第二章預(yù)處理技術(shù)

1、第二章第二章 預(yù)處理技術(shù)預(yù)處理技術(shù)2.5 離心技術(shù)離心技術(shù)2.1 概述概述2.2 發(fā)酵液過濾特性的改變與相對純化發(fā)酵液過濾特性的改變與相對純化2.3 絮凝與凝聚絮凝與凝聚2.4 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎2.1 2.1 概述概述生物材料的預(yù)處理過程一般有以下幾個步驟：生物材料的預(yù)處理過程一般有以下幾個步驟：動物組織和器官動物組織和器官要先除去結(jié)締組織、脂要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，然后絞碎，選擇適當(dāng)?shù)姆镜确腔钚圆糠?，然后絞碎，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┬纬杉?xì)胞懸液。溶劑形成細(xì)胞懸液。植物組織和器官植物組織和器官要先去殼、除脂，再粉碎，要先去殼、除脂，再粉碎，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┬纬杉?xì)胞懸液。選擇適當(dāng)?shù)娜軇┬纬杉?xì)胞

2、懸液。發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織分泌液以及發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)液、組織分泌液以及制成的細(xì)胞制成的細(xì)胞懸液懸液等則根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物所處位等則根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物所處位置不同進(jìn)行相應(yīng)的處理。置不同進(jìn)行相應(yīng)的處理。 發(fā)酵液預(yù)處理的目的和內(nèi)容發(fā)酵液預(yù)處理的目的和內(nèi)容 相對純化。相對純化。發(fā)酵液預(yù)處理的主要目的發(fā)酵液預(yù)處理的主要目的：*發(fā)酵液預(yù)處理的主要包括發(fā)酵液預(yù)處理的主要包括： 改變發(fā)酵液改變發(fā)酵液(培養(yǎng)液培養(yǎng)液)的物理性質(zhì)，以利于的物理性質(zhì)，以利于固液分離。主要方法有加熱、調(diào)整固液分離。主要方法有加熱、調(diào)整pH 、凝聚和絮凝。凝聚和絮凝。去除發(fā)酵液去除發(fā)酵液(培養(yǎng)液培養(yǎng)液)中部分雜質(zhì)，以利于中部分雜質(zhì)，以利于提取和

3、精制后繼各工序的順利進(jìn)行。提取和精制后繼各工序的順利進(jìn)行。發(fā)酵液過濾特性的改變；發(fā)酵液過濾特性的改變；2.1 2.1 發(fā)酵液過濾特性的發(fā)酵液過濾特性的 改變與相對純化改變與相對純化這些特性使得發(fā)酵液的過濾與離心相當(dāng)困難這些特性使得發(fā)酵液的過濾與離心相當(dāng)困難微生物發(fā)酵液的特性為：微生物發(fā)酵液的特性為：發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，懸浮液中大部分是水；發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；液相粘度大，大多為非牛頓型流體； 性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧性質(zhì)不

4、穩(wěn)定，隨時間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響成分復(fù)雜，雜質(zhì)較多。成分復(fù)雜，雜質(zhì)較多。一、改善發(fā)酵液過濾特性的方法：一、改善發(fā)酵液過濾特性的方法：1. 降低液體黏度降低液體黏度2. 調(diào)整調(diào)整pH3. 加入反應(yīng)劑加入反應(yīng)劑4. 加入助濾劑加入助濾劑5. 凝聚凝聚6. 絮凝絮凝 常用的方法有加水稀釋法和常用的方法有加水稀釋法和加熱法加熱法。加水。加水稀釋法會加大后續(xù)過程的處理任務(wù)。稀釋法會加大后續(xù)過程的處理任務(wù)。1. 降低液體黏度降低液體黏度注意事項：注意事項：嚴(yán)格控制加熱溫度與時間。首先，嚴(yán)格控制加熱溫度與時間。首先，加熱的溫度必須控制

5、在不影響目的產(chǎn)物活性加熱的溫度必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性變質(zhì)的范圍內(nèi)；其次，溫度過高或時間過長，變質(zhì)的范圍內(nèi)；其次，溫度過高或時間過長，會使細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液會使細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性，影響其后的產(chǎn)物分離與純化。的復(fù)雜性，影響其后的產(chǎn)物分離與純化。 此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方此法是發(fā)酵工業(yè)中發(fā)酵液預(yù)處理較常用的方法之一，方法簡單有效、成本低廉。法之一，方法簡單有效、成本低廉。 如利用酸堿性來如利用酸堿性來調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值使蛋白質(zhì)等兩性值使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)達(dá)到等電點物質(zhì)達(dá)到等電點得以除去。又如過濾中，發(fā)得以除去。又如過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與

