外源基因的表達(dá)

1、第六章第六章 外源基因的表達(dá)外源基因的表達(dá)基因工程技術(shù)的基因工程技術(shù)的核心核心是是基因表達(dá)技術(shù)基因表達(dá)技術(shù)?；虮磉_(dá)基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成是指結(jié)構(gòu)基因在調(diào)控序列的作用下轉(zhuǎn)錄成mRNA，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的基因，經(jīng)加工后在核糖體的協(xié)助下又轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的基因產(chǎn)物產(chǎn)物蛋白質(zhì)，再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相蛋白質(zhì)，再在受體細(xì)胞環(huán)境中經(jīng)修飾而顯示出相應(yīng)的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所應(yīng)的功能。從基因到有功能的產(chǎn)物這整個轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯及所有的加工過程就是基因表達(dá)的過程，它是在一系列酶和調(diào)有的加工過程就是基因表達(dá)的過程，它是在一系列酶和調(diào)控序列的共同作用

2、下完成的?？匦蛄械墓餐饔孟峦瓿傻?。基因重組的基因重組的主要目的主要目的是要使目的基因在某一細(xì)胞中能是要使目的基因在某一細(xì)胞中能得到高效表達(dá)，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)目的的基因產(chǎn)物，得到高效表達(dá)，即產(chǎn)生人們所需要的高產(chǎn)目的的基因產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物。如蛋白質(zhì)、多肽類生物藥物。目前已構(gòu)建出了多種基因表達(dá)系統(tǒng)，包括原核生物表達(dá)系目前已構(gòu)建出了多種基因表達(dá)系統(tǒng)，包括原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)。統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)具有各自的特點(diǎn)。在原核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操在原核生物中，基因表達(dá)是以操縱子的形式進(jìn)行的。當(dāng)操縱子的調(diào)節(jié)基

3、因與縱子的調(diào)節(jié)基因與RNA聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成聚合酶作用時，結(jié)構(gòu)基因則開始轉(zhuǎn)錄成相應(yīng)的相應(yīng)的mRNA，與此同時，與此同時， mRNA立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相立即與核糖體結(jié)合轉(zhuǎn)譯出相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時轉(zhuǎn)譯也完成，隨之應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄完畢時轉(zhuǎn)譯也完成，隨之mRNA也被也被水解掉。水解掉。在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生在真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄是在核內(nèi)進(jìn)行的，先生成成hnRNA，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾，再加工去掉內(nèi)含子，外顯子相連接，并修飾5和和3末端后才形成末端后才形成mRNA。而。而mRNA只能在細(xì)胞漿中的核糖體上轉(zhuǎn)只能在細(xì)胞

4、漿中的核糖體上轉(zhuǎn)譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化、形成高級結(jié)構(gòu)。譯成多肽或蛋白質(zhì)，再經(jīng)過加工、糖化、形成高級結(jié)構(gòu)。v基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？基因表達(dá)在原核生物與真核生物中的差別？6.1 基因表達(dá)的機(jī)制基因表達(dá)的機(jī)制6.1.1 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄外源基因的起始轉(zhuǎn)錄 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始外源基因的起始轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動子和相關(guān)的速率是基因表達(dá)的限速步驟。選擇可調(diào)控的啟動子和相關(guān)的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。的調(diào)控序列，是構(gòu)建一個表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。原核生物啟動子原核生物啟

5、動子誘導(dǎo)型啟動子：誘導(dǎo)型啟動子：組成型啟動子：組成型啟動子：如如lac、trp、PR、 PL、 tac等的啟動子等的啟動子如如T7噬菌體的啟動子噬菌體的啟動子真核生物啟動子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型。真核生物啟動子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型。6.1.2 mRNA的延伸與穩(wěn)定的延伸與穩(wěn)定外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持外源基因起始轉(zhuǎn)錄后，保持mRNA的有效延伸、終止的有效延伸、終止及穩(wěn)定存在是及穩(wěn)定存在是外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵外源基因有效表達(dá)的關(guān)鍵。一方面，要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘一方面，要防止因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的衰減和非特異性終止而誘發(fā)的發(fā)的mRNA轉(zhuǎn)錄提前終止的現(xiàn)象；轉(zhuǎn)錄提前終止的現(xiàn)象；

6、另一方面，又要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不另一方面，又要存在正常的轉(zhuǎn)錄終止序列以防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，使mRNA的長度限制在一定的范圍內(nèi)，從的長度限制在一定的范圍內(nèi)，從而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。而增加外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。6.1.3 外源基因外源基因mRNA的有效翻譯的有效翻譯外源基因外源基因mRNA有效翻譯必須考慮的基本原則：有效翻譯必須考慮的基本原則：AUG(ATG)是首選的起始密碼子。是首選的起始密碼子。SD序列為與核糖體序列為與核糖體16S rRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有列至少含有AGGAGG序列中的序列中的4個堿基。個堿基。S

7、D序列與翻譯起始密碼子之間的距離為序列與翻譯起始密碼子之間的距離為39個堿基。個堿基。在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。在翻譯起始區(qū)周圍序列不易形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。不同基因組使用密碼子具有不同基因組使用密碼子具有選擇性選擇性。主密碼子主密碼子（major codon）罕用密碼子罕用密碼子（rare codon）如果外源基因如果外源基因mRNA的主密碼子與受體細(xì)胞基因組的的主密碼子與受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因表達(dá)的效率就高；主密碼子相同或接近，則該基因表達(dá)的效率就高；反之，若外源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)效反之，若外源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)效率就低。率

8、就低。6.1.4 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對策：避免外源基因表達(dá)蛋白降解的對策：構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)6.1.5 目的基因沉默目的基因沉默基因沉默的基因沉默的作用機(jī)制作用機(jī)制位置效應(yīng)的基因沉默：位置效應(yīng)的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：是指基因在基因組中的是指基因在基因組中的位置對其表達(dá)的影響位置對其表達(dá)的影響是在是在DNA

