北京市手足口病預防控制指南

1、關于下發(fā)“北京市手足口病預防控制指南（2010版）”的請示北京市衛(wèi)生局：按照往年手足口病的流行規(guī)律，2010年5月份，北京市將進入手足口病的流行季節(jié)，為了盡早做好我市手足口病防控工作的技術儲備，規(guī)范相關工作要求，我中心以衛(wèi)生部下發(fā)的手足口病預防控制指南（2009版）以及2008年市衛(wèi)生局印發(fā)的北京市手足口病防控應急預案為依據(jù)，結合最新工作需求，制定了北京市手足口病預防控制指南（2010版），望能夠下發(fā)各單位遵照執(zhí)行，妥否，請批示。北京市疾病預防控制中心2010年3月11日北京市手足口病預防控制指南（2010版）手足口病是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼兒發(fā)病為主。大多數(shù)患者癥狀輕微，以發(fā)

2、熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征。少數(shù)患者可并發(fā)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，個別重癥患兒病情進展快，易發(fā)生死亡。引起手足口病的腸道病毒包括腸道病毒71型（EV71）和A組柯薩奇病毒（CoxA）、埃可病毒（Echo）的某些血清型。EV71感染引起重癥病例的比例較大。腸道病毒傳染性強，易引起暴發(fā)或流行。為更好的進行北京市手足口病防控工作，特根據(jù)國家相關方案，制定本預防控制指南。一、目的1、為疫情定性和應急處理提供病原學證據(jù)，了解北京市手足口病病原分布情況。2、指導醫(yī)療機構準確開展手足口病的臨床診斷和疫情報告，減少誤報和漏報。3、指導相關單位開展手足口病聚集

3、性病例和暴發(fā)疫情監(jiān)測，并采取及時有效的控制措施。二、病例定義（一）臨床診斷病例。在流行季節(jié)發(fā)病，常見于學齡前兒童，嬰幼兒多見。1普通病例：發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無發(fā)熱。2重癥病例：出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累、呼吸及循環(huán)功能障礙等表現(xiàn)，實驗室檢查可有外周血白細胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線、超聲心動圖檢查可有異常。極少數(shù)重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結合實驗室檢測做出診斷。若無皮疹，臨床不宜診斷為手足口病。（二）實驗室確診病例。臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實驗室確診病例：1自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾

4、、淋巴結等組織標本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導致手足口病的人腸道病毒）。2自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標本中檢測到CVA16 或EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結等組織標本等標本中檢測到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據(jù)表明可以導致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。3血清標本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度1256，或急性期與恢復期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高。（三）聚集性病例。1周內，同一托幼機構或學校等集體單位發(fā)生5例及以上手足口病病例；或同一班級（或宿舍）發(fā)生2例及以上手足口

5、病病例；或同一自然村發(fā)生3例及以上手足口病病例；或同一家庭發(fā)生2例及以上手足口病病例。（四）暴發(fā)疫情暴發(fā)疫情：在幼兒園、學校等集體單位的同一宿舍或者同一班級，1天內有3例或者連續(xù)3天內有5例以上患病，并有手足口病相關癥狀。三、疾病監(jiān)測（一）疫情報告。1個案報告。各級各類醫(yī)療機構應按照中華人民共和國傳染病防治法和傳染病信息報告管理規(guī)范的有關規(guī)定，對符合病例定義的手足口病病例進行報告。如為重癥病例，請在“重癥患者”處選擇“是”；如為實驗室診斷病例，請在“實驗室結果”處選擇相應的腸道病毒病原學分型信息。實行網(wǎng)絡直報的醫(yī)療機構應于24小時內進行網(wǎng)絡直報，未實行網(wǎng)絡直報的醫(yī)療機構應于24小時之內寄送出傳

