細胞生物學教程

1、Information StoringThe revised central dogmaAccumulating mutationsReplication“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“l(fā)ight” DNA “Hybrid” DNAOri(a) 枯草桿菌Ori(c) ColE 1Ori(b) R6K 質粒原核生物中特殊的復制類型原核生物中特殊的復制類型復制方式復制方式 Replication modesReplication eyes replication型復制Rolling circle replication滾環(huán)復制D-loop replicationD環(huán)復制Replic

2、ation eyesfor circular dsDNA原核生物的染色體和質粒，真核生物的細胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子Replication fork is the point atwhich strands of parental duplexDNA are separated so thatreplication can proceedRolling circle replication1968年年Gilbert提出滾環(huán)復制模型提出滾環(huán)復制模型:（1）共價延伸；共價延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈分開）模板鏈和新合成的鏈分開;（3）不需）不需RNA引物，在正鏈引物，在正鏈3OH上延上延長長（

3、4）只有一個復制叉只有一個復制叉（5）形成多聯(lián)體（）形成多聯(lián)體（concatemer ）Rolling-Circle Replication滾環(huán)復制的電鏡照片滾環(huán)復制的電鏡照片A rolling circle appears as a circular moleculewith a linear tail by electron microscopy.哪些哪些DNA進行滾環(huán)復制進行滾環(huán)復制?噬菌體 X174 DNA噬菌體復制后期非洲爪蟾卵母細胞中rRNA基因的擴增F因子DNA的轉移D-loop replicationDNA兩條鏈的復制起點不在同一位置兩條鏈的復制起點不在同一位置DNA兩條鏈的復

4、制是高度不對稱的，一條鏈兩條鏈的復制是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代The D loop maintains anopening in mammalianmitochondrial DNA,which has separateorigins for the replicationof each strand.哪些哪些DNA進行進行D-環(huán)復制環(huán)復制?線粒體線粒體DNA葉綠體葉綠體DNA由于由于DNA的兩的兩條互補鏈方向相反，為使滯后鏈能條互補鏈方向相反，為使滯后鏈能與前導鏈被同一個與前導鏈被同一個DNA聚合酶聚合酶的不對稱二聚體的不對稱二聚體

5、所聚合，滯后鏈繞成了一個所聚合，滯后鏈繞成了一個突型環(huán)構象突型環(huán)構象。拓撲異構酶拓撲異構酶：使使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活連接，作用是松解負超螺旋。主要集中在活性轉錄區(qū)，同轉錄有關。性轉錄區(qū)，同轉錄有關。拓撲異構酶拓撲異構酶：該酶能暫時性地切斷和重新該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入，作用是將負超螺旋引入DNA分子。同復制有關。分子。同復制有關。UnwoundParentalDuplexOver-Woundregion第三節(jié)第三節(jié) 原核生物原核生物DNA復制復制 (DNA replication in Pr

6、okaryote) （1） OriC in E. coli chromosomal DNA 1、大腸桿菌的大腸桿菌的DNA復制復制 四個四個9bp的重復序列的重復序列 dnaA結合位點結合位點 三個三個13bp的重復序列的重復序列若干若干GATC位點位點復制起始區(qū)的結構特點：復制起始區(qū)的結構特點：富含富含AT，這可能，這可能和雙鏈易于解開起始復制和雙鏈易于解開起始復制有關；有關；含有多個回文結構（含有多個回文結構（9 14 個個GATC ），），8 個個GATC較保守較保守具有具有 4個反向重復順序，作為蛋白結合位點；個反向重復順序，作為蛋白結合位點；復制起點具有 3 個 13bp 和 4 個

7、 9bp 的重復順序GATCTNTTNTTTT TTATNCANADnaA 單體結合在 9bp 的重復順序上13bp 9bp2040 個 DnaA 單體形成一個大的復合物在 13bp 重復順序上 DNA 解鏈DnaB/DnaC 結合成復合體，產生了復制叉DnaBDnaBDnaC圖 11-28 前引發(fā)涉及到系列蛋白的連續(xù)裝配并導致 DNA 的解鏈表 11-4 在 OriC 上前引發(fā)所需的六種蛋白蛋白 功能對蛋白質的要求DnaA 結合于 9bp 重復順序20-40 單體DnaB 提供解旋酶1-2 六聚體DnaC 和 DnaB 形成復合體六個單體HU組蛋白樣蛋白，激發(fā)復合體形成5 個雙體Gyrase

