或鎢絲作陰極，通入6V直流電，電流強度1A2A，調(diào)節(jié)兩電極的距離來控制。電解液溫度不超3045，一般26小時即可脫盡。脫鈣后的處理1、脫鈣后的組織經(jīng)流水沖洗412小時，除去殘留的脫鈣劑；2、修去鋸面的薄層組織，切成適當大小的組織塊，進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋；3、用酸性液脫鈣后的組織，蘇木素染色時間應(yīng)適當延長，在伊紅中的時間應(yīng)該縮短；4、脫鈣后組織切片在染色中較易脫落，充分烤片，染色前滴加2%5%的火棉膠液，以使之粘貼牢固。三、 洗滌、脫水、透明（一）組織的洗滌1、洗滌的目的：防止組織中留有較多的固定液而影響脫水劑；2、洗滌的方法： （1）固定劑以水配

10、制者：常用的固定劑是甲醛溶液（10%福爾馬林溶液），用流水沖洗。大組織沖洗24小時，小組織沖洗24小時。（2）固定劑含酒精者：一般不用沖洗，如需要沖洗必須用與固定劑中的酒精濃度相近或略低的酒精沖洗 。（二）組 織 脫 水1、脫水的目的及原則：用某些溶劑逐漸將組織內(nèi)吸收的水分置換出來，以利于透明劑和石蠟或火棉膠的滲入。2、脫水劑的種類及特征： 特征：能與水在任何比例下混合；能與透明劑在任何比例下混合； 單純脫水劑：脫水后再經(jīng)二甲苯透明才浸蠟； 酒精：最常見的脫水劑。脫水能力強，但易使組織收縮、脆。 單純脫水劑：脫水后再經(jīng)二甲苯透明才浸蠟；丙酮：脫水強，組織收縮嚴重，價格高。異丙醇：可代替無水酒精

11、使用。價格貴。脫水兼透明劑：脫水后即可直接浸蠟。正丁醇：為脫水劑兼有透明劑作用。用于植物標本的處理效果較好。叔丁醇：脫水兼透明。電鏡標本制作時常用作中間脫水劑。（三）組織透明或媒浸 目的是使石蠟能浸入組織塊便于包埋。1、二甲苯：最常用的透明劑，有毒、易揮發(fā)，透明力強，但組織易收縮變脆，小塊組織以30分鐘。2、苯和甲苯：組織收縮小、不易變脆。3、氯仿：即三氯甲烷。易發(fā)揮，透明力比二甲苯差，時間長，多用于大塊組織的透明。4、香柏油：為柏樹樹脂，收縮小，透明時間長，常用于染色后切片的透明。四、組織浸蠟（透蠟） P48（一）浸蠟的目的和方法：除去組織中的透明劑而代之以石蠟，以便切片。（二）浸蠟劑的種類

12、：1、石蠟：經(jīng)5658石蠟浸蠟的組織包埋，有利于組織切片的連續(xù)性，對蠟塊資料保存可靠，一般為3-4小時。2、火棉膠：目前使用火棉膠浸入組織較少，多用于染色前的覆蓋液。3、碳蠟；4、明膠。五、組 織 包 埋 P49（一）石蠟包埋法：為最常用的包埋法。1、常規(guī)石蠟包埋法:包埋過程、包埋面的選擇；2、體液標本一般不做包埋和切片。（二）快速石蠟包埋法：1、操作過程：全程均加熱，2030分鐘完成。（1）取材、固定：薄片1cm0.5cm0.3cm,在快速固定液（95%酒精、40%甲醛、冰醋酸）內(nèi)加熱煮沸12分鐘。（2）脫水：組織厚度不超1.5mm，加入丙酮5 8ml，煮沸56分鐘。（3）透明：加二甲苯加熱

13、12分鐘。（4）包埋：石蠟包埋冰水冷卻硬化。3、碳蠟包埋法：即聚乙烯二醇。包埋熔點為38和52左右的分子量為1500和4000兩種。適用于脂肪及脂類組織的制片。4、明膠包埋法：5、石蠟半薄切片包埋法：常根據(jù)組織類型進行脫水、透明和浸蠟。6、樹脂包埋法：適用于不脫鈣骨髓活檢組織、肝、腎穿刺活檢和淋巴結(jié)組織等。第二節(jié) 切片器具與切片一、切片機：制作組織切片的主要儀器設(shè)備。（一）切片機的種類及使用：1、石蠟切片機：能將石蠟包埋的組織切出一定厚薄的切片。分為旋轉(zhuǎn)式、滑動式、擺動式等。最常用的為旋轉(zhuǎn)式。2、冷凍切片機：多為恒冷箱切片機用于組織化學、免疫組化及病理診斷。 3、火棉膠切片機：多用于眼球、內(nèi)耳