6、膜發(fā)生吸附，通過酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染?？蓽p少堵塞和污染。 2. 調(diào)整調(diào)整pH3. 加入反應(yīng)劑加入反應(yīng)劑加入反應(yīng)劑可和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)加入反應(yīng)劑可和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀生成不溶性沉淀，如，如CaSO4、AlPO4等。等。生成的沉淀能防止菌絲體黏結(jié)，使菌絲具生成的沉淀能防止菌絲體黏結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠體物和懸浮物凝固，從而改善過且能使膠體物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。濾性能。助濾劑的微粒大小、粒度

7、分布及添加量助濾劑的微粒大小、粒度分布及添加量對過濾速度影響很大。對過濾速度影響很大。4. 加入助濾劑加入助濾劑助濾劑是一種助濾劑是一種不可壓縮不可壓縮的的多孔多孔微粒，它能微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。使濾餅疏松，濾速增大。常有的助濾劑有常有的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾助濾劑的使用方法有兩種：一種是在過濾介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，另一種是直接加入介質(zhì)表面預(yù)涂助濾劑，另一種是直接加入發(fā)酵液，也可兩種方法同時使用。發(fā)酵液，也可兩種方法同時使用。

8、在采用離子交換提取時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的在采用離子交換提取時，會影響樹脂對生化物質(zhì)的交換容量。交換容量。在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受在常規(guī)過濾或膜過濾時，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。污染，影響過濾效率。 因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。因此，在預(yù)處理時，應(yīng)盡量除去這些物質(zhì)。二、二、 發(fā)酵液的相對純化發(fā)酵液的相對純化1.高價無機離子（高價無機離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）2.雜蛋白雜蛋白在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容在采用離子交換和吸附法提取時會降低其交換容量和吸附能力；量和吸附能力；在有機溶劑法或雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，在有機溶劑法或

9、雙水相萃取時，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清；使兩相分離不清；（一）高價無機離子的去除方法（一）高價無機離子的去除方法2. Mg2+三聚磷酸鈉三聚磷酸鈉(Na5P3P10)形成形成 三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物 1. Ca2+ 草酸、草酸、草酸鈉草酸鈉形成草酸鈣形成草酸鈣沉淀沉淀（注意回收草酸）（注意回收草酸） 3.Fe2+ 黃血鹽黃血鹽(K4Fe(CN)6) 普魯士藍(lán)普魯士藍(lán) 沉淀沉淀（二）雜蛋白的去除方法（二）雜蛋白的去除方法1. 沉淀法沉淀法2. 變性法變性法 3. 吸附法吸附法l在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽

10、、鎢酸鹽、苦味如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；l在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如如Ag+、Cu+、Zn+、Fe+和和Pb+等等形成沉淀。形成沉淀。1. 沉淀法沉淀法2. 變性法變性法 加熱，加熱， 大幅度調(diào)節(jié)大幅度調(diào)節(jié)pH值，值， 加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑等。性劑等。不足之處不足之處 加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；加熱法只適合于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物； 極端極端pH值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要值也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；

11、消耗大量酸堿； 有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。較少的場合。 在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。 3. 吸附法吸附法n采用凝聚和絮凝技術(shù)采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變能有效

12、改變細(xì)胞、細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)分散狀態(tài)，使其使其聚結(jié)成較大的顆粒聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾，便于提高過濾速率。常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)速率。常用于菌體細(xì)小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。酵液的預(yù)處理。第三節(jié)第三節(jié) 凝聚與絮凝凝聚與絮凝n凝聚凝聚是指在某些電解質(zhì)作用下，破是指在某些電解質(zhì)作用下，破壞細(xì)胞，菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分壞細(xì)胞，菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程。散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程。一、凝聚一、凝聚概念概念n原理：原理：發(fā)酵液發(fā)酵液(培養(yǎng)液培養(yǎng)液)中細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)中細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面都帶

13、有同種等膠體粒子的表面都帶有同種電荷電荷，使得這些，使得這些膠體粒子之間相互排斥，保持一定距離而不互膠體粒子之間相互排斥，保持一定距離而不互相凝聚。另外，這些膠體粒子和水有高度的親相凝聚。另外，這些膠體粒子和水有高度的親和性，其表面很容易吸住水分，形成一層和性，其表面很容易吸住水分，形成一層水膜水膜，從而使膠體粒子呈分散狀態(tài)。在發(fā)酵液從而使膠體粒子呈分散狀態(tài)。在發(fā)酵液(培養(yǎng)培養(yǎng)液液)中加入電解質(zhì)，就能中加入電解質(zhì)，就能中和中和膠體粒子的膠體粒子的電性電性，奪取膠體粒子表面的水分子，奪取膠體粒子表面的水分子，破壞破壞其表面的其表面的水水膜膜，從而使膠體粒子能直接碰撞而聚集起來。，從而使膠體粒子能