8、 旋轉酶，解除正超螺旋，引入負超螺旋催化ssB 穩(wěn)定單鏈化學劑量，四聚體活性復制起始1、拓撲異構酶解開超螺旋。2、Dna A蛋白識別并在ATP存在下結合于四個9bp的重復序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參與下,Dan A蛋白變性13個bp的重復序列,形成開鏈復合物。4 、Dna B借助于水解ATP產生的能量在Dna C的幫助下沿5 3方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復合物。5、單鏈結合蛋白結合于單鏈。6、引物合成酶（Dna G蛋白）開始合成RNA引物。鏈的延長（岡崎片段的合成）真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp3后滯鏈5引發(fā)酶合成引物5

9、3 5 3RNA 引物RNA 引物3后滯鏈5 DNA pol 在引5岡崎片斷3 物 3OH 延伸，形成岡崎片斷3后滯鏈553 DNA pol切除引物，填補缺口后滯鏈553連接酶封閉缺口連接酶圖 11-53 后滯鏈的合成RNA primingThe first few nucleotides atthe 5-end of Okazakifragments areribonucleotides. Hence,DNA synthesis is primedby RNA that is thenremoved before fragmentsare joined.E.coli的復制終止的復制終止終止區(qū)

10、域含有兩對反向重復順序（終止區(qū)域含有兩對反向重復順序（terE,D,A和和terC,B），位于相遇點的另一側），位于相遇點的另一側100Kb處。每一終止處。每一終止順序對某一方向移動的復順序對某一方向移動的復制叉來說是特異的。制叉來說是特異的。ter順序有一個順序有一個23bp的區(qū)域，在體外可導致復制的的區(qū)域，在體外可導致復制的終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止需要終止需要tus(terminus utilization substance)基因的基因的產物產物Tus(36kD) ，Tus 能識別能識別ter 保守順序，保守順序，具有抗具有抗解鏈活性解鏈活

11、性，阻止，阻止DnaB解鏈，使復制叉停止前進。解鏈，使復制叉停止前進。ter-Tus復合物可能通過抑制復合物可能通過抑制解旋酶解旋酶來實行終止。來實行終止。Tus蛋白與ter非對稱地結合，并只在單向阻止復制Ter在在DNA上排列以創(chuàng)造出一種上排列以創(chuàng)造出一種“陷阱陷阱”,阻止阻止復制叉的移動。復制叉的移動。當任意一個復制叉碰到一個功能性當任意一個復制叉碰到一個功能性ter-Tus復合物時，就停止。而另一個復制叉碰到第復合物時，就停止。而另一個復制叉碰到第一個被阻止的復制叉時也停止前進。一個被阻止的復制叉時也停止前進。位于終止區(qū)內尚未復制的序列（位于終止區(qū)內尚未復制的序列（50-100 bp）以

12、修復合成的方式被填補。以修復合成的方式被填補。復制完成的復制完成的2個子代個子代DNA分子以連環(huán)體的形分子以連環(huán)體的形式鎖在一起，去連環(huán)化需要拓撲異構酶式鎖在一起，去連環(huán)化需要拓撲異構酶。復制的終止順時針終止陷阱逆時針終止陷阱大腸桿菌DNA復制的終止拓撲異構酶催化復制產物的解環(huán)23bp52bp 23bp61bp5 基因 11.1A1.1BA-T 豐富區(qū)基因 1.1 3TTATGCTGAGTGATATCTTATGCTGAGTGATATRnase 酶切位點圖 11-40 T7 噬菌體復制起始區(qū)的結構T7噬菌體（雙鏈線狀雙鏈線狀DNA）的復制起始184 bp表 11-8 T7 DNA 合成所需的酶和

