細胞生物學(xué)教程

1、Information StoringThe revised central dogmaAccumulating mutationsReplication“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“l(fā)ight” DNA “Hybrid” DNAOri(a) 枯草桿菌Ori(c) ColE 1Ori(b) R6K 質(zhì)粒原核生物中特殊的復(fù)制類型原核生物中特殊的復(fù)制類型復(fù)制方式復(fù)制方式 Replication modesReplication eyes replication型復(fù)制Rolling circle replication滾環(huán)復(fù)制D-loop replicationD環(huán)復(fù)制Replic

2、ation eyesfor circular dsDNA原核生物的染色體和質(zhì)粒，真核生物的細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子Replication fork is the point atwhich strands of parental duplexDNA are separated so thatreplication can proceedRolling circle replication1968年年Gilbert提出滾環(huán)復(fù)制模型提出滾環(huán)復(fù)制模型:（1）共價延伸；共價延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈分開）模板鏈和新合成的鏈分開;（3）不需）不需RNA引物，在正鏈引物，在正鏈3OH上延上延長長（

3、4）只有一個復(fù)制叉只有一個復(fù)制叉（5）形成多聯(lián)體（）形成多聯(lián)體（concatemer ）Rolling-Circle Replication滾環(huán)復(fù)制的電鏡照片滾環(huán)復(fù)制的電鏡照片A rolling circle appears as a circular moleculewith a linear tail by electron microscopy.哪些哪些DNA進行滾環(huán)復(fù)制進行滾環(huán)復(fù)制?噬菌體 X174 DNA噬菌體復(fù)制后期非洲爪蟾卵母細胞中rRNA基因的擴增F因子DNA的轉(zhuǎn)移D-loop replicationDNA兩條鏈的復(fù)制起點不在同一位置兩條鏈的復(fù)制起點不在同一位置DNA兩條鏈的復(fù)

4、制是高度不對稱的，一條鏈兩條鏈的復(fù)制是高度不對稱的，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代The D loop maintains anopening in mammalianmitochondrial DNA,which has separateorigins for the replicationof each strand.哪些哪些DNA進行進行D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制?線粒體線粒體DNA葉綠體葉綠體DNA由于由于DNA的兩的兩條互補鏈方向相反，為使滯后鏈能條互補鏈方向相反，為使滯后鏈能與前導(dǎo)鏈被同一個與前導(dǎo)鏈被同一個DNA聚合酶聚合酶的不對稱二聚體的不對稱二聚體

5、所聚合，滯后鏈繞成了一個所聚合，滯后鏈繞成了一個突型環(huán)構(gòu)象突型環(huán)構(gòu)象。拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶：使使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓撲異構(gòu)酶拓撲異構(gòu)酶：該酶能暫時性地切斷和重新該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復(fù)制有關(guān)。分子。同復(fù)制有關(guān)。UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion第三節(jié)第三節(jié) 原核生物原核生物DNA復(fù)制復(fù)制 (DNA replication in Pr

6、okaryote) （1） OriC in E. coli chromosomal DNA 1、大腸桿菌的大腸桿菌的DNA復(fù)制復(fù)制 四個四個9bp的重復(fù)序列的重復(fù)序列 dnaA結(jié)合位點結(jié)合位點 三個三個13bp的重復(fù)序列的重復(fù)序列若干若干GATC位點位點復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點：復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)特點：富含富含AT，這可能，這可能和雙鏈易于解開起始復(fù)制和雙鏈易于解開起始復(fù)制有關(guān)；有關(guān)；含有多個回文結(jié)構(gòu)（含有多個回文結(jié)構(gòu)（9 14 個個GATC ），），8 個個GATC較保守較保守具有具有 4個反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點；個反向重復(fù)順序，作為蛋白結(jié)合位點；復(fù)制起點具有 3 個 13bp 和 4 個

7、 9bp 的重復(fù)順序GATCTNTTNTTTT TTATNCANADnaA 單體結(jié)合在 9bp 的重復(fù)順序上13bp 9bp2040 個 DnaA 單體形成一個大的復(fù)合物在 13bp 重復(fù)順序上 DNA 解鏈DnaB/DnaC 結(jié)合成復(fù)合體，產(chǎn)生了復(fù)制叉DnaBDnaBDnaC圖 11-28 前引發(fā)涉及到系列蛋白的連續(xù)裝配并導(dǎo)致 DNA 的解鏈表 11-4 在 OriC 上前引發(fā)所需的六種蛋白蛋白 功能對蛋白質(zhì)的要求DnaA 結(jié)合于 9bp 重復(fù)順序20-40 單體DnaB 提供解旋酶1-2 六聚體DnaC 和 DnaB 形成復(fù)合體六個單體HU組蛋白樣蛋白，激發(fā)復(fù)合體形成5 個雙體Gyrase