14、直接碰撞而聚集起來。一、凝聚一、凝聚n陽離子對帶負(fù)電荷的凝膠凝聚能力的次序為：陽離子對帶負(fù)電荷的凝膠凝聚能力的次序為： Al3+Fe 3+ H+ Ca2+ Mg2+ K + Na + Li + 無機無機鹽類鹽類：金屬氧金屬氧化物類：化物類：Al2(SO4)3.18H2O (明礬明礬)、AlCl3.6H2O、FeCl3 、 ZnSO4 、 MgCO3等等Al(OH)3、 Fe3O4 、 Ca(OH)2或石灰等或石灰等(2) 常用的凝聚劑常用的凝聚劑n絮凝絮凝指使用絮凝劑指使用絮凝劑(通常是天然或通常是天然或合成的大相對分子質(zhì)量物質(zhì)合成的大相對分子質(zhì)量物質(zhì))，在懸浮，在懸浮離子之間產(chǎn)生架橋作用而使

15、膠粒形成粗離子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過程。大的絮凝團(tuán)的過程。二、絮凝二、絮凝概念概念n絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，其相對分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽離子（如或陽離子（如-NH2）基團(tuán)以及不帶電荷）基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。的非離子型基團(tuán)。n它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。作用，強

16、烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架連接橋架連接時，就形成時，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。 二、絮凝二、絮凝絮凝作用示意圖絮凝作用示意圖必須具有長鏈的線性結(jié)構(gòu)必須具有長鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時與多，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮團(tuán)，但相對分子個膠粒吸附形成較大的絮團(tuán)，但相對分子質(zhì)量不能超過一定限度，以使其具有良好質(zhì)量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。的溶解性。分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團(tuán)，使之，使之能和膠粒

17、表面相結(jié)合；能和膠粒表面相結(jié)合；2. 對絮凝劑化學(xué)結(jié)構(gòu)的一般要求對絮凝劑化學(xué)結(jié)構(gòu)的一般要求1）有機高分子聚合物有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機高分子聚合物無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽、，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；聚合鐵鹽等；3）天然有機高分子絮凝劑天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。糖、脫乙酰殼多糖等。工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：3. 常用的絮凝劑常用的絮凝劑目前最常見的高分子聚合物絮凝劑目前最常見

18、的高分子聚合物絮凝劑:有機合成的聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺衍生物有機合成的聚丙烯酰胺類和聚乙烯亞胺衍生物根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分根據(jù)活性基團(tuán)在水中解離情況不同，可分為三類：為三類：n非離子型、非離子型、n陰離子型（含有羧基）陰離子型（含有羧基）陽離子型（含有胺基）陽離子型（含有胺基）3. 常用的絮凝劑常用的絮凝劑聚丙烯酰胺類絮凝劑的聚丙烯酰胺類絮凝劑的優(yōu)點優(yōu)點l用量少，一般以用量少，一般以mg/L計量；計量；l絮凝體粗大，分離效果好；絮凝體粗大，分離效果好；l絮凝速度快；絮凝速度快；l種類多，適用范圍廣。種類多，適用范圍廣。聚丙烯酰胺類絮凝劑的聚丙烯酰胺類絮凝劑的缺點缺點u存在一定的

19、毒性，特別是陽離子型聚存在一定的毒性，特別是陽離子型聚丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)丙烯酰胺，用于食品和醫(yī)藥工業(yè)時應(yīng)謹(jǐn)慎。謹(jǐn)慎。4. 絮凝的影響因素絮凝的影響因素l攪拌速度和時間：攪拌速度和時間：初期高速，接著應(yīng)初期高速，接著應(yīng)延長攪拌時間，降低攪拌速度。延長攪拌時間，降低攪拌速度。l絮凝體的濃度：絮凝體的濃度：最佳添加量往往需通最佳添加量往往需通過實驗確定過實驗確定l溶液的溶液的pH：通過實驗確定通過實驗確定l絮凝劑的相對分子質(zhì)量：絮凝劑的相對分子質(zhì)量：要適當(dāng)要適當(dāng)?shù)矸勖赴l(fā)酵液中淀粉酶發(fā)酵液中n對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，對于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機理

20、才能提高過要采用凝聚和絮凝雙重機理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機理的過程，稱為混凝。程，稱為混凝。三、混凝三、混凝n對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用對于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒陽離子型高分子絮凝劑同時具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理；雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機理；第四節(jié)第四節(jié) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和特點一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和特點二、細(xì)胞破碎率效果的檢驗二、細(xì)胞破碎率效果的檢驗三、細(xì)胞破碎的方法三、細(xì)胞破碎的方法四、選擇破碎方法的依據(jù)四、選擇破碎方法的依據(jù)五、破碎技術(shù)的發(fā)展方向五、破

21、碎技術(shù)的發(fā)展方向細(xì)胞破碎就是細(xì)胞破碎就是采用物理、化學(xué)、酶或機采用物理、化學(xué)、酶或機械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和械的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中。放到液相中。概念概念一、一、 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和特點u由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細(xì)菌和酵母菌的的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。細(xì)胞壁有所提高。 1.微生物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)微生物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)u細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的

