薄板層析法鑒定四環(huán)素純PPT課件

1、生物分離工程實(shí)驗(yàn)生物分離工程實(shí)驗(yàn)I 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)：第第11/12周周薄板層析法鑒定四環(huán)素成品純度薄板層析法鑒定四環(huán)素成品純度第第14周周PEG400/(NH4)2SO4兩水兩水相系統(tǒng)相圖的制作相系統(tǒng)相圖的制作第第15周周兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測定兩水相系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測定第第16周周離子交換樹脂總交換容量的測定離子交換樹脂總交換容量的測定第1頁/共23頁實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及時間實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及時間u薄板層析法鑒定四環(huán)素純度薄板層析法鑒定四環(huán)素純度 實(shí)驗(yàn)一班：第11周 周一，周四 實(shí)驗(yàn)二班：第12周 周一，周四u兩水相萃取相圖制作兩水相萃取相圖制作 實(shí)驗(yàn)一班：第14周 周一 實(shí)驗(yàn)二班：第14周

2、 周四u兩水相萃取蛋白質(zhì)分配系數(shù)測定兩水相萃取蛋白質(zhì)分配系數(shù)測定 實(shí)驗(yàn)一班：第15周 周一 實(shí)驗(yàn)二班：第15周 周四u離子交換樹脂總交換容量的測定離子交換樹脂總交換容量的測定 實(shí)驗(yàn)一班：第16周 周一 實(shí)驗(yàn)二班：第16周 周四第2頁/共23頁實(shí)驗(yàn)時間安排表實(shí)驗(yàn)時間安排表周次日期星期時間發(fā)酵實(shí)驗(yàn)5-212分離實(shí)驗(yàn)5-112115月6日星期一13:30實(shí)驗(yàn)一班5月9日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班125月13日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班5月16日星期四13:30實(shí)驗(yàn)二班135月20日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班5月23日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班145月27日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班5月30日星期四13

3、:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班156月3日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班6月6日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班166月8日星期六13:30實(shí)驗(yàn)二班實(shí)驗(yàn)一班6月13日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班實(shí)驗(yàn)二班176月17日星期一13:30實(shí)驗(yàn)二班6月20日星期四13:30實(shí)驗(yàn)一班第3頁/共23頁考核方式考核方式 考勤考勤提問和操作提問和操作實(shí)驗(yàn)報告：實(shí)驗(yàn)報告：預(yù)習(xí)報告預(yù)習(xí)報告 實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論、思考題實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論、思考題第4頁/共23頁第5頁/共23頁u 加深對薄板層析法基本原理的理解。u 熟悉薄板層析法的操作過程。u 采用薄板層析法來考察四環(huán)素制品純度。一、目的和要求一、目的和要求第6頁/共23頁（一）層析

4、：色譜 chromatographyu 一種分離技術(shù)。u 任何層析都具有兩個相，固定相固定不動，流動相對固定相作相對運(yùn)動。u 不同物質(zhì)在兩相間分配差異，隨流動相以不同的速度沿固定相移動，最終達(dá)到分離的效果。 固定相：固體或液體( (固定在載體上) ) 流動相：流過固定相的液體、氣體或超臨界流體。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理第7頁/共23頁（二）層析方法：根據(jù)機(jī)理可以分為： 分配層析 吸附層析 凝膠層析 離子交換層析 親和層析二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理根據(jù)層析的方式：紙層析薄層層析柱層析第8頁/共23頁（三）薄板層析（TLC）u利用不同溶質(zhì)組分在固定相和流動相的利用不同溶質(zhì)組分在固定相和流動相的兩種液

5、體兩種液體中中分配系數(shù)不同，展層時形成以不同速度移動的區(qū)帶，分配系數(shù)不同，展層時形成以不同速度移動的區(qū)帶，達(dá)到分離。達(dá)到分離。 溶質(zhì)易分配在固定相中溶質(zhì)易分配在固定相中 溶質(zhì)易分配在流動相中溶質(zhì)易分配在流動相中 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理移動速度慢。移動速度慢。移動速度快。移動速度快。第9頁/共23頁 利用阻滯因子Rf值來表征各組分的差別移動：0 Rf 1,適宜范圍0.20.8二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 溶質(zhì)移動距離 同一時間流動相移動距離Rf=第10頁/共23頁二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理固定相：一般為水及各種水溶液、甲酰胺、低級醇等。流動相（展層劑）：與水不溶（或微溶）的有機(jī)溶劑。 薄板層析法：支