9、水平上的基因水平上的基因調(diào)控調(diào)控是在是在RNA水平上的基因水平上的基因調(diào)控調(diào)控6.2 基因表達(dá)的調(diào)控元件基因表達(dá)的調(diào)控元件6.2.1 啟動子啟動子啟動子（啟動子（promoter）：）：是一段提供是一段提供RNA聚合酶識別和結(jié)合聚合酶識別和結(jié)合的的DNA序列，它位于基因的上游。序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通過聚合酶正是通過與它的結(jié)合而啟動基因的轉(zhuǎn)錄。原核基因啟動子具有與它的結(jié)合而啟動基因的轉(zhuǎn)錄。原核基因啟動子具有10和和35序列等結(jié)構(gòu)元件，而真核基因啟動子則具有序列等結(jié)構(gòu)元件，而真核基因啟動子則具有TATA盒及上游元件等特征結(jié)構(gòu)。盒及上游元件等特征結(jié)構(gòu)。*啟動子的特征啟動子的特征序

10、列特異性序列特異性方向性方向性位置特性位置特性種屬特異性種屬特異性6.2.1.1 原核生物的啟動子原核生物的啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：大多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列為大多數(shù)細(xì)菌啟動子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的序列為CAT，轉(zhuǎn)錄從第二個堿基開始，該堿基為嘌呤堿基，轉(zhuǎn)錄從第二個堿基開始，該堿基為嘌呤堿基（A/G）。）。Pribnow框：框： 10bp處的處的TATA區(qū)區(qū)，又稱，又稱10序列區(qū)序列區(qū)。Sextama框：框： 35bp處的處的TTGACA區(qū)區(qū)，又稱，又稱35區(qū)區(qū)。間隔區(qū)：間隔區(qū)：內(nèi)部無明顯的保守性，其序列的堿基組成對啟內(nèi)部無明顯的保守性，其序列的堿基組成對啟動子的功能不十分重要，但其長度卻

11、是影響啟動子功能的動子的功能不十分重要，但其長度卻是影響啟動子功能的重要因素。重要因素。TTGACATATAATTranscriptional start site53-35-1016-19 bp5-9 bpT80A95T45A60A50T96T82T84G78A65C54A45The prokaryotic promoterThe sequence of DNA needed for RNA polymerase to bind to the template and accomplish the initiation reaction.6.2.1.1 真核生物的啟動子真核生物的啟動子型：型

12、：rRNA基因啟動子基因啟動子型：型：mRNA基因啟動子基因啟動子型：型：tRNA基因啟動子基因啟動子型啟動子型啟動子所屬基因編碼的產(chǎn)物為所屬基因編碼的產(chǎn)物為rRNA前體，經(jīng)剪切加工后成為各前體，經(jīng)剪切加工后成為各種成熟的種成熟的rRNA分子。分子。人體細(xì)胞人體細(xì)胞 型啟動子型啟動子核心啟動子核心啟動子：上游控制元件（上游控制元件（UCE）：緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以啟動緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以啟動基因的轉(zhuǎn)錄?；虻霓D(zhuǎn)錄。位于起始位點(diǎn)上游位于起始位點(diǎn)上游 180190bp處，處，它可以大幅度增強(qiáng)它可以大幅度增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率。轉(zhuǎn)錄效率。型啟動子型啟動子型啟動子所屬基因絕大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)。型啟動子所屬基因絕

13、大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)。TATA框（框（Hogness框）：框）：富含富含AT的保守序列區(qū)，的保守序列區(qū)，它它與與DNA雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇。其中心點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游其中心點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游2030bp的位置。的位置。CAAT框：框：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游75bp處，處，與與RNA聚合酶的結(jié)合有關(guān)。聚合酶的結(jié)合有關(guān)。GC框：框：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游100300bp處，處，與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合有關(guān)。與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合有關(guān)。啟動子啟動子基本區(qū)基本區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)輔助區(qū)輔助區(qū)型啟動子型啟動子內(nèi)啟動子內(nèi)啟動

14、子：外啟動子外啟動子：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游下游，如，如tRNA和和5SRNA的啟動子。的啟動子。位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游上游，缺乏相應(yīng)的內(nèi)部，缺乏相應(yīng)的內(nèi)部序列，如脊椎動物序列，如脊椎動物U6核小核小RNA和和7SKRNA啟啟動子，結(jié)構(gòu)類似于真核生物動子，結(jié)構(gòu)類似于真核生物型啟動子。型啟動子。6.2.1.3 啟動子與轉(zhuǎn)錄啟動啟動子與轉(zhuǎn)錄啟動大腸桿菌大腸桿菌RNA聚合酶的亞基成分聚合酶的亞基成分 亞基 基因 氨基酸含量 數(shù)量 分子量（kD） 主要功能 rpoA 329 2 37 與調(diào)節(jié)序列結(jié)合 rpoB 1342 1 151 形成磷酸二酯鍵 rpoC 1407

15、 1 155 與 DNA模板結(jié)合 70 rpoD 613 1 70 識別一般啟動子，并啟動合成 RNA聚合酶：聚合酶： 核心酶核心酶(2)亞基全酶亞基全酶( 2 )s s factor:6.2.1.4 啟動子的分離啟動子的分離隨機(jī)克隆法隨機(jī)克隆法聚合酶保護(hù)法聚合酶保護(hù)法過濾膜結(jié)合法過濾膜結(jié)合法PCR擴(kuò)增法擴(kuò)增法6.2.2 增強(qiáng)子增強(qiáng)子增強(qiáng)子（增強(qiáng)子（enhancer）：是能夠增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的：是能夠增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列，又稱順式作用序列，又稱強(qiáng)化子強(qiáng)化子。v增強(qiáng)子的特性：增強(qiáng)子的特性：雙向性。雙向性。重復(fù)序列。重復(fù)序列。增強(qiáng)子行使功能與所處的位置無關(guān)。增強(qiáng)子行使功能與所處