22、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大；度越大；u酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；2.植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)u成熟的植物細(xì)胞壁分為初生壁和次生壁，次成熟的植物細(xì)胞壁分為初生壁和次生壁，次生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成時，生壁是在初生壁上增厚的部分，次生壁形成時，細(xì)胞不再增大。細(xì)胞不再增大。u初生壁與次生壁的主要化學(xué)成分均為纖維素。初生壁與次生壁的主要化學(xué)成分均為纖維素。纖維素分子又可進(jìn)一步組裝成微纖絲，微纖絲纖維素分子又可進(jìn)一

23、步組裝成微纖絲，微纖絲再交織成網(wǎng)狀，就構(gòu)成細(xì)胞壁的基本骨架。再交織成網(wǎng)狀，就構(gòu)成細(xì)胞壁的基本骨架。u在使用酶法和化學(xué)法溶解細(xì)胞時，細(xì)胞在使用酶法和化學(xué)法溶解細(xì)胞時，細(xì)胞壁的組成最重要，其次是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。壁的組成最重要，其次是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)。 3. 細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的破碎細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的破碎u在機械破碎中，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)在機械破碎中，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞壁的厚度和聚合物的交聯(lián)程度是影響破碎胞壁的厚度和聚合物的交聯(lián)程度是影響破碎難易程度的重要因素。細(xì)胞個體小、呈球形、難易程度的重要因素。細(xì)胞個體小、呈球形、壁厚、聚合交聯(lián)程度高則難破碎。壁厚、聚合交聯(lián)程度高則難破碎。二、細(xì)胞破碎效

24、果的檢查二、細(xì)胞破碎效果的檢查 破碎率定義破碎率定義:被破碎的細(xì)胞的數(shù)量占原被破碎的細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)，即始細(xì)胞數(shù)量的百分?jǐn)?shù)，即其中其中N0：原細(xì)胞數(shù)，：原細(xì)胞數(shù)，N：破碎后殘存：破碎后殘存的正常細(xì)胞。的正常細(xì)胞。N0和和N的可通過的可通過直接測直接測定法、目的產(chǎn)物測定法和測定導(dǎo)電率定法、目的產(chǎn)物測定法和測定導(dǎo)電率得到。得到。1.直接測定法直接測定法顯微鏡計數(shù)相對快速簡單，采用染色的方法把顯微鏡計數(shù)相對快速簡單，采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開來。方法：樣本適當(dāng)稀釋后，通過方法：樣本適當(dāng)稀釋后，通過平板計數(shù)技術(shù)平板計數(shù)技術(shù)或或在血球

25、計數(shù)板上用在血球計數(shù)板上用顯微鏡觀察顯微鏡觀察來實現(xiàn)染色細(xì)胞來實現(xiàn)染色細(xì)胞的技術(shù)。的技術(shù)。平板計數(shù)法計數(shù)時間長；只有活細(xì)胞才被計數(shù)，平板計數(shù)法計數(shù)時間長；只有活細(xì)胞才被計數(shù)，誤差大；細(xì)胞聚集時，不利計數(shù)。誤差大；細(xì)胞聚集時，不利計數(shù)。2. 目標(biāo)產(chǎn)物測定法目標(biāo)產(chǎn)物測定法Rm：理論最大值，：理論最大值，R：實驗測得值。：實驗測得值。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與或活性，并與100%100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值比較，計算其破碎率。較，

26、計算其破碎率。3. 測定導(dǎo)電率測定導(dǎo)電率細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線性增加。破碎率的增加而呈線性增加。導(dǎo)電率的大小取決于微生物的種類、處導(dǎo)電率的大小取決于微生物的種類、處理的條件、細(xì)胞的濃度、溫度和懸浮液理的條件、細(xì)胞的濃度、溫度和懸浮液中原電介質(zhì)的含量等，因此，正式測定中原電介質(zhì)的含量等，因此，正式測定前，應(yīng)預(yù)先用其它方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。前，應(yīng)預(yù)先用其它方法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。三、三、 細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞破碎的方法（按細(xì)胞所受作用）（按細(xì)胞所受作用）高壓勻漿法高壓勻漿法珠磨法

27、珠磨法超聲破碎法超聲破碎法滲透壓法滲透壓法反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法干燥法干燥法X-press法法1. 1.物理破碎物理破碎(1) 高壓勻漿法（高壓勻漿法（High-pressure homogenization）大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥之間細(xì)胞懸浮液在高壓的作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出，每秒速度高達(dá)幾百米，高的環(huán)隙高速噴出，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運動過程中經(jīng)歷了速運動過程中經(jīng)歷了剪切

28、、碰撞及由高壓到剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。，從而造成細(xì)胞破碎。原理：原理：進(jìn)進(jìn)口口出出口口不宜采用高壓勻漿法的微生物：不宜采用高壓勻漿法的微生物： n易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，n較小的革蘭氏陽性菌，較小的革蘭氏陽性菌，n含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損傷勻漿閥）易損傷勻漿閥）適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。適用于：微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模破碎。 進(jìn)入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小進(jìn)入珠磨機的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于珠、石英砂、氧化鋁