14、、脊髓和腦的切片，切片厚度可達20µm50µ。二、組織切片刀 P58（一）切片刀的種類： 其長度一般有 4cm、8cm、14cm、18cm、20cm、24cm等。1、平凹型：一側(cè)為直線，另一側(cè)為凹度，大凹度刀適用于火棉膠切片，小凹度刀適于石蠟切片。2、雙平型：刀身兩側(cè)均無凹度，兩面是平面。適用于冷凍切片和輪轉(zhuǎn)式切片機的石蠟切片。3、雙凹型：刀身兩側(cè)均有凹度，適用于輪轉(zhuǎn)式石蠟切片。4、一次性刀片：需配置專用刀架。（二）刀背套與刀柄：刀背套供磨刀時用，刀背套有金屬和塑料兩種。刀柄有木制及塑料制兩種。（三）磨刀與被刀：1、手工磨刀法：磨刀前用軟布試凈磨刀石面塵垢；裝上刀背和刀柄，

15、滴磨刀油于磨刀石上；右手緊握刀柄，左手緊按刀背另一端，刀刃向前，逐漸推動刀片至磨刀的一端，從右到左全部磨完。2、被刀：用被刀皮革被刀，與磨刀的動作相反；三、石蠟切片制作 P60（一）切片前的準備： 修整蠟塊，然后置于冷水或冰箱中冷卻，以增加硬度； 準備毛筆、眼科彎鑷子； 載玻片均勻涂上薄層蛋清甘油，占2/3； 接通攤片機電源，調(diào)節(jié)攤片（4248） 烤片（60-70左右）的溫度；（二）快速石蠟切片 P63 快速石蠟切片時，組織取材應(yīng)薄，厚度一般不超過2mm，組織固定后要重新修正至1.5mm左右厚度，以利脫水，將組織塊埋入預制的蠟塊內(nèi)，冷卻硬化后方可切片（取材、脫水、透明浸蠟、包埋見）。 切片撈至

16、載波片上，用酒精燈略加烘烤，再入二甲苯脫蠟，經(jīng)95%酒精后即刻入水水化，隨后即可進行常規(guī)快速蘇木素伊紅染色。（三）冷凍切片制作 P64 組織經(jīng)過冷凍后，其內(nèi)的水分結(jié)冰，使組織變硬，有利于切成薄片。一、設(shè)備要求：（一）冷凍切片機：一般由轉(zhuǎn)輪式切片機或推拉式切片機加上制冷裝置而成：1、二氧化碳制冷器；2、半導體制冷器；（二）恒冷箱冷凍卻片機：利用壓縮機通過制冷劑循環(huán)制冷。冰凍切片機二、制作過程（一）取材、固定：選取有代表性的組織制片，厚度12mm。一般病理急診、組織化學顯示酶和免疫病理學進行熒光抗體研究等，多數(shù)都用新鮮組織直接冷凍，切片后再進行固定、染色或直接染色或孵化。采用二氧化碳冷凍設(shè)備制作須

17、先固定。（二）冷凍切片方法：1、恒溫箱冷凍切片法（1）開機預冷：切片前23小時，所需溫度如下： 各種新鮮組織冷凍切片參考溫度（）腦、淋巴結(jié)、肝、腎、脾、睪丸 -12-16肌肉、腎上腺、甲狀腺、子宮、卵巢 -18-22乳腺、皮膚、前列腺 -22-28 （2）放入、速凍、修整組織，待恒冷箱內(nèi)溫度降至要求溫度后，將組織用OT包埋，再速凍12分鐘，裝于機樣本夾上，修平； （3）調(diào)節(jié)抗卷板，以與刀刃平行對齊；（4）切片：所需厚度為4µm8µm，用毛筆展平，貼于潔凈玻片上，晾干或吹干后染色；（5）切片后處理：清潔保養(yǎng)。2、半導體冷凍切片法3、二氧化碳冷凍切片法（三）冷凍切片粘片法1、蛋