16、的位置無關(guān)。特異性。特異性。增強(qiáng)子不僅與同源基因相連時有調(diào)控功能，與異源增強(qiáng)子不僅與同源基因相連時有調(diào)控功能，與異源基因相連時也有功能。基因相連時也有功能。6.2.3 終止子終止子本征終止子：本征終止子：不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的不需要其他蛋白輔助因子便可在特殊的RNA結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用。依賴終止信號的終止子：依賴終止信號的終止子：要依賴專一的蛋白質(zhì)輔助因子。要依賴專一的蛋白質(zhì)輔助因子。本征終止子本征終止子兩大特征兩大特征發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(莖環(huán)結(jié)構(gòu)莖環(huán)結(jié)構(gòu))：延緩延緩RNA聚合酶的運(yùn)動，聚合酶的運(yùn)動，不終止不終止RNA的合成，但為轉(zhuǎn)錄終止創(chuàng)造條件。的合成，但為轉(zhuǎn)

17、錄終止創(chuàng)造條件。寡聚寡聚U組成的尾部：組成的尾部：轉(zhuǎn)錄的終止信號。轉(zhuǎn)錄的終止信號。依賴型終止子依賴型終止子終止位點(diǎn)上游終止位點(diǎn)上游5090bp區(qū)域，是區(qū)域，是因子的識別位點(diǎn)。因子的識別位點(diǎn)。 因子依賴型終止子也能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但莖環(huán)的因子依賴型終止子也能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但莖環(huán)的GC含量較含量較低，因此低，因此RNA聚合酶在此移動的速度減慢，但停留時間較聚合酶在此移動的速度減慢，但停留時間較短，并且莖環(huán)結(jié)構(gòu)的下游沒有寡聚短，并且莖環(huán)結(jié)構(gòu)的下游沒有寡聚U結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶只能聚合酶只能在在因子的協(xié)助下才能有效終止轉(zhuǎn)錄。因子的協(xié)助下才能有效終止轉(zhuǎn)錄。因子因子是一個相對分子量為是一個相對分子量為2

18、.0105的六聚體蛋白質(zhì)分的六聚體蛋白質(zhì)分子，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種子，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶酶。由。由于它催化于它催化NTP的水解，的水解， 因子能促使新生的因子能促使新生的RNA鏈從三元鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。在在RNA合成起始以后，合成起始以后，因子即附著在新生的因子即附著在新生的RNA鏈上，靠鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的水解產(chǎn)生的能量，沿著能量，沿著53方向朝方向朝RNA聚合酶移動，到達(dá)聚合酶移動，到達(dá)RNA的的3OH端后取代了暫停端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，并從模板和酶

19、上釋放聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，程需要消耗能量，所以， 因子有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。因子有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。6.2.4 衰減子衰減子衰減子（衰減子（attenuator）：）：是位于是位于mRNA分子前導(dǎo)序列中的一段控分子前導(dǎo)序列中的一段控制蛋白質(zhì)合成起始速率的調(diào)節(jié)區(qū)，亦即發(fā)生弱化作用的轉(zhuǎn)錄終制蛋白質(zhì)合成起始速率的調(diào)節(jié)區(qū)，亦即發(fā)生弱化作用的轉(zhuǎn)錄終止信號序列，又稱止信號序列，又稱弱化子弱化子。衰減子最先發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌色氨酸（衰減子最先發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌色氨酸（trp）操縱子中。）操縱子中。trp前導(dǎo)區(qū)的前

20、導(dǎo)區(qū)的4個片段（個片段（1、2、3、4）能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對，）能以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對，有時以有時以1-2和和3-4配對，有時只以配對，有時只以2-3配對。配對。在前導(dǎo)肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，所以前導(dǎo)肽的翻譯對在前導(dǎo)肽基因中有兩個相鄰的色氨酸密碼子，所以前導(dǎo)肽的翻譯對tRNATrp的濃度很敏感。的濃度很敏感。當(dāng)培養(yǎng)基中當(dāng)培養(yǎng)基中trp濃度很低時，濃度很低時，負(fù)載有負(fù)載有trp的的tRNATrp也也就少，這樣翻譯通過兩個相鄰就少，這樣翻譯通過兩個相鄰trp密碼子的速度就很慢，當(dāng)密碼子的速度就很慢，當(dāng)4區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，區(qū)被轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體才進(jìn)行到核糖體才進(jìn)行到1區(qū)（或

21、停留在兩個相鄰的區(qū)（或停留在兩個相鄰的trp 密碼子處），這時前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)密碼子處），這時前導(dǎo)區(qū)結(jié)構(gòu)是是2-3配對，不形成配對，不形成3-4配對的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到配對的終止結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄可繼續(xù)進(jìn)行，直到trp操縱操縱子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄。而子中的結(jié)構(gòu)基因全部轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)當(dāng)trp濃度高時，濃度高時，核糖體可順利通過兩個相鄰核糖體可順利通過兩個相鄰的的trp密碼子，在密碼子，在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)區(qū)被轉(zhuǎn)錄之前，核糖體就到達(dá)2區(qū)，這樣使區(qū)，這樣使2-3不能配對，不能配對，3-4區(qū)可自由配對形成莖環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，終止轉(zhuǎn)錄。所以，弱化子對區(qū)可自由配對形成莖環(huán)狀終止子結(jié)構(gòu)，終止轉(zhuǎn)錄

22、。所以，弱化子對RNA聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。聚合酶的影響依賴于前導(dǎo)肽翻譯中核糖體所處的位置。Low TrpHigh Trp6.2.5 絕緣子絕緣子絕緣子（絕緣子（insulator）：）：既是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一種邊界元件；既是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一種邊界元件；它能阻止鄰近的調(diào)控元件對其所界定基因的啟動子起增強(qiáng)它能阻止鄰近的調(diào)控元件對其所界定基因的啟動子起增強(qiáng)或抑制作用；或抑制作用；絕緣子抑制增強(qiáng)子的功能是有極性的。它只能抑制處于絕絕緣子抑制增強(qiáng)子的功能是有極性的。它只能抑制處于絕緣子所在邊界另一側(cè)的增強(qiáng)子的作用，而對處于同一結(jié)構(gòu)域緣子所在邊界另一側(cè)的增強(qiáng)子