6、染病報告卡。2聚集性病例或暴發(fā)疫情報告。托幼機構和學校、醫(yī)療機構發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例或暴發(fā)疫情時，應以最快的方式向各區(qū)縣疾控中心報告；同時在手足口病流行期間，各區(qū)縣疾控中心應安排專人負責審網(wǎng)，及時發(fā)現(xiàn)聚集性病例或暴發(fā)疫情，及時處理。（二）病原學監(jiān)測1采樣：所有病例的采樣均由相應醫(yī)療機構完成，各醫(yī)療機構必須配合各區(qū)縣疾控中心的現(xiàn)場調查及采樣工作。所采樣本交區(qū)（縣）疾控中心送檢，檢測完畢后24小時內，由疾控中心對病例的傳染病報告卡信息進行訂正，將病例類型訂正為“實驗室診斷”，并在“實驗室結果”處補填腸道病毒病原學分型信息。各種標本采集和檢測方法詳見手足口病標本采集及檢測技術方案（附件1）。2監(jiān)測

7、點和監(jiān)測量：各區(qū)縣疾控中心各設立1-2個監(jiān)測點，每月分別采集首次就診的普通病例標本5人份（可每人采集一種或多種標本），如病例數(shù)不到5例，則全部采集，送本中心實驗室開展腸道病毒檢測，填寫“區(qū)縣手足口病原學監(jiān)測報表”（附表1）。西城疾控中心還需每周采集5份首次就診的普通病例標本送市CDC開展檢測及病毒分離工作。3重癥和死亡病例：每個病例均必須采集標本，可以是1種或多種標本，同時采雙份血清送檢，可以采集兒童密切接觸者的糞便標本送檢。除血清外的標本，由本區(qū)縣疾控中心檢測，檢測結果應及時報告，并填入“區(qū)縣手足口病原學監(jiān)測報表”。血清由北京CDC轉送國家CDC檢測。4.聚集性病例和暴發(fā)疫情：調查中必須對每

8、起疫情采集3到5人的標本（可以每人采集1種或多種標本），暴發(fā)疫情還需采集首發(fā)或指示病例的雙份血清標本，可以采集兒童密切接觸者的糞便標本。除血清外的標本，均送本區(qū)縣疾控中心檢測，檢測結果應及時報告，并填入“區(qū)縣手足口病原學監(jiān)測報表”。血清由北京CDC轉送國家CDC檢測。5病毒分離：北京市疾控中心將每月開展上送病例標本的實驗室檢測及病毒分離工作，同時請東城、懷柔、宣武、西城區(qū)對本轄區(qū)所有檢測陽性的標本開展病毒分離工作，至少每月上送2株毒株到市CDC。6傳染源的管理：傳染源管理時限為自患兒被發(fā)現(xiàn)起至癥狀消失后1周。托幼機構一周內一個班級發(fā)生2例手足口病病例，可執(zhí)行停班措施；一周內，同一托幼機構、學校

9、等集體單位中發(fā)生20例以上的手足口病例、或發(fā)生2例以上重癥病例，可執(zhí)行停園措施。四預防控制（一）現(xiàn)場調查處置。發(fā)現(xiàn)手足口病聚集性病例、暴發(fā)疫情、重癥或死亡時，縣（區(qū)）級及以上疾病預防控制機構要立即組織開展現(xiàn)場調查處置。1流行病學調查。（1）聚集性病例調查：了解聚集性病例的臨床表現(xiàn)、流行特征，以分析流行因素，為采取防控措施提供依據(jù)。要對病例開展流行病學調查，填寫手足口病個案調查表（附表2）。（2）重癥或死亡病例調查：每個病例均需開展流行病學調查，詳細了解病例的基本信息、臨床癥狀、發(fā)病就診治療過程、感染傳播情況、病原檢測結果，以分析重癥及死亡病例的主要危險因素，填寫手足口病重癥或死亡病例個案調查表