18、白甘油粘片法： 按石蠟切片的粘片法處理，但溫度不宜超過40。烤干后即取出，70%酒精和自來水洗后即可染色。2、Lillie明膠粘片法：切片放入1%明膠水溶液數(shù)分鐘，撈到載玻片上，5%甲醛水溶液固定5分鐘，水洗10分鐘，即可染色。3、酒精明膠粘片法：切片浸入0.1%或0.75%明膠溶液（用40%酒精配制）數(shù)分鐘，用載玻片撈起后，室溫干燥，入氯仿1分鐘，經(jīng)95%和75%酒精洗去氯仿，再經(jīng)蒸餾水洗后即可染色。三、注意事項1、冷凍切片的組織不用固定；2、組織盡可能新鮮，不能用濕的鹽水紗布包裹和放入10冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否則組織內(nèi)水分可逐漸析出形成水晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞；3、冷凍包埋劑應(yīng)適量；4、組織太小

19、，不能做冷凍切片；5、冷凍時間太久的組織不能馬上切片，以免損傷切片刀；6、一般來說骨組織和鈣化組織不能做冷凍切片。觀察第七章組織切片染色技術(shù)第一節(jié) 病理切片染色概述 P68一、概念：用染液對組織切片進行處理，使組織中的不同成分被染上相應(yīng)的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，以利于顯微鏡觀察和分析。三、染色的原理 染色就是染色劑和組織細胞相結(jié)合的過程。（一）染色的化學反應(yīng)：組織細胞的酸性物質(zhì)與堿性染料的陽離子相結(jié)合，堿性物質(zhì)與酸性染料的陰離子相結(jié)合。具有酸性的細胞核被堿性蘇木素液所染色，堿性的胞質(zhì)與酸性染料伊紅所染色。（二）染色的物理作用：1、滲透作用：染料進入組織；2、吸附作用：把另一種物質(zhì)的分子、原子、

20、離子集中在界面上的過程；3、吸收作用（溶解作用）。三、常用染料概述：（一）染料的性質(zhì)：有色的無機物或有機化合物1、發(fā)色團：能使染料分子產(chǎn)生顏色的基團，叫發(fā)色團；2、助色團：能使染料分子顏色加深，并與被染物質(zhì)分子形成親和力的基團。（二）染料的分類：1、據(jù)染料來源：天然、合成染料和無機化合物2、根據(jù)染料化學反應(yīng)：酸性、堿性和中性染料3、據(jù)染色對象：（1）組織染料： 1）結(jié)締組織和肌纖維染料：有膠原纖維、網(wǎng)狀纖維、彈力纖維和肌原纖維等染料； 2）神經(jīng)組織的染料：尼氏體、神經(jīng)軸突、神經(jīng)髓鞘、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等染料；（2）細胞染料：細胞核、細胞質(zhì)染料等 常用染色劑簡介見附錄一。五、常用染色術(shù)語的概念一、普通

21、染色：最常應(yīng)用的是蘇木素-伊紅染色法，簡稱HE染色。二、特殊染色：特染是為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分。三、單一染色：選用一種染料染色。四、復染色：用兩種不同性質(zhì)的染料染色方法。五、多種染色法：用兩種以上染料的染色法。第三節(jié) 染色前后的處理 P74一、染色前的處理：1、脫蠟至水：必須經(jīng)過二甲苯脫蠟、各級酒精（100%、95%、85%、75%）至水洗的過程。2、脫汞鹽結(jié)晶：切片在脫蠟后用0.2%0.5%碘酒精處理515分鐘，使汞鹽沉淀物溶解。3、脫甲醛色素：在切片脫蠟至水后，用Verocay液（1%氫氧化鉀水溶液1ml，80%酒精100ml）處理10分鐘，然后流水沖洗5分鐘再常規(guī)染色。（