23、的作用，而對處于同一結(jié)構(gòu)域的增強(qiáng)子沒有抑制作用；的增強(qiáng)子沒有抑制作用；絕緣子對基因表達(dá)的調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程，它是通絕緣子對基因表達(dá)的調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程，它是通過細(xì)胞內(nèi)特定的蛋白質(zhì)因子相互作用而產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)的。過細(xì)胞內(nèi)特定的蛋白質(zhì)因子相互作用而產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)的。6.2.6 反義子反義子反義反義RNA（antisence RNA）：同某種天然：同某種天然mRNA反向互補(bǔ)的反向互補(bǔ)的RNA分子稱為反義分子稱為反義RNA，它是由雙鏈，它是由雙鏈DNA中的無意義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)中的無意義鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，可以用來阻止被其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的與之互補(bǔ)生的，可以用來阻止被其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的與之互補(bǔ)mRNA的轉(zhuǎn)

24、譯活性?，F(xiàn)在編碼反義的轉(zhuǎn)譯活性?，F(xiàn)在編碼反義RNA的基因已在基因工程中得到應(yīng)的基因已在基因工程中得到應(yīng)用，此項技術(shù)特稱為反義技術(shù)學(xué)（用，此項技術(shù)特稱為反義技術(shù)學(xué)（antisence techology）。）。反義子反義子：編碼反義：編碼反義RNA的的DNA稱為反義子。稱為反義子。反義子在反義子在DNA的的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個水平對基因的表達(dá)三個水平對基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用，其中以對蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。起調(diào)節(jié)作用，其中以對蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍。 復(fù)制水平的調(diào)節(jié)復(fù)制水平的調(diào)節(jié)直接抑制直接抑制反義反義RNA與引物與引物RNA前體互補(bǔ)，使得引物前體互補(bǔ)，使得引物RNA無法與無法

25、與DNA模板結(jié)合，進(jìn)而抑制模板結(jié)合，進(jìn)而抑制DNA復(fù)制的頻率。復(fù)制的頻率。間接抑制間接抑制反義反義RNA通過阻斷復(fù)制激活蛋白因子的合成通過阻斷復(fù)制激活蛋白因子的合成而間接抑制而間接抑制DNA的復(fù)制。的復(fù)制。 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)反義反義RNA通過與通過與mRNA的的5 端互補(bǔ)結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的延伸；端互補(bǔ)結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的延伸；作用于作用于mRNA的的poly(A)區(qū)域，抑制區(qū)域，抑制mRNA的成熟及其運(yùn)輸；的成熟及其運(yùn)輸；與真核生物與真核生物mRNA結(jié)合而影響其剪切加工。結(jié)合而影響其剪切加工。 翻譯水平的調(diào)節(jié)翻譯水平的調(diào)節(jié)通過與通過與mRNA的的5 端端SD序列結(jié)合，改變其空間構(gòu)象，從而

26、序列結(jié)合，改變其空間構(gòu)象，從而影響核糖體在影響核糖體在mRNA上的定位；上的定位；通過與通過與mRNA的的5端編碼區(qū)（如起始密碼）結(jié)合，直接抑端編碼區(qū)（如起始密碼）結(jié)合，直接抑制翻譯的起始。制翻譯的起始。SD序列（序列（SD sequence）：系：系Shine-Dalgarno序列的簡稱，序列的簡稱，此為紀(jì)念最早發(fā)現(xiàn)該序列的研究者而命名的。它此為紀(jì)念最早發(fā)現(xiàn)該序列的研究者而命名的。它是原核生物是原核生物中核糖體的結(jié)合位點(diǎn)中核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，亦即存在于，亦即存在于mRNA分子分子AUG起始密碼起始密碼子之前的多聚嘌呤序列子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可與的部分或全部，可與16

27、S rRNA的的3 -末端序列互補(bǔ)。末端序列互補(bǔ)。SD序列在核糖體同序列在核糖體同mRNA的結(jié)合的結(jié)合過程中起重要作用。過程中起重要作用。6.3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)：外源基因表達(dá)系統(tǒng)：泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物（目的蛋白）。（目的蛋白）。外源基因表達(dá)系統(tǒng)外源基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體受體細(xì)胞受體細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)系統(tǒng)原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如大腸桿菌表達(dá)如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)

28、系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。統(tǒng)、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)等。真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系如酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。v 原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞所具有的特點(diǎn)：的特點(diǎn)：原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。通過發(fā)酵迅速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物?；蚪M結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析?；?/p>

29、因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。達(dá)載體。生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)相。構(gòu)相。內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定。6.3.1 大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌大腸桿菌是一種是一種革蘭氏陰性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌，其遺傳背景清楚，目，其遺傳背景清

30、楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。目前大多數(shù)外源基因都標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短。目前大多數(shù)外源基因都是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的，是目前應(yīng)用最廣泛的是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的，是目前應(yīng)用最廣泛的基因表達(dá)系統(tǒng)。基因表達(dá)系統(tǒng)。v與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)越性：與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所具有的優(yōu)越性：經(jīng)過長期研究，人們已經(jīng)掌握了十分豐富的有關(guān)大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、經(jīng)過長期研究，人們已經(jīng)掌握了十分豐富的有關(guān)大腸桿菌基礎(chǔ)生物學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的背景知識，特別是對其基因表達(dá)調(diào)控的分遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的背景知識，特別是對其基因表達(dá)調(diào)控的分

31、子機(jī)理有了深刻的了解；子機(jī)理有了深刻的了解；大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗體系，擁有各類適用的大腸桿菌已被發(fā)展成為一種安全的基因工程實(shí)驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體系列；寄主菌株和不同類型的載體系列；實(shí)驗已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因，例如抑制生長素基因和胰島素基實(shí)驗已經(jīng)證明，許多克隆的真核基因，例如抑制生長素基因和胰島素基因等，都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)；因等，都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的、高水平的表達(dá)；大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)。6.3.1.1