10、（附表3），調查結束后錄入統(tǒng)一數(shù)據(jù)庫。（3）醫(yī)療機構要協(xié)助疾病預防控制機構對病例進行流行病學調查。2傳染源的管理。患兒應及時就醫(yī)，并遵醫(yī)囑采取居家或住院方式進行治療。居家患兒，家長或監(jiān)護人應在社區(qū)（村）醫(yī)生的指導下，密切關注患兒的病情變化，如發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等相關癥狀時，應立即送醫(yī)院就診，同時，要盡量避免與其他兒童接觸。住院患兒應在指定區(qū)域內接受治療，防止與其他患兒發(fā)生交叉感染。管理時限為自患兒被發(fā)現(xiàn)起至癥狀消失后1周。鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院/社區(qū)衛(wèi)生服務中心、村衛(wèi)生室/社區(qū)衛(wèi)生服務站等負責本轄區(qū)居家治療的手足口病患兒的隨訪工作，掌握居家治療患兒的病情進展情況。3消毒措施。病家、托幼機構和

11、小學的消毒應在當?shù)丶膊☆A防控制機構的指導下，由單位及時進行消毒，或由當?shù)丶膊☆A防控制機構負責對其進行消毒處理。醫(yī)療機構的消毒由醫(yī)療機構安排專人進行。4健康教育。各級醫(yī)療衛(wèi)生機構應在政府領導下，與當?shù)亟逃?、宣傳、廣電等部門密切合作，開展形式多樣的手足口病防治知識的宣傳工作。與重癥或死亡病例發(fā)病前1周或發(fā)病后有共同生活、居住史的5歲以下兒童，要對其家長或監(jiān)護人進行健康教育，做好兒童的密切觀察，出現(xiàn)癥狀要及時就診和治療。（二）重點人群及重點機構的預防控制措施。1散居兒童的預防控制措施。（1）飯前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等給兒童洗手；看護人接觸兒童前、替幼童更換尿布、處理糞便后均要洗手；（2）

12、嬰幼兒的尿布要及時清洗、曝曬或消毒；注意保持家庭環(huán)境衛(wèi)生，居室要經(jīng)常通風，勤曬衣被；（3）嬰幼兒使用的奶瓶、奶嘴及兒童使用的餐具使用前后應充分清洗、消毒；不要讓兒童喝生水、吃生冷食物；（4）本病流行期間不宜帶兒童到人群聚集、空氣流通差的公共場所；避免接觸患病兒童；（5）兒童出現(xiàn)發(fā)熱、出疹等相關癥狀要及時到醫(yī)療機構就診；（6）居家治療的患兒避免與其他兒童接觸，以減少交叉感染；父母要及時對患兒的衣物進行晾曬或消毒，對患兒糞便及時進行消毒處理。2托幼機構預防控制措施。（1）每日進行晨檢，發(fā)現(xiàn)可疑患兒時，要采取立即送診、居家觀察等措施；對患兒所用的物品要立即進行消毒處理；（2）一周內，同一托幼機構、學

13、校等集體單位中發(fā)生20例以上手足口病例，或發(fā)生2例以上重癥病例，根據(jù)疾病預防控制機構的建議，關閉2周或對涉及的年級停課2周。（2）出現(xiàn)重癥或死亡病例，或1周內同一班級出現(xiàn)2例及以上病例，建議病例所在班級停課10天；1周內累計出現(xiàn)10例及以上或3個班級分別出現(xiàn)2例及以上病例時，經(jīng)風險評估后，可建議托幼機構停課10天；（3）教育、指導兒童養(yǎng)成正確洗手等良好的衛(wèi)生習慣；老師要保持良好的個人衛(wèi)生狀況；（4）教室和宿舍等場所要保持良好通風；定期對玩具、兒童個人衛(wèi)生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品進行清洗消毒；（5）定期對活動室、寢室、教室、門把手、樓梯扶手、桌面等物體表面進行擦拭消毒；（6）托幼機構應每

14、日對廁所進行清掃、消毒，工作人員應戴手套，工作結束后應立即洗手；（7）托幼機構應配合衛(wèi)生部門采取手足口病防控措施。3醫(yī)療機構的預防控制措施。（1）各級醫(yī)療機構應加強預檢分診，專辟診室（臺）接診發(fā)熱、出疹的病例。增加候診及就診等區(qū)域的清潔消毒頻次，室內清掃時應采用濕式清潔方式；（2）醫(yī)務人員在診療、護理每一位病例后，均應認真洗手或對雙手消毒，或更換使用一次性手套；（3）診療、護理手足口病病例過程中所使用的非一次性儀器、體溫計及其他物品等要及時消毒；（4）對住院患兒使用過的病床及桌椅等設施和物品必須消毒后才能繼續(xù)使用；（5）患兒的呼吸道分泌物和糞便及其污染的物品要進行消毒處理。五結果報送各區(qū)縣在每