22、二）染色后的處理：1、分化作用：必須用1%鹽酸酒精脫去所吸附的染料。2、藍化作用：分化后，用堿性水使細胞核變成藍色。3、染色后的脫水：低度到高度酒精逐步脫水。4、染色后的透明：透明劑用二甲苯。三、封固：1、封固劑：（1）甘油明膠封固劑 配制方法：明膠10g，蒸餾水60ml，甘油70ml，石炭酸0.25g。（用前將甘油明膠置于溫箱內(nèi)融化后即可封片）。（2）中性樹膠（二甲苯樹膠液）：屬油性封固劑，組織切片需徹底脫水、透明。優(yōu)良封固劑，可直接封片。 七、染色的注意事項（1）具備實驗室基本設(shè)備和染色準備工作（2）正確完成固定、脫水、透明、脫蠟步驟；（3）染色過程中，既要按書本的方法進行操作，又要根據(jù)實

23、際情況進行靈活運用。第八章 組織切片常規(guī)染色技術(shù)第一節(jié) 常規(guī)染色的概念一、染色原理（一）蘇木素染色原理：蘇木紅和鋁結(jié)合形成帶正電的 藍色色精，帶負電的細胞核與帶正電的藍色色精以離子鍵或氫鍵結(jié)合而被染色。蘇木素在堿性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。（二）伊紅染色原理：伊紅Y是一種化學合成的酸性染料。在伊紅Y染料液中加入醋酸，使胞質(zhì)中蛋白質(zhì)帶正電荷，可被帶負電的伊紅染料染色，從而使細胞質(zhì)及紅細胞等染成紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。二、染液的配制 P80（一）蘇木素液：從蘇木素的樹中提煉的天然染料。1、Harris蘇木素液：最常用。 蘇木素 1g 蒸餾水 200ml 無水酒精 10

24、ml 氧化汞 0.5g 硫酸鋁鉀 20g配置方法見書81頁。染色34分鐘。保存時間為一年。（二）伊紅染液：0.5%伊紅酒精染液:醇溶伊紅Y0.5g，95%酒精100ml。染色時間13分鐘。水溶性伊紅酒精液：沉淀酸化伊紅Y酒精液： 2、Mayer蘇木素改良配法：（1）A液：蘇木素2g，無水酒精40ml加熱溶解；（2）B液：硫酸鋁鉀100g，蒸餾水600ml，稍加熱使硫酸鋁鉀在水中溶解，再將A與B液混合2分鐘。用蒸餾水補足600ml，加入400mg碘酸鈉充分混勻，蘇木素染液呈紫紅色即可。染色時間為1020分鐘。 3、Ehrlich蘇木素液：蘇木素2g，無水酒精100ml，甘油100ml，硫酸鋁鉀1

25、5g，蒸餾水100ml，冰醋酸10ml。（染色時間為1020分鐘）。 4、Gill改良蘇木素液：蘇木素2g，無水酒精250ml，硫酸鋁鉀17.6g，蒸餾水750ml，碘酸鈉0.2g,冰醋酸20ml。染色時間為5分鐘。 （三）0.5%1%鹽酸酒精分化液：鹽酸 0.5ml1ml, 75%酒精99ml。此液用一段時間后需要延長時間或更換液體，新液體分化時間要短。（四）藍化液：“藍化”是指蘇木素液染細胞核后，通過鹽酸酒精分化，切片由酸性轉(zhuǎn)入弱堿性液體，使之變藍的過程。 1、50溫水2、稀氨水（1%氫氧化銨液）3 蒸餾水 100ml，氨水1ml。三、染色方法 P83（一）人工操作蘇木素-伊紅染色方法：1

26、、脫蠟至水：（1）二甲苯脫蠟（脫蠟2-5分鐘）；（2）二甲苯（2-5分鐘）；（3）無水酒精（1-2分鐘）；（4）95%酒精1分鐘；（5）85%酒精1分鐘；（6）75%酒精1分鐘；（7）自來水洗2分鐘；2、蘇木素染色：蘇木素液染色5-10分鐘；自來水洗1分鐘；3、分化返藍：0.5%1%鹽酸酒精分化數(shù)秒至30分鐘呈紫紅色；自來水1分鐘；用溫水(50)藍化515分鐘(或稀氨水藍化30秒，自來水洗510分鐘)；4、伊紅染色：水溶性伊紅可直接入伊紅液，1分鐘；自來水洗1分鐘；5、脫水、透明：（1）85%酒精（20秒）；（2）95%酒精（1分鐘）；（3）無水酒精（1分鐘）；（4）二甲苯（12分鐘）；（5）

