分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)核酸的凝膠電泳PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)核酸的凝膠電泳分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)核酸的凝膠電泳第1頁(yè)/共42頁(yè)第2頁(yè)/共42頁(yè)Home第3頁(yè)/共42頁(yè)第4頁(yè)/共42頁(yè)第5頁(yè)/共42頁(yè)第6頁(yè)/共42頁(yè)（二）（二）DNA的遷移速率決定因素的遷移速率決定因素第7頁(yè)/共42頁(yè)第8頁(yè)/共42頁(yè)第9頁(yè)/共42頁(yè)第10頁(yè)/共42頁(yè) 瓊脂糖類型瓊脂糖類型凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度/熔化溫度熔化溫度/ 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35389095不同廠家不同廠家生產(chǎn)的不生產(chǎn)的不同商品其同商品其凝結(jié)溫度凝結(jié)溫度和熔化溫和熔化溫度有一定度有一定差異差異40428590 高強(qiáng)度瓊脂糖高強(qiáng)度瓊脂糖34438595 修飾的低熔點(diǎn)修飾的低熔點(diǎn)/ 凝點(diǎn)瓊脂糖凝點(diǎn)瓊

2、脂糖253563653565 超低熔點(diǎn)超低熔點(diǎn)8154045 低黏性低熔點(diǎn)瓊低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖脂糖25307038853075第11頁(yè)/共42頁(yè)濃濃 度度（%）標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn)(kb)高強(qiáng)度高強(qiáng)度(kb)低熔點(diǎn)低熔點(diǎn)(kb)低黏度低低黏度低溶點(diǎn)溶點(diǎn)(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1第12頁(yè)/共42頁(yè) 7 7 電泳緩沖液電泳緩沖液 常用的有常用的有TAETAE、TPETPE及及TBET

3、BE第13頁(yè)/共42頁(yè) 都是常用電泳緩沖液。三者相比：都是常用電泳緩沖液。三者相比：1 1）TAETAE的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗，此時(shí)凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化；凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3 3）雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中遷移快中遷移快10%10%；4 4）對(duì)于高分子質(zhì)量的對(duì)于高分子質(zhì)量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或

4、TPETPE，對(duì)于低分子質(zhì)量的，對(duì)于低分子質(zhì)量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的電泳分辨率要好于中的電泳分辨率要好于TBETBE。 第14頁(yè)/共42頁(yè)載樣緩沖液：載樣緩沖液：臨上樣到臨上樣到凝膠加樣孔凝膠加樣孔之前與待之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個(gè)作用：載樣緩沖液有三個(gè)作用：1 1）增加樣品密度保證）增加樣品密度保證DNADNA沉入加樣孔內(nèi)；沉入加樣孔內(nèi)；2 2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程；）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程；3 3）其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)）其中的染料在電場(chǎng)

5、中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。速率向陽(yáng)極遷移。第15頁(yè)/共42頁(yè)類型類型6 緩沖液緩沖液貯存溫度貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)室溫室溫0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液第16頁(yè)/共42頁(yè) 通過(guò)染色通過(guò)染色, 紫外燈下檢測(cè)。紫外燈下檢測(cè)。 主要有溴化乙錠（主要有溴化乙錠（ethidium bromid

6、e, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。第17頁(yè)/共42頁(yè)第18頁(yè)/共42頁(yè)第19頁(yè)/共42頁(yè)第20頁(yè)/共42頁(yè)第21頁(yè)/共42頁(yè)第22頁(yè)/共42頁(yè)第23頁(yè)/共42頁(yè)第24頁(yè)/共42頁(yè) 可以用透射或入射紫外光對(duì)可以用透射或入射紫外光對(duì)EBEB染色的凝膠染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。成像，圖像可以直接輸出到計(jì)算機(jī)觀察。第25頁(yè)/共42頁(yè)現(xiàn)一般采用試劑盒回收：現(xiàn)一般采用試劑盒回收： 存在的主要問(wèn)題：存在的主要問(wèn)題：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA Home第26頁(yè)/共42頁(yè)

7、第27頁(yè)/共42頁(yè)第28頁(yè)/共42頁(yè)酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)第29頁(yè)/共42頁(yè)第30頁(yè)/共42頁(yè)第31頁(yè)/共42頁(yè)第32頁(yè)/共42頁(yè)丙烯酰胺濃度丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/301/30; ; Home第33頁(yè)/共42頁(yè)第34頁(yè)/共42頁(yè)第35頁(yè)/共42頁(yè)第36頁(yè)/共42頁(yè)B+A-+A-B脈沖電場(chǎng)電泳示意圖脈沖電場(chǎng)電泳示意圖第37頁(yè)/共42頁(yè)第38頁(yè)