6、持物:中性、多孔粉末、無吸附活性、流動相自由通過 硅藻土/纖維素/硅膠/氧化鋁等，親水物質(zhì)能儲留水。第11頁/共23頁（四）四環(huán)素 廣譜抗生素廣譜抗生素 四環(huán)素發(fā)酵或保管不當(dāng)時，生成抗菌作用弱，毒性強(qiáng)的四環(huán)素發(fā)酵或保管不當(dāng)時，生成抗菌作用弱，毒性強(qiáng)的差向四環(huán)素。差向四環(huán)素。 四環(huán)素易溶于流動相液體，差向四環(huán)素易溶于固定相液四環(huán)素易溶于流動相液體，差向四環(huán)素易溶于固定相液體。體。 氫化駢四苯環(huán)氫化駢四苯環(huán) （含共軛雙鍵，可紫外吸收，熒光（含共軛雙鍵，可紫外吸收，熒光） 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理第12頁/共23頁本實(shí)驗(yàn)所需儀器 玻璃板 研缽 天平 移液管 硅藻土 EDTA緩沖液 飽和氯化銨缸+架子

7、u展層劑u展層缸u(yù)點(diǎn)樣毛細(xì)管u小刀和直尺u紫外燈u氨水三、主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑三、主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑第13頁/共23頁（一）溶液配制（已配置）1. 硅藻土處理： 取薄板層析用硅藻土50g，加25ml濃鹽酸和250ml水，攪拌煮沸10min，冷卻，過濾，用蒸餾水洗，直至洗液對剛果紅指示劑不顯顏色，然后用流動相液體洗滌，過濾，105烘箱干燥。2. EDTA緩沖液（固定相）：在40ml甘油中，加入10ml聚乙二醇400，搖勻即得20%（V/V）聚乙二醇400的甘油溶液（保濕），再加入950ml pH7 0.1M EDTA（鰲合）溶液，混勻即得EDTA緩沖液。3. 展層劑（流動相）：取pH7 EDTA溶

8、液5ml，緩慢加在200ml（丙酮:氯仿:乙酸乙酯=3:1:1）溶液中，然后倒入展層缸中。4. 樣品配制：稱取100mg成品四環(huán)素，溶于5ml甲醇中得2%（W/V）溶液。四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法第14頁/共23頁硅藻土硅藻土 1g 研缽研缽EDTA緩沖液緩沖液2ml蒸餾水蒸餾水0.75ml研勻（顆粒適中、無氣泡）研勻（顆粒適中、無氣泡）置飽和NH4Cl缸室溫放置室溫放置無明顯水漬無明顯水漬厚度涂均勻，厚度涂均勻，特別下邊緣涂滿平整特別下邊緣涂滿平整（二）層析操作四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法第15頁/共23頁第16頁/共23頁0.5cm15cm1.5cm均勻均勻無氣泡無氣泡無裂紋無裂紋毛細(xì)管點(diǎn)樣毛細(xì)

9、管點(diǎn)樣點(diǎn)樣點(diǎn)甲醇揮發(fā)點(diǎn)樣點(diǎn)甲醇揮發(fā)干后，將板放入干后，將板放入展層缸內(nèi)，密封展層缸內(nèi)，密封晾干，氨氣熏，晾干，氨氣熏，紫外燈下觀察紫外燈下觀察分別求兩種分別求兩種組分的組分的Rf值值量距離量距離展層劑展層劑0.5cm 溶質(zhì)移動距離 同一時間流動相移動距離Rf=第17頁/共23頁第18頁/共23頁操作注意點(diǎn)操作注意點(diǎn) 制板：1.在研缽中研磨時應(yīng)緩慢，注意不能產(chǎn)生氣泡。2.薄板移入飽和氯化銨的缸中時，不宜太干或太濕，以無明顯水漬為宜。太干展層太快，引起拖尾；太濕展層太慢。 點(diǎn)樣：3.點(diǎn)樣時，盡量使點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑小。4.點(diǎn)樣后，待溶劑揮發(fā)后再移入展層缸內(nèi)，不要用電吹風(fēng)。 展層：3.注意展層劑浸沒薄層的一端約0.5cm，不能浸沒樣品斑點(diǎn)。4.層析缸蓋子應(yīng)蓋密，減少溶劑揮發(fā)。第19頁/共23頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論（一）預(yù)習(xí)1.四環(huán)素的硅藻土薄板層析屬于哪一種層析機(jī)制。固定相和流動相分別是什么？2.為了使層析效果好（不拖尾，分離好），操作中注意事項(xiàng)。（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論1.在紙上描繪出薄板上斑點(diǎn)的圖形，量出各斑點(diǎn)組分的距離，計算Rf值。2.分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.總結(jié)本實(shí)驗(yàn)成功或失敗的經(jīng)驗(yàn)