27、二甲苯（12分鐘）。6、封固：（1）用中性樹膠封片；（2）附貼標簽可書寫病理編號。（二）冷凍切片HE染色： 冷凍切片貼片后，用95%酒精和冰醋酸5ml的混合液固定1分鐘，自來水洗30秒1分鐘，HE染色。（三）快速石蠟切片染色：脫蠟至水、HE染色第三節(jié) 染色中常見問題及注意事項 P85 HE染色結(jié)果： 細胞核被蘇木素染成明顯的藍色； 細胞質(zhì)被伊紅染成紅色。第9章 組織切片特殊染色 P87為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或組織細胞特殊成分，采用特定的染料和方法對組織切片進行染色。第一節(jié) 結(jié)締組織染色 P88一、 膠原纖維染色Van Gieson染色法（簡稱VG染色）（書上無）1、染料配制：（1）鐵蘇木素液：

28、見Masson三色染色（2）Van Gieson苦味酸酸性品液： 甲液：1.22%苦味酸飽和水溶液90ml， 乙液 ： 1%酸性品紅水溶液10ml。 兩液提前配制，臨用前混合使用。2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水 （2）蒸餾水洗（3）Weigert鐵蘇木素液染510分鐘（4）自來水洗2分鐘（5）據(jù)情況可用0.5%鹽酸酒精分化（6）自來水洗至變藍再用蒸餾水洗（7）Van Gieson液染色35分鐘（8）去染液，用95%酒精分化脫水（9）無水酒精脫水 （10）二甲苯透明（11）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：膠原纖維紅色,肌纖維黃色,細胞核黑色.4、膠原纖維染色的應(yīng)用 P88（1）對梭形細胞腫瘤來源、

29、性質(zhì)提供診斷和鑒別診斷的依據(jù)； （2）顯示各種組織、器官病變時的修復情況與纖維化程度，如肝穿組織中纖維組織的含量與分布的觀察； （3）鑒定心肌壞死后疤痕的形成； （4）鑒別心內(nèi)膜彈力纖維增生癥與心內(nèi)膜心肌纖維化。三、 網(wǎng)狀纖維染色Gomori銀染法: P921、染液配制：銀氨溶液：甲液：硝酸銀10.2g,蒸餾水100ml；乙液:氫氧化納3.1g,蒸餾水100ml2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水（2）高錳酸鉀氧化液（高錳酸鉀0.5g,蒸餾水95ml,再加3%硫酸5ml)5分鐘(3)水洗1分鐘(4)2%草酸漂白2分鐘,水洗2分鐘(5)2%硫酸鐵銨媒染2分鐘(6)蒸餾水充分洗(7)氨銀溶液染色1分鐘

30、(8)蒸餾水洗3次(9)20%福爾馬林液還原5分鐘(10)蒸餾水洗2次(11)入0.2%氯化金液中調(diào)色2分鐘,蒸餾水洗2次(12)2%硫代硫酸鈉固定2分鐘,自來水、蒸餾水洗（13）必要時用VG或伊紅復染（14）無水酒精脫水（15）二甲苯透明（16）中性樹脂封固。3、染色結(jié)果：網(wǎng)狀纖維呈黑色，膠原纖維呈紅色。4、網(wǎng)狀纖維染色的應(yīng)用（1）區(qū)分上皮性與非上皮性腫瘤；（2）區(qū)分血管內(nèi)皮瘤與血管外皮瘤；（3）判斷原位癌與早期浸潤癌；（4）觀察肝臟病變處的網(wǎng)狀支架塌陷或增生的情況，判斷病變性質(zhì)、程度及發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。四、多色染色： P93（一）Masson三色染色法： P931、染液配制：（1）麗春紅酸性品紅

31、液：麗春紅0.7g，酸性品紅0.3g，冰醋酸1ml，蒸餾水99ml（先配好醋酸溶液后，分別溶解麗春紅或酸性品紅）；亮綠液：亮綠1.0g，冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。（2）苯胺藍液：苯胺藍2g，冰醋酸2ml，蒸餾水加至100ml。（3）Weigert鐵蘇木素液：甲液：蘇木素1g，95%酒精或無水酒精100ml；乙液：29%三氯化鐵水溶液4ml，純鹽酸1ml，蒸餾水95ml（臨用前取甲、乙兩液混合即可，24小時內(nèi)使用有效。）2、Masson三色的染色步驟：（1）切片脫蠟至蒸餾水；（2）Weigert鐵蘇木素染色510分鐘；（3）流水稍洗；（4）鹽酸酒精分化；（5）流水沖洗數(shù)分鐘；（6）麗春紅酸性