8、 旋轉(zhuǎn)酶，解除正超螺旋，引入負超螺旋催化ssB 穩(wěn)定單鏈化學(xué)劑量，四聚體活性復(fù)制起始1、拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。2、Dna A蛋白識別并在ATP存在下結(jié)合于四個9bp的重復(fù)序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參與下,Dan A蛋白變性13個bp的重復(fù)序列,形成開鏈復(fù)合物。4 、Dna B借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在Dna C的幫助下沿5 3方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5、單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6、引物合成酶（Dna G蛋白）開始合成RNA引物。鏈的延長（岡崎片段的合成）真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp3后滯鏈5引發(fā)酶合成引物5

9、3 5 3RNA 引物RNA 引物3后滯鏈5 DNA pol 在引5岡崎片斷3 物 3OH 延伸，形成岡崎片斷3后滯鏈553 DNA pol切除引物，填補缺口后滯鏈553連接酶封閉缺口連接酶圖 11-53 后滯鏈的合成RNA primingThe first few nucleotides atthe 5-end of Okazakifragments areribonucleotides. Hence,DNA synthesis is primedby RNA that is thenremoved before fragmentsare joined.E.coli的復(fù)制終止的復(fù)制終止終止區(qū)

10、域含有兩對反向重復(fù)順序（終止區(qū)域含有兩對反向重復(fù)順序（terE,D,A和和terC,B），位于相遇點的另一側(cè)），位于相遇點的另一側(cè)100Kb處。每一終止處。每一終止順序?qū)δ骋环较蛞苿拥膹?fù)順序?qū)δ骋环较蛞苿拥膹?fù)制叉來說是特異的。制叉來說是特異的。ter順序有一個順序有一個23bp的區(qū)域，在體外可導(dǎo)致復(fù)制的的區(qū)域，在體外可導(dǎo)致復(fù)制的終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止需要終止需要tus(terminus utilization substance)基因的基因的產(chǎn)物產(chǎn)物Tus(36kD) ，Tus 能識別能識別ter 保守順序，保守順序，具有抗具有抗解鏈活性解鏈活

11、性，阻止，阻止DnaB解鏈，使復(fù)制叉停止前進。解鏈，使復(fù)制叉停止前進。ter-Tus復(fù)合物可能通過抑制復(fù)合物可能通過抑制解旋酶解旋酶來實行終止。來實行終止。Tus蛋白與ter非對稱地結(jié)合，并只在單向阻止復(fù)制Ter在在DNA上排列以創(chuàng)造出一種上排列以創(chuàng)造出一種“陷阱陷阱”,阻止阻止復(fù)制叉的移動。復(fù)制叉的移動。當(dāng)任意一個復(fù)制叉碰到一個功能性當(dāng)任意一個復(fù)制叉碰到一個功能性ter-Tus復(fù)合物時，就停止。而另一個復(fù)制叉碰到第復(fù)合物時，就停止。而另一個復(fù)制叉碰到第一個被阻止的復(fù)制叉時也停止前進。一個被阻止的復(fù)制叉時也停止前進。位于終止區(qū)內(nèi)尚未復(fù)制的序列（位于終止區(qū)內(nèi)尚未復(fù)制的序列（50-100 bp）以

12、修復(fù)合成的方式被填補。以修復(fù)合成的方式被填補。復(fù)制完成的復(fù)制完成的2個子代個子代DNA分子以連環(huán)體的形分子以連環(huán)體的形式鎖在一起，去連環(huán)化需要拓撲異構(gòu)酶式鎖在一起，去連環(huán)化需要拓撲異構(gòu)酶。復(fù)制的終止順時針終止陷阱逆時針終止陷阱大腸桿菌DNA復(fù)制的終止拓撲異構(gòu)酶催化復(fù)制產(chǎn)物的解環(huán)23bp52bp 23bp61bp5 基因 11.1A1.1BA-T 豐富區(qū)基因 1.1 3TTATGCTGAGTGATATCTTATGCTGAGTGATATRnase 酶切位點圖 11-40 T7 噬菌體復(fù)制起始區(qū)的結(jié)構(gòu)T7噬菌體（雙鏈線狀雙鏈線狀DNA）的復(fù)制起始184 bp表 11-8 T7 DNA 合成所需的酶和