32、大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體大腸桿菌基因表達(dá)載體可分為大腸桿菌基因表達(dá)載體可分為3個系統(tǒng)：個系統(tǒng)：DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)（1）DNA復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制及重組載體的選擇系統(tǒng)復(fù)制子復(fù)制子復(fù)制子復(fù)制子：是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)（：是一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）和反式因子作用）和反式因子作用區(qū)在內(nèi)的區(qū)在內(nèi)的DNA片段。片段。大腸桿菌基因表達(dá)載體一般是大腸桿菌基因表達(dá)載體一般是質(zhì)粒表達(dá)載體質(zhì)粒表達(dá)載體，含有能在，含有能在大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。大腸桿菌中有效復(fù)制的復(fù)制子。

33、常見的復(fù)制子常見的復(fù)制子pMB1、p15A、ColE1:松弛復(fù)制型松弛復(fù)制型，每細(xì)，每細(xì)胞質(zhì)粒拷貝數(shù)胞質(zhì)?？截悢?shù)1020個。個。pSC101:嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制型嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制型，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)，每細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)少于少于5個。個。在同一大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，含同一類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒在同一大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，含同一類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體不能共存，但含不同類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體則可以載體不能共存，但含不同類型復(fù)制子的不同質(zhì)粒載體則可以共存于同一細(xì)胞中。共存于同一細(xì)胞中。選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記目的目的：使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生新的表型，將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞從大量的菌：使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生新的表型，將轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞從大量的菌群中分離出來。群中分離出來。

34、微生物表型選擇標(biāo)記微生物表型選擇標(biāo)記顯性標(biāo)記顯性標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記記號，包括有在基因克隆中采用的質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記記號，包括有新陳代謝特性新陳代謝特性、對大腸桿菌素對大腸桿菌素E1的免疫性的免疫性，以及，以及抗菌素抗性抗菌素抗性等多種。而絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用等多種。而絕大多數(shù)的質(zhì)粒載體都是使用抗菌素抗性記號抗菌素抗性記號，并且主要集中在并且主要集中在氨芐青霉素抗性氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性四環(huán)素抗性、鏈霉素抗性鏈霉素抗性、氯霉素抗性氯霉素抗性以及以及卡那霉素抗性卡那霉素抗性等少數(shù)幾種抗菌素抗性記號上。等少數(shù)幾種抗菌素抗性記號上。其原因一方

35、面是由于許多質(zhì)粒本身就是帶有抗菌素抗性基因其原因一方面是由于許多質(zhì)粒本身就是帶有抗菌素抗性基因的抗藥性的抗藥性R因子；另一方面則是因為抗菌素抗性記號具有便因子；另一方面則是因為抗菌素抗性記號具有便于操作、易于選擇等優(yōu)點(diǎn)。于操作、易于選擇等優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)載體上一般都帶有一個以上的抗生素抗性基因。表達(dá)載體上的大腸桿菌表達(dá)載體上一般都帶有一個以上的抗生素抗性基因。表達(dá)載體上的抗藥性基因賦予宿主特定的抗藥性，使其能在抗生素的培養(yǎng)條件下正常生長。這抗藥性基因賦予宿主特定的抗藥性，使其能在抗生素的培養(yǎng)條件下正常生長。這樣就可以篩除掉不含載體的宿主，同時保證載體在宿主中的穩(wěn)定存在。在構(gòu)建大樣就可以篩除掉

36、不含載體的宿主，同時保證載體在宿主中的穩(wěn)定存在。在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的過程中，選擇何種抗生素抗性基因，還必須考慮到是否會對特腸桿菌表達(dá)載體的過程中，選擇何種抗生素抗性基因，還必須考慮到是否會對特定宿主細(xì)胞的代謝活動產(chǎn)生影響。定宿主細(xì)胞的代謝活動產(chǎn)生影響。（2）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)）外源目的基因的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)這一系統(tǒng)包括這一系統(tǒng)包括啟動子、抑制物基因啟動子、抑制物基因和和轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子和終止子因宿主的不同而有差別，往往在不同啟動子和終止子因宿主的不同而有差別，往往在不同的宿主中表達(dá)的效率也不一樣，特別是原核生物和真核生的宿主中表達(dá)的效率也不一樣，特別是原核生物和真核生物宿主間完全不

37、同，相互間不能通用。物宿主間完全不同，相互間不能通用。啟動子啟動子啟動子（啟動子（promotor）：）：是一段能被宿主是一段能被宿主RNA聚合酶特異性聚合酶特異性識別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的識別和結(jié)合并指導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，是基因表達(dá)序列，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。調(diào)控的重要元件。外源目的基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇外源目的基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。選擇可調(diào)控的強(qiáng)啟動子是構(gòu)建一個理想的表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的可調(diào)控的強(qiáng)啟動子是構(gòu)建一個理想的表達(dá)系統(tǒng)首先要考慮的問題。問題。啟動子位于基因的上游，其序列的長度因生物的種類而啟動子位于基因的上游，其序列的長度因生物的種類

38、而異。當(dāng)異。當(dāng)RNA聚合酶定位并結(jié)合到啟動子序列上時，便可啟動聚合酶定位并結(jié)合到啟動子序列上時，便可啟動基因的轉(zhuǎn)錄?；虻霓D(zhuǎn)錄。啟動子具有啟動子具有序列特異性、啟動的方向性、作用位點(diǎn)的特序列特異性、啟動的方向性、作用位點(diǎn)的特異性異性和和種屬特異性種屬特異性等等特征特征。在大腸桿菌細(xì)胞中大多數(shù)基因的啟動子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在大腸桿菌細(xì)胞中大多數(shù)基因的啟動子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離為間的距離為69bp，但對于要表達(dá)的外源基因來說，啟動子，但對于要表達(dá)的外源基因來說，啟動子與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最佳距離還有待實(shí)驗來確定。與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的最佳距離還有待實(shí)驗來確定。外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭的現(xiàn)象，

39、外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭的現(xiàn)象，形成長短不一的形成長短不一的mRNA混合物，而過長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不僅會影混合物，而過長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不僅會影響到響到mRNA的翻譯效率，同時也會使外源基因的轉(zhuǎn)錄速度大的翻譯效率，同時也會使外源基因的轉(zhuǎn)錄速度大大降低。因此，大降低。因此，在構(gòu)建表達(dá)載體的時候一般采用強(qiáng)的啟動子在構(gòu)建表達(dá)載體的時候一般采用強(qiáng)的啟動子和強(qiáng)的終止子，以達(dá)到高效表達(dá)的目的。和強(qiáng)的終止子，以達(dá)到高效表達(dá)的目的。抑制物基因抑制物基因抑制物基因的產(chǎn)物是一種控制啟動子功能的蛋白質(zhì)，對抑制物基因的產(chǎn)物是一種控制啟動子功能的蛋白質(zhì)，對啟動子的起始轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)生抑制作用。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下啟動子