32、品紅液染色5分鐘；（7）蒸餾水稍沖洗；（8）1%磷鉬酸水溶液處理5分鐘，鏡下見肌肉纖維呈紅色，膠原纖維呈淡紅色即可；（9）不經(jīng)水而直接用苯胺藍液或亮綠液染5分鐘；（10）1%冰醋酸處理1分鐘；（11）95%酒精、無水酒精脫水；（12）二甲苯透明；（13）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：膠原纖維呈藍色（用苯胺藍染）或綠色（用亮綠染），肌纖維、細胞質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍褐色。（二）Mallory三色染色法 P941、染液配制：（1）0.5%酸性品紅水溶液；（2）苯胺藍橙黃G液：苯胺藍0.5g，橙黃G 2g，磷鎢酸1g，蒸餾水100ml。（先將1%的磷鎢酸溶液配好，一半用于溶解苯胺藍，另一半用于溶解橙黃G

33、，加熱溶解，冷卻后分別過濾，可長期保存。臨用前將兩液混合）。（3）重鉻酸鉀液；2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水；（2）Zenker固定液固定1小時；（3）充分水洗；（4）0.5%碘酒精處理510分鐘；（5）0.5%硫代硫酸納處理25分鐘；（6）充分水洗，再用蒸餾水浸洗；（7）酸性品紅液染5分鐘；（8）水洗、蒸餾水洗；（9）苯胺藍橙黃-G液染2030分鐘；（10）直接95%酒精快速分化；（11）無水酒精脫水；（12）二甲苯透明；（13）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：膠原纖維、網(wǎng)狀纖維呈藍色，心機纖維橘紅色，紅細胞呈淺黃色，細胞核呈黑色。結(jié)締組織復合染色的應(yīng)用（1）區(qū)分各種纖維成分；（2）判定各種組

34、織、器官的病變程度和修復情況；（3）鑒別某些梭形細胞軟組織腫瘤的來源的判斷（4）用于腎小球腎炎的診斷。第二節(jié) 肌肉組織染色 P95（一）Mallory磷鎢酸蘇木素染色法（簡稱PTAH）：1、染液配制（1）磷鎢酸蘇木素：蘇木素0.1g, 磷鎢酸2g, 蒸餾水100ml。 將蘇木素加入20ml蒸餾水中,加熱溶解，再將磷鎢酸溶于80ml蒸餾水中。蘇木素冷卻后將兩液混合放置33月后使用。此液可保存數(shù)年。急用時可加高錳酸鉀0.15g促成熟,1224小時即可用。（2）酸性高錳酸鉀液：5%高錳酸鉀水溶液50ml； 0.5 硫酸水溶液50ml。 2、染色步驟：（1）組織以Zenker液固定最佳；如用甲醛固定則

35、先要用Zenker液處理（37溫箱內(nèi)）3小時；（2）切片脫蠟至水，用碘液除汞，用95%酒精脫碘；（3）充分水洗；（4）酸性高錳酸鉀液處理510分鐘（5）自來水洗2分鐘；（6）1%草酸漂白1分鐘；（7）自來水洗，蒸餾水洗2次；（8）磷鎢酸蘇木素液浸染2448小時；（9）直接用95%酒精分化；（10）無水酒精脫水；（11）二甲苯透明；（12）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：橫紋肌纖維、細胞核呈紫藍色，膠原纖維、網(wǎng)狀纖維呈玫瑰紅色。4、肌肉組織染色 常用于Mallory磷鎢酸-蘇木素染色法能顯示與區(qū)分：(1)橫紋肌纖維的正常與異常形態(tài)；(2)診斷心肌損傷早期病變及全身彌漫性血管內(nèi)凝血有一定參考價值；(3