13、蛋白酶基因結(jié)構(gòu)和功能RNA pol198.1KDa 單鏈，可能合成引物DNA pol584KDa，ssDNA35外切活性，有的聚合酶活性，組成 DNA po 亞基trxA宿主基因合成 12KDa，硫氧還蛋白(thioredoxin)，pol 亞基解旋酶458KDa 的產(chǎn)物三磷酸酯酶458KDa 的產(chǎn)物引發(fā)酶466KDa 的產(chǎn)物，識別 5GGGTC3或 5TGGTC3SSB2.5單鏈結(jié)合蛋白內(nèi)切酶3降解宿主 DNA 用于合成5外切酶6同上連接酶1.3封閉缺口?二聚體二聚體3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬噬菌菌體體的的末末端端復(fù)復(fù)制制專一性核專一性核酸內(nèi)切酶酸內(nèi)切酶線狀線狀D

14、NA的末的末端復(fù)制問題端復(fù)制問題T7線狀線狀DNA復(fù)制終止復(fù)制終止的串聯(lián)體模型的串聯(lián)體模型IRIR長的發(fā)長的發(fā)夾結(jié)構(gòu)夾結(jié)構(gòu) 腺病毒腺病毒 DNA 復(fù)制起始復(fù)制起始G第四節(jié)第四節(jié) 真核生物真核生物DNA的復(fù)制的復(fù)制(DNA replication in Eukaryote) 1、 復(fù)制概況復(fù)制概況 a、多個復(fù)制元（、多個復(fù)制元（multiple replicon ），雙向復(fù)制），雙向復(fù)制 b、復(fù)制元相對較小、復(fù)制元相對較小(13-900kb), 復(fù)制速度較慢復(fù)制速度較慢,大大 約約 5005000bp/min （3000bp/min） 岡崎片段岡崎片段100200NTc、復(fù)制終止通過復(fù)制、復(fù)制終

15、止通過復(fù)制 叉的相遇而終止叉的相遇而終止 multiple replicon 例；果蠅例；果蠅 3500 replicons 平均平均 40Kb 酵母酵母 500 replicons 哺乳動物哺乳動物 平均平均100Kb 2、 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 、五種五種 位置位置 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 核內(nèi)核內(nèi) 線粒體線粒體 合成合成 與與引發(fā)引發(fā) 修復(fù)修復(fù) 合成合成 合成合成,修復(fù)修復(fù) 復(fù)制復(fù)制功能功能 酶酶結(jié)合結(jié)合 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈 后隨鏈后隨鏈35校校 NO NO Yes Yes Yes正活性正活性 4、 真核生物的復(fù)真核生物的復(fù)制起始受制起始受許可因子許可因子的控制的控制

16、5、 真核生物染色體真核生物染色體 DNA末端補齊模式末端補齊模式 (1) 端粒端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端序列高度重復(fù)的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (富含富含 G 鏈鏈) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (富含富含 C 鏈鏈) （2） 端粒酶（端粒酶（ Telomerase）1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling 四膜蟲四膜蟲 端粒酶端粒酶 （ telomerase ）將將T2G4 末端重復(fù)延伸末端重復(fù)延伸 游撲蟲游撲蟲 Telome

17、rase = RNA CAAAACCCC 鏈鏈 + 末端結(jié)合蛋白末端結(jié)合蛋白 （TBP） 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶a、核蛋白（、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含約長、含約長150NT的的RNA，其中含，其中含 15 拷貝的拷貝的CxAy重復(fù)序列，重復(fù)序列， 是合成端粒是合成端粒T2G4的模板的模板c、延長的、延長的3-T2G4端端（一段（一段cDNA）作為）作為5-端端DNA合成的模板合成的模板（3） 補齊過程補齊過程 通過通過TG鏈的回折形成鏈的回折形成 發(fā)夾結(jié)構(gòu)（發(fā)夾結(jié)構(gòu)（GG氫鍵）氫鍵） 尺蠖模型尺蠖模型 實現(xiàn)端粒酶位置的實現(xiàn)端粒酶位置的 調(diào)整調(diào)整 G G

18、 hoogsteen 氫鍵氫鍵 三螺旋三螺旋DNA G鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈鏈-A2C4- G鏈鏈 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC鏈鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorG鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈鏈-A2C4- 實驗表明人體細胞通過監(jiān)測失去的端粒的重復(fù)數(shù)實驗表明人體細胞通過監(jiān)測失去的端粒的重復(fù)數(shù)而計數(shù)細胞分裂次數(shù)，當(dāng)端粒長度下降到而