40、的起始轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)生抑制作用。在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可使抑制物失活，啟動子功能重新恢復(fù)?？墒挂种莆锸Щ?，啟動子功能重新恢復(fù)。通過抑制物基因產(chǎn)物可使目的基因在宿主培養(yǎng)到最佳狀態(tài)通過抑制物基因產(chǎn)物可使目的基因在宿主培養(yǎng)到最佳狀態(tài)時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而保證轉(zhuǎn)錄的有效進(jìn)行，特別是表達(dá)產(chǎn)物對宿時進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而保證轉(zhuǎn)錄的有效進(jìn)行，特別是表達(dá)產(chǎn)物對宿主有害時，控制轉(zhuǎn)錄的時機(jī)尤其重要。理想的可調(diào)控的啟動子主有害時，控制轉(zhuǎn)錄的時機(jī)尤其重要。理想的可調(diào)控的啟動子在細(xì)胞生長的初期往往不表達(dá)或低水平表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞增殖到在細(xì)胞生長的初期往往不表達(dá)或低水平表達(dá)，而當(dāng)細(xì)胞增殖到一定的密度后，在某種特定的誘導(dǎo)因子（如光、溫度或化學(xué)藥一定

41、的密度后，在某種特定的誘導(dǎo)因子（如光、溫度或化學(xué)藥物等）的誘導(dǎo)下，物等）的誘導(dǎo)下，RNA聚合酶才開始啟動轉(zhuǎn)錄，合成聚合酶才開始啟動轉(zhuǎn)錄，合成mRNA。轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子（terminator）：是一段終止）：是一段終止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA序列。序列。轉(zhuǎn)錄終止子可分為轉(zhuǎn)錄終止子可分為本征終止子本征終止子和和依賴終止信號的終止子依賴終止信號的終止子兩類。兩類。轉(zhuǎn)錄終止子的功能不同于啟動子，但它對基因的正常表轉(zhuǎn)錄終止子的功能不同于啟動子，但它對基因的正常表達(dá)同樣有著重要的意義。一方面，它使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后達(dá)同樣有著重要的意義。一方面，它使轉(zhuǎn)錄在目的基因之后立即

42、停止，避免多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)立即停止，避免多余的轉(zhuǎn)錄以節(jié)省宿主內(nèi)RNA的合成底物，的合成底物，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量；另一方面，正常轉(zhuǎn)錄終止子的存在提高目的基因的轉(zhuǎn)錄量；另一方面，正常轉(zhuǎn)錄終止子的存在能夠防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有效地控制目的基因能夠防止產(chǎn)生不必要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，有效地控制目的基因mRNA的長度，提高的長度，提高mRNA的穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上其它基因的異常表達(dá)。的異常表達(dá)。（3）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)）蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)在原核生物中影響翻譯起始的因素有：在原核生物中影響翻譯起始的因素有：起始密碼子、核起始密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)（糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）、起始密

43、碼子于序列）、起始密碼子于SD序列之間的距序列之間的距離和堿基組成、離和堿基組成、mRNA的二級結(jié)構(gòu)、的二級結(jié)構(gòu)、mRNA上游的上游的5端非翻端非翻譯序列和蛋白編碼區(qū)的譯序列和蛋白編碼區(qū)的5端序列等。端序列等。蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)核糖體結(jié)合位點(diǎn)（核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）序列）翻譯起始密碼子翻譯起始密碼子翻譯終止密碼子翻譯終止密碼子核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn)：核糖體結(jié)合位點(diǎn)：是指原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的一段是指原核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的一段DNA序列，即序列，即Shine-Dalgarno序列序列（簡稱（簡稱SD序列序列）。）。SD序列與核糖序列與核糖體體16S

44、rRNA特異配對而與宿主核糖體結(jié)合，它對特異配對而與宿主核糖體結(jié)合，它對mRNA的翻的翻譯起著決定性的作用。譯起著決定性的作用。核糖體與核糖體與mRNA的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率越高，的結(jié)合程度越強(qiáng)，翻譯的起始效率越高，而核糖體與而核糖體與mRNA 的結(jié)合程度主要取決于的結(jié)合程度主要取決于SD序列與核糖體序列與核糖體16S rRNA堿基的互補(bǔ)性，因此，在構(gòu)建表達(dá)載體時，要盡可能使堿基的互補(bǔ)性，因此，在構(gòu)建表達(dá)載體時，要盡可能使SD序列與序列與16S rRNA序列互補(bǔ)配對。序列互補(bǔ)配對。影響影響mRNA翻譯效率的因素：翻譯效率的因素：包括包括SD序列序列、翻譯的起始翻譯的起始密碼子密碼子和和

45、SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離和堿基組成序列與翻譯起始密碼子之間的距離和堿基組成等。等。大腸桿菌大腸桿菌SD序列的堿基組成序列的堿基組成為為5 AGGAGG 3 ,其中以其中以GGAG四個堿基最為重要，這四個堿基中的任何一個發(fā)生突四個堿基最為重要，這四個堿基中的任何一個發(fā)生突變都會引起翻譯效率的大幅度下降。變都會引起翻譯效率的大幅度下降。SD序列與起始密碼子之間的距離對保證準(zhǔn)確和高效翻譯序列與起始密碼子之間的距離對保證準(zhǔn)確和高效翻譯也很重要。也很重要。SD序列與起始密碼子之間的距離一般為序列與起始密碼子之間的距離一般為68bp，多數(shù)情況下為多數(shù)情況下為7bp，此間的堿基多一個或少一個都會影