36、)用于橫紋肌肉瘤時顯示橫紋，(4)用于顯示神經(jīng)膠質(zhì)。第三節(jié) 脂肪染色 P96 蘇丹染色法： (書上無)1、染料配制：（1）蘇丹染液：蘇丹 0.15g,60%70%酒精100ml。（將蘇丹染料溶于60%70%酒精形成飽和液，作長期備用液。臨時配制時需要過濾才可使用。備用液僅用上清液。密封容器存放備用液）。 （2）甘油明膠液：明膠 5g，甘油35ml， 蒸餾水 35ml。（先將明膠溶于蒸餾水中加熱溶解，再加甘油充分混合，加12粒石炭酸。冷卻后4保存，用時水浴加熱）。2、蘇丹染色步驟：（1）冷凍切片厚8µm10µm；（2）蒸餾水稍洗；（3）Harris蘇木素12分鐘；（4）自來水

37、洗，鹽酸酒精分化、反藍；（5）水洗、蒸餾水洗；（6）70%酒精浸洗；（7）蘇丹染液3060分鐘（如置于56溫箱中可縮短時間）；（8）70%酒精分化數(shù)秒；（9）蒸餾水洗；（10）在空氣中稍晾干；（11）甘油明膠液封固。3、注意事項：采用冰凍切片染色。蘇丹染液溫浸時應(yīng)加蓋，防止染液中的酒精或丙酮揮發(fā)。在封固前，甘油明膠液應(yīng)放置56溫箱中加溫，避免搖蕩，防止封固時出現(xiàn)氣泡。切片染色后不能長期保存，應(yīng)盡快觀察或照相。4、染色結(jié)果：脂肪呈橘紅色，脂肪酸不作色，細胞核呈淡藍色。5、脂肪染色的應(yīng)用 （1）鑒別細胞內(nèi)空泡的性質(zhì)（水樣變性、脂肪變性或糖原）； （2）顯示動脈粥樣斑塊病灶內(nèi)的脂質(zhì)沉積、脂肪栓塞。

38、（3）神經(jīng)系統(tǒng)一些變性、脫髓鞘疾病的診斷有極為重要的作用。 （4）脂肪染色主要用于卵巢纖維瘤與卵泡膜細胞瘤、腎母細胞瘤、皮脂腺癌的診斷和鑒別診斷。第四節(jié) 糖原染色與粘液染色一、過碘酸雪夫染色法（PAS法）：P981、染色配制：（1）過碘酸氧化液：過碘酸0.5g，蒸餾水100g。（此溶液應(yīng)放4冰箱保存）。（2）Schiff液：堿性品紅 1g，1mol/L鹽酸 20ml，偏重亞硫酸鈉（鉀）1g，雙蒸餾水200ml。（先將雙蒸餾水200ml煮沸，加入1g堿性品紅，再煮沸2分鐘。冷卻至50加1mol/L的鹽酸20ml，待溫度降低至25時，加入偏重亞硫酸鈉（鉀）1g1.5g,溫室2小時后堿稍帶紅色，5小

39、時后為無色液體，如有顏色應(yīng)加入活性炭1g1.5g,用雙層濾紙過濾,盛于棕色磨口瓶內(nèi),放入4冰箱保存。2、染色步驟：（1）切片脫蠟至水；（2）蒸餾水洗；（3）0.5%過碘酸氧化液1020分鐘；(4)充分蒸餾水洗；（5）進入Schiff液染色10分鐘（如室溫低于15可稍加溫）；（6）自來水洗10分鐘；（7）用Mayer或 Harris明礬蘇木素染細胞核35分鐘；（8）鹽酸酒精分化；（9）水洗；（10）無水酒精脫水；（11）二甲苯透明；（12）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：糖原及其它PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)染成紅色，細胞核染成藍色。4、糖原染色的應(yīng)用 （1）用于顯示糖原，對明確細胞空泡的性質(zhì)、糖原貯積病和糖

40、尿病的診斷及某些透明細胞腫瘤的鑒別診斷方面具有重要作用。 （2）用于中性黏液物質(zhì)，對低分化腺癌的診斷也有一定價值。 （3）清楚地顯示基底膜（腎炎的診斷）、網(wǎng)狀纖維、真菌菌絲、寄生蟲及腺泡狀軟組織肉瘤中胞質(zhì)內(nèi)結(jié)晶體。 （4）觀察缺血缺氧早期心肌壞死或梗死區(qū)的糖原減少情況。 粘液染色二、奧辛藍染色法（簡稱AB染色）：P991、染液配制：（1）AB液：（pH 2.5) 奧辛藍8GS 1g，蒸餾水97ml，冰醋酸3ml，麝香草酚2粒（防腐）。（先配好3%冰醋酸，然后溶解奧辛藍。過濾后使用。pH值2.53.0之間.(2)0.5%中性紅水溶液: 中性紅 0.5g,蒸餾水加至 100ml。2、奧辛藍染色步驟