29、等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。一般采用夾套冷卻的方式帶走。(2) 珠磨法（珠磨法（Bead mill）工作原理：工作原理：臥臥式式n實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有實驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速高速組織搗碎機、組織搗碎機、

30、Braun勻漿器；勻漿器；n中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；n在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機（瑞士在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機（瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造）。公司和德國西門子機械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的困難。困難。影響細(xì)胞破碎的因素影響細(xì)胞破碎的因素nb.珠體的裝量珠體的裝量na.珠體的大小珠體的大小n

31、c.攪拌速度攪拌速度nd.操作溫度操作溫度ne.被處理細(xì)胞的特性被處理細(xì)胞的特性 實驗室規(guī)模，珠徑實驗室規(guī)模，珠徑0.2mm，工業(yè)規(guī)模珠徑大于工業(yè)規(guī)模珠徑大于0.4mm8090適當(dāng)適當(dāng)540珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80以下以下n其原理其原理可能與可能與空空穴穴現(xiàn)象現(xiàn)象引起的沖擊波和剪引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。切作用有關(guān)。3.超聲破碎法超聲破碎法（Ultrasonication）n超生波破碎細(xì)胞時的頻率一般為超生波破碎細(xì)胞時的頻率一般為1520 kHz，功率為，功率為100250W，可分為，可分為槽槽式和式和探頭直接插入介質(zhì)式探頭直接插入介質(zhì)式兩種型式。兩種型式。（3）

32、超聲波破碎法）超聲波破碎法n影響超生波破碎的因素主要有超聲波影響超生波破碎的因素主要有超聲波的聲強、頻率、破碎時間、介質(zhì)的離子的聲強、頻率、破碎時間、介質(zhì)的離子強度、強度、pH、菌體的濃度和種類。、菌體的濃度和種類。n一般桿菌比球菌易破碎，一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。細(xì)菌易破碎，對酵母菌的效果較差。超聲破碎時細(xì)胞濃度一般在超聲破碎時細(xì)胞濃度一般在20左右。左右。（3）超聲波破碎法）超聲波破碎法n超聲波破碎法在超聲波破碎法在實驗室和小規(guī)模生產(chǎn)實驗室和小規(guī)模生產(chǎn)中中應(yīng)用較廣。操作時常應(yīng)把懸浮液預(yù)先冷應(yīng)用較廣。操作時常應(yīng)把懸浮液預(yù)先冷卻到卻到05，并且還

33、應(yīng)在夾套中連續(xù)通，并且還應(yīng)在夾套中連續(xù)通入冷卻劑進(jìn)行入冷卻劑進(jìn)行冷卻冷卻。n另外，超聲波產(chǎn)生的另外，超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)化學(xué)自由基團(tuán)能使能使某些敏感性活性物質(zhì)某些敏感性活性物質(zhì)失活失活?？梢酝ㄟ^添?？梢酝ㄟ^添加自由基清洗劑如胱氨酸或谷胱甘肽，加自由基清洗劑如胱氨酸或谷胱甘肽，或用氫氣預(yù)吹細(xì)胞懸浮液來緩和?；蛴脷錃忸A(yù)吹細(xì)胞懸浮液來緩和。將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞于滲透壓的突然變化，水

34、迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。（4 4）滲透壓沖擊法）滲透壓沖擊法（Osmotic pressureOsmotic pressure）僅適用于僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺使細(xì)胞壁有缺陷，強度減弱。陷，強度減弱。 將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，冷凍，一方面

35、使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。（5 5）反復(fù)凍融法）反復(fù)凍融法適用于適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性?？赡芤鹉承┑鞍踪|(zhì)變性。 使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。易被抽提出來

36、。（6 6）干燥法）干燥法氣流干燥氣流干燥真空干燥真空干燥噴霧干燥噴霧干燥冷凍干燥冷凍干燥氣流干燥氣流干燥主要適用于酵母菌主要適用于酵母菌，一般在一般在2530的氣流中吹干；的氣流中吹干；真空干燥真空干燥多用于細(xì)菌多用于細(xì)菌；冷凍干燥冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì)適用于較不穩(wěn)定的物質(zhì)。 此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至此法是將濃縮的菌體懸浮液冷卻至- -25形成冰晶體，利用形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔擠出，由于擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔擠出，由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而破碎。形而破碎。（7 7）X

37、-pressX-press法法該法該法主要用于實驗室主要用于實驗室，具有具有使用范圍廣、使用范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高留率高等優(yōu)點等優(yōu)點。不適用于對冷凍敏感的物不適用于對冷凍敏感的物質(zhì)。質(zhì)。酶溶法酶溶法化學(xué)試劑化學(xué)試劑破碎法破碎法外加酶法外加酶法自溶法自溶法表面活性物質(zhì)表面活性物質(zhì)EDTA螯合劑螯合劑有機溶劑有機溶劑變性劑變性劑2.化學(xué)破碎化學(xué)破碎（Chemical permeation）（1）酶溶法）酶溶法（Enzymatic Lysis）外加酶法外加酶法常常用用的的溶溶酶酶G+ 溶菌酶、適量抑制劑溶菌酶、適量抑制劑G- 溶菌酶、溶