46、響翻譯，此間的堿基多一個或少一個都會影響翻譯的起始效率。的起始效率。SD序列與起始密碼子之間的堿基組成也影響翻譯的起始序列與起始密碼子之間的堿基組成也影響翻譯的起始效率。效率。研究表明，研究表明，SD序列后面的堿基為序列后面的堿基為AAAA或或UUUU時，時，翻譯的起始效率最高，而當(dāng)序列為翻譯的起始效率最高，而當(dāng)序列為CCCC或或GGGG時，翻譯時，翻譯的起始效率分別為最高值的的起始效率分別為最高值的50和和25。有的載體的啟動子后接有有的載體的啟動子后接有SD序列，而另一些載體的啟動序列，而另一些載體的啟動子后沒有接子后沒有接SD序列，那么則需要目的基因上游帶進(jìn)序列，那么則需要目的基因上游帶

47、進(jìn)SD序列。序列。若在大腸桿菌中表達(dá)真核基因或本身所含核糖體結(jié)合位若在大腸桿菌中表達(dá)真核基因或本身所含核糖體結(jié)合位點(diǎn)較弱的原核基因，則必須從外部同時提供啟動子和有效的點(diǎn)較弱的原核基因，則必須從外部同時提供啟動子和有效的核糖體結(jié)位點(diǎn)。核糖體結(jié)位點(diǎn)。翻譯起始密碼子翻譯起始密碼子起始密碼子是翻譯的起始位點(diǎn)，通常為起始密碼子是翻譯的起始位點(diǎn)，通常為AUG（ATG），編），編碼甲硫氨酸（碼甲硫氨酸（MET），），是首選的起始密碼子是首選的起始密碼子。也有極少數(shù)生。也有極少數(shù)生物利用其它密碼子作為翻譯的起始位點(diǎn)，如物利用其它密碼子作為翻譯的起始位點(diǎn)，如GUG、UUG等。等。翻譯終止密碼子翻譯終止密碼子翻譯

48、終止密碼子與核糖體相遇時，能使核糖體從翻譯終止密碼子與核糖體相遇時，能使核糖體從mRNA模模板上脫落下來，終止蛋白質(zhì)的翻譯過程。板上脫落下來，終止蛋白質(zhì)的翻譯過程。在大腸桿菌中，合成多肽鏈的釋放由在大腸桿菌中，合成多肽鏈的釋放由RF1和和RF2兩個釋放因兩個釋放因子所調(diào)控，子所調(diào)控， RF1識別終止密碼識別終止密碼UAA和和UAG， 而而RF2識別終止密識別終止密碼碼UAA和和UGA，由于，由于UAA同時為兩個釋放因子所識別，一般同時為兩個釋放因子所識別，一般被選作翻譯的終止密碼。被選作翻譯的終止密碼。在實(shí)際應(yīng)用中，為了保證翻譯的有效終止，通常將幾個終在實(shí)際應(yīng)用中，為了保證翻譯的有效終止，通常

49、將幾個終止密碼串連在一起。具報道，在大腸桿菌中以四個核苷酸組成止密碼串連在一起。具報道，在大腸桿菌中以四個核苷酸組成的順式序列的順式序列UAAU作為作為終止密碼終止密碼，可有效地終止多肽鏈的合成。，可有效地終止多肽鏈的合成。不同生物基因組甚至是同種生物不同蛋白質(zhì)的基因，所用不同生物基因組甚至是同種生物不同蛋白質(zhì)的基因，所用的密碼子都具有一定的的密碼子都具有一定的選擇性選擇性。有的密碼子在一種基因組中使。有的密碼子在一種基因組中使用的頻率高，被稱為用的頻率高，被稱為主密碼子主密碼子，而在另一種基因組中使用的頻，而在另一種基因組中使用的頻率較低，被稱為率較低，被稱為罕用密碼子罕用密碼子。如果外源目

50、的基因如果外源目的基因mRNA的主密碼子和受體細(xì)胞基因組的的主密碼子和受體細(xì)胞基因組的主密碼子相同或接近，則該基因的表達(dá)效率就高；反之，若外主密碼子相同或接近，則該基因的表達(dá)效率就高；反之，若外源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)水平就低。因此，在構(gòu)源基因含有較多的罕用密碼子，其表達(dá)水平就低。因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時，要考慮所表達(dá)基因的種類和性質(zhì)，或建大腸桿菌表達(dá)載體時，要考慮所表達(dá)基因的種類和性質(zhì)，或?qū)ν庠椿虻膲A基進(jìn)行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列對外源基因的堿基進(jìn)行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。6.3.1.2 宿主菌宿主菌重組異源蛋白在大腸桿菌

51、中不穩(wěn)定的原因：重組異源蛋白在大腸桿菌中不穩(wěn)定的原因：大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)；大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工和蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)；大腸桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)大腸桿菌不具備類似真核細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定因子；定因子；大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度的微環(huán)大量的異源重組蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中形成高濃度的微環(huán)境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。境，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用增強(qiáng)。常見的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株常見的大腸桿菌基因表達(dá)受體菌株菌株 基因型 啟動子 BL21 hsd S gal T7 噬菌體 HMS174 recA1 hsdR rif

52、r T7 噬菌體 lacZ trpA rpsL 噬菌體 PL M5219 RB791 W3110 lacIq L8 lac, tac 6.3.1.3 常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)常見的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)Lac和和Tac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)：是以：是以lac操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)操縱子調(diào)控機(jī)制為基礎(chǔ)設(shè)計和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。設(shè)計和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)。PL和和PR表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)：是以：是以噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子噬菌體早期轉(zhuǎn)錄啟動子PL和和PR構(gòu)建的。構(gòu)建的。T7表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)：是利用大腸桿菌：是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能力。元件構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，它具有很高的表達(dá)能

53、力。6.3.1.4 外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式外源基因在大腸桿菌表達(dá)的形式表達(dá)形式表達(dá)形式：不溶性蛋白不溶性蛋白和和可溶性蛋白可溶性蛋白兩種。兩種。包涵體蛋白包涵體蛋白包涵體包涵體：在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中：在一定條件下，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱積累并致密地集中在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。為包涵體。包涵體存在部位包涵體存在部位：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞周質(zhì)包涵體包涵體的組成的組成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)非蛋白質(zhì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物外源基因的表達(dá)產(chǎn)物：占大部分，具有正占大部分，具有正確的氨基酸序列，