19、計數(shù)細胞分裂次數(shù)，當(dāng)端粒長度下降到某一臨界值某一臨界值時，細胞終止分裂衰老、死亡時，細胞終止分裂衰老、死亡“多莉多莉”的衰老的衰老 研究端粒丟失的速率，預(yù)測人類的壽命研究端粒丟失的速率，預(yù)測人類的壽命 XX XY why?研究推測端粒酶與腫瘤的關(guān)系研究推測端粒酶與腫瘤的關(guān)系 6、 真核生物復(fù)制過程中的核小體結(jié)構(gòu)真核生物復(fù)制過程中的核小體結(jié)構(gòu) （1） 組蛋白的合成在細胞核中與組蛋白的合成在細胞核中與DNA復(fù)制同步進行復(fù)制同步進行 （2） 且組蛋白八聚體在且組蛋白八聚體在DNA復(fù)制時并不離開親本復(fù)制時并不離開親本 DNA鏈鏈 蛋白質(zhì)合成抑制劑實驗蛋白質(zhì)合成抑制劑實驗 所證實所證實 放線菌酮放線菌酮

20、cycloheximide （3） 組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代 （4） 組蛋白八聚體與先導(dǎo)鏈結(jié)合組蛋白八聚體與先導(dǎo)鏈結(jié)合新老八聚體在子代鏈上的分布新老八聚體在子代鏈上的分布復(fù)制原點復(fù)制原點老老新新先導(dǎo)鏈先導(dǎo)鏈后隨鏈后隨鏈a、復(fù)制子的大?。ā?fù)制子的大?。⊿izes of replicon）:Yeast or fly平均平均 40 kbMammals 平均平均 100 kbProkaryotic DNA: 1000 kbb、岡崎片段、岡崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 ntEukaryotic

21、DNA:100-200 ntc、復(fù)制速度（、復(fù)制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:ca. 3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較 1. Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. 校正閱讀（校正閱讀（Proofreading）1. 復(fù)制起點（單、多）2. 復(fù)

22、制子（大小、多少）3. 復(fù)制起始的許可因子的控制 （復(fù)制周期的重疊與否）4. 復(fù)制叉移動的速度 (900/50 nt/S)5. 岡崎片段的大小6. 端粒和端粒酶7. DNA聚合酶Polymerases相同點：不同點：本章結(jié)束，本章結(jié)束， 謝謝！謝謝！名詞解釋復(fù)制 復(fù)制體 半保留復(fù)制 崗崎片段 復(fù)制單位 復(fù)制 先導(dǎo)鏈 后隨鏈 DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性簡答題1、圖示說明DNA半保留復(fù)制的機制證明。2、DNA復(fù)制方向為53，請說明復(fù)制為什么不能從35。3、為什么崗崎證明DNA半不連續(xù)性復(fù)制的實驗中出現(xiàn)兩條鏈都是 不連續(xù)的假象。4、DNA復(fù)制為何選擇RNA作為引物？5、復(fù)制叉誕生的

23、過程如何，后隨鏈上都包含哪些事件（涉及的酶 的情況）6、E.coli的DNA復(fù)制終止機制7、原核生物線性DNA復(fù)制5末端短縮的解決辦法有哪幾種。8、真核生物端粒末端及端粒酶在DNA末端復(fù)制過程中的作用 機制9、真核生物DNA復(fù)制過程中核小體復(fù)制和保留機制。10、保證復(fù)制忠實性的主要機制11、真核與原核復(fù)制起始調(diào)控的差別12、真核與原核復(fù)制的比較內(nèi)容回顧內(nèi)容回顧1：1、基本概念、基本概念 DNA復(fù)制復(fù)制 復(fù)制子復(fù)制子 復(fù)制體復(fù)制體 復(fù)制時期復(fù)制時期2、半保留復(fù)制、半保留復(fù)制 3、復(fù)制起點、復(fù)制起點 結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)特征 復(fù)制方向：復(fù)制叉復(fù)制方向：復(fù)制叉 復(fù)制眼復(fù)制眼 單雙向復(fù)制的決定條件單雙向復(fù)制的決定條件 復(fù)制的多模式復(fù)制的多模式 復(fù)制方式：復(fù)制叉式（從頭起始）復(fù)制方式：復(fù)制叉式（從頭起始） D環(huán)復(fù)制（置換式）環(huán)復(fù)制（置換式） 復(fù)制（滾環(huán)復(fù)制）復(fù)制（滾環(huán)復(fù)制）4、復(fù)制酶學(xué)、復(fù)制酶學(xué) 三種三種DNApol DNApol 內(nèi)容回顧內(nèi)容回顧 2：1、DNApol和和的主要活性和功能的主要活性和功能 聚合活性聚合活性 外切活性（兩種）外切活性（兩種） 延伸方向延伸方向2、DNA連接酶連接酶3、和、和DN