38、菌酶、EDTA放線菌放線菌 溶菌酶溶菌酶酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶霉菌霉菌 幾丁質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、植物植物 纖維素酶、半纖維素酶纖維素酶、半纖維素酶細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。量少，細(xì)胞外形完整。溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種溶酶價格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。需選擇不同的酶），產(chǎn)物抑制的存在。在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。 酶溶法的優(yōu)點：酶溶法的

39、優(yōu)點：酶溶法的缺點：酶溶法的缺點：u缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所缺點是：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。增大，過濾速度下降。 （2）自溶法（）自溶法（Autolysis）u誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法和干燥法。微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法和干燥法。u影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、影響自溶過程的主要因素有溫度、時間、pH值、緩沖液濃度和細(xì)胞代謝途徑等。值、緩

40、沖液濃度和細(xì)胞代謝途徑等。某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。有選擇地滲透出來。（2）化學(xué)試劑破碎法）化學(xué)試劑破碎法（Chemical permeation）該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。構(gòu)與組成。 用堿處理細(xì)胞，可以溶解除去細(xì)胞壁以外用堿處理細(xì)胞，可以溶解除去細(xì)胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解的大部分組

41、分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成游離的氨基酸。成游離的氨基酸。如如Triton X-100是一種非離子型清潔劑是一種非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。其他的表面活性劑，如其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、吐溫烷基磺酸鈉、吐溫等也可使細(xì)胞破碎。等也可使細(xì)胞破碎。表面活性劑表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。助于細(xì)胞的破碎。處理處理G-細(xì)菌

42、細(xì)菌，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。，對細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+或或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦持，一旦EDTA將將Ca2+或或Mg2+螯合，大螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。補，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強。EDTA螯合劑螯合劑能溶解細(xì)胞壁中的磷脂層，使細(xì)胞破壞。能溶解細(xì)胞壁中的磷脂層，使細(xì)胞破壞。有機溶劑有機溶劑變性劑變性劑鹽酸胍鹽酸胍（Gua

43、nidine hydrochloride）和和脲脲（Urea）是常用的變性劑。）是常用的變性劑。常用的有機溶劑常用的有機溶劑：丁酯、丁醇、甲苯、：丁酯、丁醇、甲苯、二甲苯、氯仿及高級醇等。二甲苯、氯仿及高級醇等。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。l通用性差；通用性差；l時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過過50%l有些化學(xué)試劑有毒有些化學(xué)試劑有毒 ?；瘜W(xué)法的優(yōu)點：化學(xué)法的優(yōu)點：缺點：缺點：l對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小對產(chǎn)

44、物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；l細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。固液分離和進(jìn)一步提取。細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法（按是否使用外加作用力）（按是否使用外加作用力）細(xì)胞破碎方法：細(xì)胞破碎方法：機械法機械法非機械法非機械法缺點：缺點：固液分離較困難。固液分離較困難。優(yōu)點：優(yōu)點：設(shè)備通用性強、破碎率高、操作設(shè)備通用性強、破碎率高、操作時間短、成本低、大多數(shù)方法適于大規(guī)時間短、成本低、大

45、多數(shù)方法適于大規(guī)模生產(chǎn)。模生產(chǎn)。缺點：缺點：破碎率低、耗時、成本高、一般破碎率低、耗時、成本高、一般適合小規(guī)模生產(chǎn)。適合小規(guī)模生產(chǎn)。優(yōu)點：優(yōu)點：固液分離容易。固液分離容易。選擇破碎方法時，需要考慮下列因素選擇破碎方法時，需要考慮下列因素：四、選擇破碎方法的依據(jù)四、選擇破碎方法的依據(jù)1. 處理量的大小處理量的大小2. 細(xì)胞壁細(xì)胞壁 的強度和結(jié)構(gòu)的強度和結(jié)構(gòu)3. 目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性4. 破碎后固液分離的難易程度破碎后固液分離的難易程度適宜的操作條件應(yīng)從適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗低的能耗和和便于后步提取便于后步提取這三方面權(quán)衡。這三方面

46、權(quán)衡。五、破碎技術(shù)的發(fā)展方向五、破碎技術(shù)的發(fā)展方向1. 多種破碎方法相結(jié)合多種破碎方法相結(jié)合2. 與上游技術(shù)相結(jié)合與上游技術(shù)相結(jié)合培養(yǎng)過程控制培養(yǎng)過程控制3. 與下游技術(shù)相結(jié)合與下游技術(shù)相結(jié)合寄主細(xì)胞的選擇寄主細(xì)胞的選擇包含體的組成包含體的組成耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)耐高溫產(chǎn)品的基因表達(dá)克隆噬菌體溶解基因克隆噬菌體溶解基因第五節(jié)第五節(jié) 離心技術(shù)離心技術(shù)離心分離離心分離n離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心力場中使不同密度度存在差異，在離心力場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。的固體顆粒加速沉降的分離過程。優(yōu)點：優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、