54、但空間構(gòu)相錯誤，因而包涵確的氨基酸序列，但空間構(gòu)相錯誤，因而包涵體蛋白一般體蛋白一般沒有生物學(xué)活性沒有生物學(xué)活性。受體細(xì)胞本身的表達(dá)產(chǎn)物受體細(xì)胞本身的表達(dá)產(chǎn)物：如如RNA聚合聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達(dá)載體編碼酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表達(dá)載體編碼的蛋白等。的蛋白等。：包括包括DNA、RNA和脂多糖等和脂多糖等。包涵體形成的本質(zhì)包涵體形成的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集，主要包括是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷聚集，主要包括三個方面：三個方面：折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)的聚集作用；蛋白質(zhì)折疊中間體的作用。蛋白質(zhì)折疊中間體

55、的作用。融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白一起，但不改變兩個基因的閱讀框，以這種方式表達(dá)的蛋白稱為融合蛋白。稱為融合蛋白。*融合蛋白與單獨(dú)表達(dá)的外源蛋白相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：融合蛋白與單獨(dú)表達(dá)的外源蛋白相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好；穩(wěn)定性好；表達(dá)效率高；表達(dá)效率高；較易于分離純化。較易于分離純化。寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時，將多個外源目的蛋白基因在構(gòu)建外源蛋白表達(dá)載體時，將多個外源目的蛋白基因串連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋串

56、連在一起，克隆在質(zhì)粒載體上，以這種方式表達(dá)的外源蛋白稱為白稱為寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白。外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：多表達(dá)單元的重組：多表達(dá)單元的重組：每個表達(dá)單元都含獨(dú)立的啟動子、終止子、每個表達(dá)單元都含獨(dú)立的啟動子、終止子、SD序序列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串連翻譯的表達(dá)單元。表達(dá)的列、起始密碼和終止密碼，形成獨(dú)立轉(zhuǎn)錄與串連翻譯的表達(dá)單元。表達(dá)的外源蛋白不需經(jīng)過裂解處理。該方式適合表達(dá)外源蛋白不需經(jīng)過裂解處理。該方式適合表達(dá)相對分子質(zhì)量較大相對分子質(zhì)量較大的蛋白。的蛋白。多順反子重組多順反子重組：多拷貝外源基因有各自的多拷

57、貝外源基因有各自的SD序列、翻譯起始和終止信序列、翻譯起始和終止信號，但轉(zhuǎn)錄是在共同的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子控制下進(jìn)行的，表達(dá)的外源蛋號，但轉(zhuǎn)錄是在共同的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子控制下進(jìn)行的，表達(dá)的外源蛋白分子是相互獨(dú)立的。該方式適合表達(dá)白分子是相互獨(dú)立的。該方式適合表達(dá)中等大小分子量中等大小分子量的外源蛋白。的外源蛋白。多編碼序列重組多編碼序列重組：將多個外源基因串連在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控將多個外源基因串連在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、翻譯起始與終止密碼子，在各編碼序列的接口引入蛋白酶酶切位點(diǎn)元件、翻譯起始與終止密碼子，在各編碼序列的接口引入蛋白酶酶切位點(diǎn)或可被化學(xué)斷裂的位點(diǎn)。該方式特別適合表達(dá)

58、外源或可被化學(xué)斷裂的位點(diǎn)。該方式特別適合表達(dá)外源小分子小分子蛋白或多肽。蛋白或多肽。整合型外源蛋白整合型外源蛋白將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的將要表達(dá)的外源基因整合到染色體的非必需編碼區(qū)非必需編碼區(qū)上，上，使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表使之成為染色體結(jié)構(gòu)的一部分而穩(wěn)定地遺傳，以此種方式表達(dá)的外源蛋白即為達(dá)的外源蛋白即為整合型外源蛋白整合型外源蛋白。實(shí)現(xiàn)外源基因與宿主染色體整合是根據(jù)實(shí)現(xiàn)外源基因與宿主染色體整合是根據(jù)DNA同源交換同源交換的原理的原理，因此在待整合的外源基因兩側(cè)必須分別組合一段與，因此在待整合的外源基因兩側(cè)必須分別組合一段與染色體染色體DNA完全同源的序列

59、。此外，還必須將可控的表達(dá)完全同源的序列。此外，還必須將可控的表達(dá)元件和選擇標(biāo)記基因連接在一起。元件和選擇標(biāo)記基因連接在一起。為獲得含整合基因的重組體，被選擇的載體一般是那些在為獲得含整合基因的重組體，被選擇的載體一般是那些在受體細(xì)胞內(nèi)不能自主復(fù)制或溫度敏感型質(zhì)粒。那么當(dāng)外源基因受體細(xì)胞內(nèi)不能自主復(fù)制或溫度敏感型質(zhì)粒。那么當(dāng)外源基因被交換到染色體上后，由于宿主菌的不斷分裂和增殖，細(xì)胞內(nèi)被交換到染色體上后，由于宿主菌的不斷分裂和增殖，細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒逐漸被稀釋直至消失。外源基因整合到染色體上后雖只的質(zhì)粒逐漸被稀釋直至消失。外源基因整合到染色體上后雖只含有單拷貝，但在合適的條件下仍能高效表達(dá)外源蛋白。

60、含有單拷貝，但在合適的條件下仍能高效表達(dá)外源蛋白。分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過運(yùn)輸或分泌的方式穿過細(xì)胞外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，通過運(yùn)輸或分泌的方式穿過細(xì)胞的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中，即為的外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中，即為分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表達(dá)時，須在外源蛋白以分泌型蛋白表達(dá)時，須在N端加入端加入1530個個氨基酸組成的氨基酸組成的信號肽（信號肽（signal peptides）序列。信號肽序列。信號肽N端的端的最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部為疏水氨基酸，最初幾個氨基酸為極性氨基酸，中間和后部為疏水氨基酸，它們對蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞膜外起決定性作用。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)