13、蛋白酶基因結構和功能RNA pol198.1KDa 單鏈，可能合成引物DNA pol584KDa，ssDNA35外切活性，有的聚合酶活性，組成 DNA po 亞基trxA宿主基因合成 12KDa，硫氧還蛋白(thioredoxin)，pol 亞基解旋酶458KDa 的產物三磷酸酯酶458KDa 的產物引發(fā)酶466KDa 的產物，識別 5GGGTC3或 5TGGTC3SSB2.5單鏈結合蛋白內切酶3降解宿主 DNA 用于合成5外切酶6同上連接酶1.3封閉缺口?二聚體二聚體3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OHT7噬噬菌菌體體的的末末端端復復制制專一性核專一性核酸內切酶酸內切酶線狀線狀D

14、NA的末的末端復制問題端復制問題T7線狀線狀DNA復制終止復制終止的串聯(lián)體模型的串聯(lián)體模型IRIR長的發(fā)長的發(fā)夾結構夾結構 腺病毒腺病毒 DNA 復制起始復制起始G第四節(jié)第四節(jié) 真核生物真核生物DNA的復制的復制(DNA replication in Eukaryote) 1、 復制概況復制概況 a、多個復制元（、多個復制元（multiple replicon ），雙向復制），雙向復制 b、復制元相對較小、復制元相對較小(13-900kb), 復制速度較慢復制速度較慢,大大 約約 5005000bp/min （3000bp/min） 岡崎片段岡崎片段100200NTc、復制終止通過復制、復制終

15、止通過復制 叉的相遇而終止叉的相遇而終止 multiple replicon 例；果蠅例；果蠅 3500 replicons 平均平均 40Kb 酵母酵母 500 replicons 哺乳動物哺乳動物 平均平均100Kb 2、 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 、五種五種 位置位置 核內核內 核內核內 核內核內 核內核內 線粒體線粒體 合成合成 與與引發(fā)引發(fā) 修復修復 合成合成 合成合成,修復修復 復制復制功能功能 酶酶結合結合 前導鏈前導鏈 后隨鏈后隨鏈35校校 NO NO Yes Yes Yes正活性正活性 4、 真核生物的復真核生物的復制起始受制起始受許可因子許可因子的控制的控制

16、5、 真核生物染色體真核生物染色體 DNA末端補齊模式末端補齊模式 (1) 端粒端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重復的末端序列高度重復的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (富含富含 G 鏈鏈) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (富含富含 C 鏈鏈) （2） 端粒酶（端粒酶（ Telomerase）1985. Carol Greider & Blackburn, 1986. Gottchling 四膜蟲四膜蟲 端粒酶端粒酶 （ telomerase ）將將T2G4 末端重復延伸末端重復延伸 游撲蟲游撲蟲 Telome

17、rase = RNA CAAAACCCC 鏈鏈 + 末端結合蛋白末端結合蛋白 （TBP） 端粒酶逆轉錄酶端粒酶逆轉錄酶a、核蛋白（、核蛋白（ ribonucleoprotein RNP）b、含約長、含約長150NT的的RNA，其中含，其中含 15 拷貝的拷貝的CxAy重復序列，重復序列， 是合成端粒是合成端粒T2G4的模板的模板c、延長的、延長的3-T2G4端端（一段（一段cDNA）作為）作為5-端端DNA合成的模板合成的模板（3） 補齊過程補齊過程 通過通過TG鏈的回折形成鏈的回折形成 發(fā)夾結構（發(fā)夾結構（GG氫鍵）氫鍵） 尺蠖模型尺蠖模型 實現(xiàn)端粒酶位置的實現(xiàn)端粒酶位置的 調整調整 G G

18、 hoogsteen 氫鍵氫鍵 三螺旋三螺旋DNA G鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈鏈-A2C4- G鏈鏈 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC鏈鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNA polorG鏈鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈鏈-A2C4- 實驗表明人體細胞通過監(jiān)測失去的端粒的重復數(shù)實驗表明人體細胞通過監(jiān)測失去的端粒的重復數(shù)而計數(shù)細胞分裂次數(shù)，當端粒長度下降到而