47、液分離速度快，分離效率高、液相澄清度好。相澄清度好。缺點：缺點：設(shè)備投資高、能耗大設(shè)備投資高、能耗大。一、離心分離的基本原理一、離心分離的基本原理n當(dāng)物體圍繞一中心軸做圓周運動時，運當(dāng)物體圍繞一中心軸做圓周運動時，運動物體就受到離心力的作用。旋轉(zhuǎn)的速動物體就受到離心力的作用。旋轉(zhuǎn)的速度越高，運動物體所受到的離心力越大。度越高，運動物體所受到的離心力越大。如果裝有懸浮液或高分子溶液的容器進(jìn)如果裝有懸浮液或高分子溶液的容器進(jìn)行高速水平旋轉(zhuǎn)，在相同轉(zhuǎn)速條件下，行高速水平旋轉(zhuǎn)，在相同轉(zhuǎn)速條件下，容器中不同大小的懸浮顆?；蚋叻肿尤苋萜髦胁煌笮〉膽腋☆w?；蚋叻肿尤苜|(zhì)會以不同的速率沉降。質(zhì)會以不同的速率沉

48、降。定義：顆粒在單位離心力場中移動的距離。定義：顆粒在單位離心力場中移動的距離。相對離心力相對離心力（Relative centrifugal force）（）（RCF）是指在離心場中作用是指在離心場中作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)。數(shù)。相對離心力：相對離心力： RCF =r2/g =2n2r/900g 1. 1.離心力與相對離心力離心力與相對離心力定義：顆粒在單位離心力場中粒子移定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時間表示的動的速度。沉降系數(shù)是以時間表示的。s =2.303(lgx2-lgx1) /2(t2-t1) 2. 2.沉降系數(shù)

49、沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s）定義：在離心力下，單位時間內(nèi)物質(zhì)定義：在離心力下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。運動的距離。3.3.沉降速度沉降速度4. 4.沉降時間沉降時間t2-t1 =lnr2/r1 /s2 定義：離心分類機轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的懸浮液或定義：離心分類機轉(zhuǎn)鼓內(nèi)的懸浮液或乳濁液在離心場中所受的離心力與其乳濁液在離心場中所受的離心力與其重力的比值，即離心加速度與重力加重力的比值，即離心加速度與重力加速度的比值。速度的比值。5. 5.分離因數(shù)分離因數(shù)Fr =R2/g=2Rn2/900g 分離分離時，要根據(jù)所分離物質(zhì)以及雜質(zhì)分離分離時，要根據(jù)所分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的大小

50、、密度和特性的不同選擇適當(dāng)?shù)碾x的大小、密度和特性的不同選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。心機、離心方法和離心條件。二、離心分離純化的分法二、離心分離純化的分法差速離心法差速離心法速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法等密度離心法等密度離心法（1）差速離心法）差速離心法n通過控制通過控制不同的離心力和離心時間不同的離心力和離心時間，使，使沉降速度不同的顆粒沉降速度不同的顆粒逐級分離的方法。逐級分離的方法。操作時選用懸浮液來進(jìn)行分離，先選擇操作時選用懸浮液來進(jìn)行分離，先選擇好離心力和離心時間，使懸浮液中最大好離心力和離心時間，使懸浮液中最大的顆粒先沉淀，取出上的顆粒先沉淀，取出上清清液，然后加大液，然后

51、加大離心力再進(jìn)行分離，沉淀出較小的顆粒，離心力再進(jìn)行分離，沉淀出較小的顆粒，如此多次分離，達(dá)到逐級分離的目的。如此多次分離，達(dá)到逐級分離的目的。（1）差速離心法）差速離心法n差速離心法的分辨率不高，沉降系數(shù)差速離心法的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不易分在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不易分開，常用于粗制品的提取，如細(xì)胞開，常用于粗制品的提取，如細(xì)胞勻勻漿中細(xì)胞器的分離。漿中細(xì)胞器的分離。（2）速率區(qū)帶離心法）速率區(qū)帶離心法n也稱一般密度梯度離心法，是在離心管中事也稱一般密度梯度離心法，是在離心管中事先加入某種低分子溶液先加入某種低分子溶液(蔗糖、甘油等蔗糖、甘油等)，調(diào)，調(diào)配好配好

52、密度梯度密度梯度，在密度梯度溶液得頂部加待，在密度梯度溶液得頂部加待處理得樣品，然后離心，使沉降系數(shù)比較接處理得樣品，然后離心，使沉降系數(shù)比較接近得物質(zhì)得以分離得一種區(qū)帶分離方法。近得物質(zhì)得以分離得一種區(qū)帶分離方法。n梯度介質(zhì)不與目的組分反應(yīng)，不引起分離組梯度介質(zhì)不與目的組分反應(yīng)，不引起分離組分得變性、失活。用于形成密度梯度介質(zhì)很分得變性、失活。用于形成密度梯度介質(zhì)很多，較常用得是蔗糖、甘油、硅膠等。多，較常用得是蔗糖、甘油、硅膠等。步驟：步驟： 1)在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐步增加（正密度從離心管頂部至底部逐步增加（正 梯度）