15、月的前5個工作日內，通過OA將區(qū)縣手足口病原學監(jiān)測報表、手足口病重癥或死亡病例個案調查表報送給市疾控中心腸道組。各區(qū)縣每月的前5個工作日內，將上月所有未分型標本、混合感染陽性標本、重癥和死亡病例中的陽性標本，以及每起暴發(fā)疫情的1件陽性標本上送市CDC，要求每件標本量不少于1.0ml。年終各區(qū)縣將采集到的血清標本送市CDC。附件1：手足口病標本采集及檢測技術方案附件2：手足口病疫源地消毒指南附表1：區(qū)縣手足口病原學監(jiān)測報表附表2：手足口病個案調查表附表3：手足口病重癥或死亡病例個案調查表北京市疾病預防控制中心2010年3月11日附件1 手足口病標本采集及檢測技術方案一、采集標本的種類、保存和運輸

16、（一）糞便標本。采集病人發(fā)病3日內的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5-8g/份，采集后立即放入無菌采便管內，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽，4暫存12小時內送達實驗室，-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70冰箱。（二）咽拭子標本。采集病人發(fā)病3日內的咽拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4暫存并在12小時內送達實驗室，-20以下低

17、溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70冰箱。（三）血清標本。各省（區(qū)、市）在手足口病流行年份中均應采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動態(tài)變化，評價血清學抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。將血清置于-20以下冰箱中冷凍保存。（四）皰疹液。在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時采集多個皰疹作

18、為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周圍的皮膚進行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。所采集標本4暫存立即（12h內）送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。（五）肛拭子標本。采集病人發(fā)病3日內的肛拭子標本，用于病原檢測。用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數(shù)下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有35ml保存液（含5%牛血清細胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶

19、有唯一識別號碼的標簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。（六）尸檢標本。采集腦、肺和腸淋巴結等重要組織標本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應多部位取材，每部位應取2-3份約5-10g的組織，淋巴結2個，分別置于15ml-50ml無菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。（七）腦脊液標本。出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的病例，可采集腦脊液標本，進行病毒分離或核酸檢測。采集時間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3天內，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4暫存立即(12h內)送達實驗室，20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于70冰箱。但E

20、V71感染神經(jīng)系統(tǒng)時，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。臨床標本在運輸和貯存過程中要避免反復凍融。標本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時內送達實驗室。依照人間傳染的病原微生物名錄，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標本按B類包裝，置于冷藏保存盒內運輸，盡量縮短運輸時間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運輸方式，但在運輸過程中應采取保護措施，避免強烈震動、重力擠壓等現(xiàn)象。在送到省、地、市級CDC實驗室時，包裝盒內應帶冰且包裝完整。在上送標本的同時，需附帶相關的手足口病病例臨床標本采樣登記表。二、標本采集注意事項在手足口病的實驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無

21、菌拭子要放在標本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學診斷的標本采集與病毒分離標本的采集方法一樣。為了保證檢測結果的準確性和有效性，標本應在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。對于血清學診斷，急性期血清應該在發(fā)病后盡早采集，恢復期血清在發(fā)病兩周后采集。標本保存液的配置見下表：保存液Eagles液(MEM)80.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml胎牛血清5.0ml7.5%NaHCO3溶液3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）10ml三、實驗室檢測操作流程（一）病毒分離。1.試劑配置（1）細胞的生長液、維持液的配制見下表：生長液（GM）維持液（MM）E

22、agles液(MEM)86.5ml92.5ml3%L-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5ml青、鏈霉素（各10000U/ml）1.0ml1.0ml（2）糞便標本和肛拭子的處理液完全PBS液中加入PS溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100g/ ml。完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。A液：試劑品名加入量NACL8.00gKCL0.20gNa2HPO4(無水)0.91gKH2PO40.12g用600800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補至1000ml，10psi（