19、計數(shù)細胞分裂次數(shù)，當端粒長度下降到某一臨界值某一臨界值時，細胞終止分裂衰老、死亡時，細胞終止分裂衰老、死亡“多莉多莉”的衰老的衰老 研究端粒丟失的速率，預測人類的壽命研究端粒丟失的速率，預測人類的壽命 XX XY why?研究推測端粒酶與腫瘤的關系研究推測端粒酶與腫瘤的關系 6、 真核生物復制過程中的核小體結構真核生物復制過程中的核小體結構 （1） 組蛋白的合成在細胞核中與組蛋白的合成在細胞核中與DNA復制同步進行復制同步進行 （2） 且組蛋白八聚體在且組蛋白八聚體在DNA復制時并不離開親本復制時并不離開親本 DNA鏈鏈 蛋白質合成抑制劑實驗蛋白質合成抑制劑實驗 所證實所證實 放線菌酮放線菌酮

20、cycloheximide （3） 組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代組蛋白八聚體以全保留方式傳給子代 （4） 組蛋白八聚體與先導鏈結合組蛋白八聚體與先導鏈結合新老八聚體在子代鏈上的分布新老八聚體在子代鏈上的分布復制原點復制原點老老新新先導鏈先導鏈后隨鏈后隨鏈a、復制子的大?。ā椭谱拥拇笮。⊿izes of replicon）:Yeast or fly平均平均 40 kbMammals 平均平均 100 kbProkaryotic DNA: 1000 kbb、岡崎片段、岡崎片段(Okazaki fragments):Prokaryotic DNA:1000-2000 ntEukaryotic

21、DNA:100-200 ntc、復制速度（、復制速度（Rate of replication）:Eukaryotic DNA:ca. 3,000bp/min (50/sec)Prokaryotic DNA:50,000bp/min (900/sec)原核生物和真核生物原核生物和真核生物DNADNA復制的比較復制的比較 1. Semi-conservative replication2. Semi-discontinuous repliction3. DNA helicase, Ssb4. RNA priming5. 校正閱讀（校正閱讀（Proofreading）1. 復制起點（單、多）2. 復

22、制子（大小、多少）3. 復制起始的許可因子的控制 （復制周期的重疊與否）4. 復制叉移動的速度 (900/50 nt/S)5. 岡崎片段的大小6. 端粒和端粒酶7. DNA聚合酶Polymerases相同點：不同點：本章結束，本章結束， 謝謝！謝謝！名詞解釋復制 復制體 半保留復制 崗崎片段 復制單位 復制 先導鏈 后隨鏈 DNA復制的轉錄激活 DNA復制的半不連續(xù)性簡答題1、圖示說明DNA半保留復制的機制證明。2、DNA復制方向為53，請說明復制為什么不能從35。3、為什么崗崎證明DNA半不連續(xù)性復制的實驗中出現(xiàn)兩條鏈都是 不連續(xù)的假象。4、DNA復制為何選擇RNA作為引物？5、復制叉誕生的

23、過程如何，后隨鏈上都包含哪些事件（涉及的酶 的情況）6、E.coli的DNA復制終止機制7、原核生物線性DNA復制5末端短縮的解決辦法有哪幾種。8、真核生物端粒末端及端粒酶在DNA末端復制過程中的作用 機制9、真核生物DNA復制過程中核小體復制和保留機制。10、保證復制忠實性的主要機制11、真核與原核復制起始調控的差別12、真核與原核復制的比較內容回顧內容回顧1：1、基本概念、基本概念 DNA復制復制 復制子復制子 復制體復制體 復制時期復制時期2、半保留復制、半保留復制 3、復制起點、復制起點 結構特征結構特征 復制方向：復制叉復制方向：復制叉 復制眼復制眼 單雙向復制的決定條件單雙向復制的決定條件 復制的多模式復制的多模式 復制方式：復制叉式（從頭起始）復制方式：復制叉式（從頭起始） D環(huán)復制（置換式）環(huán)復制（置換式） 復制（滾環(huán)復制）復制（滾環(huán)復制）4、復制酶學、復制酶學 三種三種DNApol DNApol 內容回顧內容回顧 2：1、DNApol和和的主要活性和功能的主要活性和功能 聚合活性聚合活性 外切活性（兩種）外切活性（兩種） 延伸方向延伸方向2、DNA連接酶連接酶3、和、和DN