53、梯度） 2)將所需分離的樣品小心地加至密度梯度將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成 一負(fù)梯度。一負(fù)梯度。 3)由于不同大小的粒子在離心力作用下梯由于不同大小的粒子在離心力作用下梯度中移動的速度不一樣，所有經(jīng)過離心后，度中移動的速度不一樣，所有經(jīng)過離心后，會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。 速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法（3）等密度離心法）等密度離心法n是欲分離的物質(zhì)顆粒的密度范圍在離心是欲分離的物質(zhì)顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時，在離心力作介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時，在離心力作用下，不同密度的顆粒向上或向

54、下移動，用下，不同密度的顆粒向上或向下移動，直到顆粒的浮力密度與梯度密度相等，直到顆粒的浮力密度與梯度密度相等，形成區(qū)帶。形成區(qū)帶。n常用介質(zhì)一般為常用介質(zhì)一般為CsCl、KBr、NaI等，等，首先將待分離的樣品鋪成在梯度液頂上首先將待分離的樣品鋪成在梯度液頂上或與梯度液均勻混合，然后離心?；蚺c梯度液均勻混合，然后離心。n在分離開始前，樣品可與梯度介質(zhì)混合在分離開始前，樣品可與梯度介質(zhì)混合在一起，或鋪在密度梯度液上面。在離在一起，或鋪在密度梯度液上面。在離心力的作用下，梯度物質(zhì)在離心管中重心力的作用下，梯度物質(zhì)在離心管中重新分布，因而形成了所需要的濃度新分布，因而形成了所需要的濃度(和密和密度

55、度)梯度。同時，樣品顆粒，開始時就分梯度。同時，樣品顆粒，開始時就分布在整個管子中的，沉降或懸浮到它們布在整個管子中的，沉降或懸浮到它們的等密度位置上。的等密度位置上。步驟：步驟：等密度離心法等密度離心法區(qū)別：區(qū)別：1.懸浮液特性懸浮液特性包括懸浮液中固相顆粒的濃度以及固包括懸浮液中固相顆粒的濃度以及固相和液相的特性等。相和液相的特性等。 2. 乳濁液特性乳濁液特性3.固體顆粒特性固體顆粒特性三、影響離心效果的因素三、影響離心效果的因素液珠直徑大、濃度小、黏度小的乳濁液珠直徑大、濃度小、黏度小的乳濁液易于分離。液易于分離。 顆粒的大小、黏度分布、性質(zhì)、密度、顆粒的大小、黏度分布、性質(zhì)、密度、表

56、面性質(zhì)等。表面性質(zhì)等。 四、常用的離心分離設(shè)備四、常用的離心分離設(shè)備n離心沉降設(shè)備離心沉降設(shè)備根據(jù)其離心力大小根據(jù)其離心力大小，可分，可分為低速離心機、高速離心機和超離心機。為低速離心機、高速離心機和超離心機。按型式按型式可分為管式、碟片式等，按可分為管式、碟片式等，按作用作用原理不同原理不同可分為過濾式離心機和沉降式可分為過濾式離心機和沉降式離心機兩大類離心機兩大類。按出渣方式按出渣方式可分為人工可分為人工間歇出渣和自動出渣等方式。間歇出渣和自動出渣等方式。碟片式離心機工作原理碟片式離心機工作原理n當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高當(dāng)懸浮液在動壓頭的作用下，經(jīng)中心管流入高速旋轉(zhuǎn)的碟片之

57、間的間隙時，便產(chǎn)生了慣性離速旋轉(zhuǎn)的碟片之間的間隙時，便產(chǎn)生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運動，而后下向上層碟片的下表面運動，而后 在離心力作在離心力作用下被向外甩出沿碟片下表面向轉(zhuǎn)子外圍下滑，用下被向外甩出沿碟片下表面向轉(zhuǎn)子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動下沿而液體則由于密度小，在后續(xù)液體的推動下沿著碟片的隙道向轉(zhuǎn)子中心著碟片的隙道向轉(zhuǎn)子中心 流動然后沿中心軸上流動然后沿中心軸上升，從套管中排出，達(dá)到分離的目的。升，從套管中排出，達(dá)到分離的目的。n同理對于兩種密度不同或互不相溶的液體（如同理對于兩種密度不同或互不相溶的液體（如乳濁液）的分離，輕液在后續(xù)液體的推動下沿乳濁液）的分離，輕液在后續(xù)液體的推動下沿中心向上流動，重液中心向上流動，重液 在離心力作用下沿周圍向在離心力作用下沿周圍向下流動，從而得到分離。下流動，從而得到分離。 碟片