41、： (1）石蠟切片脫蠟至水；(2)AB液染色2030分鐘；（3）快速蒸餾水洗；（4）0.5%中性紅染12分鐘；（5）快速只能流水洗；（6）95%酒精、無水酒精脫水；（7）二甲苯透明；（8）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：酸性粘液物質(zhì)（及真菌菌絲、隱球菌的夾膜）呈藍色，中性粘液呈紅色，混合粘液呈紫紅色，細胞核呈紅色。4、粘液染色的應(yīng)用（1）黏液性腫瘤的診斷和鑒別診斷，如黏液瘤、黏液肉瘤、脂肪瘤、胃腸道低分化腺癌、軟骨黏液樣纖維瘤；（2）用于結(jié)締組織疾病及慢性胃炎腸上皮化生等的診斷。 第五節(jié) 病原微生物染色 P100石炭酸品紅抗酸桿菌染色法：P1011、染色配制： 石炭酸品紅液：堿性品紅 1g， 無水

42、酒精 10ml， 石炭酸（5%）水溶液100ml。 （首先將堿性品紅溶于無水酒精，然后與石炭酸水溶液混合，臨使用前過濾）。2、抗酸桿菌染色步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水；（2）將石炭酸品紅液滴切片上，文火熱至蒸氣出現(xiàn)，離火染1520分鐘；（3）蒸餾水洗；（4）1%鹽酸酒精液分化，至無紅色染料流下止；（5）蒸餾水洗；（6）1%美藍液復染2分鐘；（7）95%酒精分化，美藍脫色，以示清楚；（8）無水酒精脫水；（9）二甲苯透明；（10）中性樹膠封固。3、染色結(jié)果：抗酸桿菌(如結(jié)核桿菌、麻風桿菌等）呈紅色，細胞核呈淡藍色。4、病原微生物染色的應(yīng)用用于結(jié)核病的干酪樣壞死灶及麻風病中泡沫狀細胞（瘤型麻風）內(nèi)的

43、抗酸桿菌，其形態(tài)特點是：結(jié)核分支桿菌彎曲細長，長短粗細不一；而麻風桿菌短粗成堆，數(shù)量較多（稱為麻風團）。淀粉樣物質(zhì)的染色（書上無）Bennhola剛果紅染色法：1、染色配制：（1）1%剛果紅水溶液： 剛果紅 1g， 蒸餾水100ml。（2）碳酸鋰飽和水溶液：碳酸鋰 1.25g， 蒸餾水100ml。2、染色結(jié)果： 淀粉樣物質(zhì)呈紅色，其它組織呈淺紅色，細胞核呈藍色。3、Bennhola剛果紅染色步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水；（2）明礬蘇木素染液淡染細胞核35分鐘；（3）1%鹽酸酒精液稍分化。水洗12分鐘；（4）充分水洗返藍；（5）蒸餾水稍洗；（6）1%剛果紅溶液染色1030分鐘或更長；（7）經(jīng)碳酸鋰飽和溶液處理12分鐘；（8）80%酒精液急速分化至無紅色染液流下為止；（9）水洗12分鐘；（10）95%酒精脫水及無水酒精脫水；（11）二甲苯透明；（12）中性樹膠封固。4、淀粉樣物質(zhì)的染色的應(yīng)用（1）淀粉樣物質(zhì)染色能顯示變性程度:如全身淀粉樣變性；（2）用于全身消耗性疾病的觀察:如結(jié)核病、甲狀腺髓樣癌等；（3）用于腫瘤的診斷和鑒別診斷:如內(nèi)分泌腫瘤的間質(zhì)常出現(xiàn)淀粉樣物質(zhì)沉著，又如甲狀腺髓樣癌、胰島細胞瘤、肺小細胞癌等，淀粉樣物質(zhì)染色陽性可作為診斷重要依據(jù)；（4）為某些疾病的診斷與鑒別診斷提供依據(jù):鈣化上皮瘤、聲