23、70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。B液：試劑品名加入量MgCl2.6H2O0.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。C液： 試劑品名加入量CaCl20.10g溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。2病毒分離細胞系許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長。對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標本均需接種到以下兩種細胞系： RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。 HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。3標本的處理（1）糞便標本和肛拭子的處理操

24、作步驟：1）在離心管上標記標本號；2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；3）在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致）；肛拭子為2ml；4）剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于20；5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；7）在生物安全柜中將每1份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理1次）；8） 1管糞便懸液凍存于20作為備份，另1管存于4-8以備接種。（2）皰疹液標本

25、的處理皰疹液標本通常直接用于RNA提取或病毒分離。（3）腦脊液標本的處理腦脊液標本通常直接用于病毒分離。（4）咽拭子標本的處理咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。4接種和觀察（病毒分離）（1）通常使用ml的斜面試管培養(yǎng)細胞，傳細胞時，每管加細胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康、無污染的。一個健康的單層細胞會在傳代后48

26、小時左右形成；（2）倒掉生長液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；（3）每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養(yǎng)管（包括標本的編號、日期、傳代數(shù)）；（4）每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；（5）每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度要求36。（或者使用吸附的方法接種病毒：接種標本前，倒掉生長液（GM），每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度為36；吸附1小時后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標本需同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞。（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出

27、現(xiàn)（如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；（7）記錄接種管和對照管細胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+4+）、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+， Ct值35.0的樣本為臨界值。Ct值38.0的樣本或無數(shù)值的標本為陰性。（2） One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）雙通道可以同時檢測EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時間(2.5小時)內檢測到標本中是否含EV71或CVA16核酸。反應體系配置反應體系共25l，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5l模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系

28、及條件隨之變化。a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置25l反應體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應體系配置如下表： b.將下述反應液混勻離心后，按照每管20L分裝于適用的PCR管中。試劑組成1份樣品的量熒光RT-PCR反應液12.5l逆轉錄酶0.5lTaq酶0.5l引物和探針3lH2O 3.5lc.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據(jù)樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足。總反應體積25L。熒光RT-PCR循環(huán)條件設置程序循環(huán)數(shù)溫度（攝氏度）反應時間11

29、4230 min21952 min3409510 s6035 s60時收集熒光信號結果分析條件設定和結果判斷陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本。陽性對照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據(jù)儀器噪音情況進行調整。Ct值35.0的樣本為陽性。Ct值無數(shù)值的標本和Ct值38.0的樣本為陰性樣本。38.0 Ct值35.0的樣本為臨界值。注：熒光PCR同時讀取FAM和HEX，進行雙通道檢測，F(xiàn)AM熒光Ct值為CVA16的結果，HEX熒光 Ct值為EV71的結果。四、生物安全根據(jù)2006年1月11日衛(wèi)生部制定的人間傳染

30、的病原微生物名錄，柯薩奇病毒、埃可病毒、EV71型和目前分類未定的其他腸道病毒均屬于危害程度第三類的病原微生物。因此在保證安全的前提下，對臨床和現(xiàn)場的未知樣本檢測操作可在生物安全II級或以上防護級別的實驗室進行，涉及病毒分離培養(yǎng)的操作，應加強個體防護和環(huán)境保護。操作糞便、腦脊液和血液等臨床標本時要特別注意生物安全，要在II級生物安全柜中進行標本處理、病毒分離和病毒鑒定，無脊灰疫苗免疫史的人員要進行脊灰疫苗免疫。滅活后的血清抗體檢測與PCR檢測可在生物安全I級實驗室進行。所有操作應遵守國家相關法律法規(guī)。附件2 手足口病疫源地消毒指南一、消毒原則(一)消毒范圍和對象：以病原體可能污染的范圍為依據(jù)確

31、定消毒范圍和對象，一般不必對室外環(huán)境開展大面積消毒，防止過度消毒現(xiàn)象的發(fā)生。（二）消毒持續(xù)時間：以手足口病流行情況和病原體監(jiān)測結果為依據(jù)確定消毒的持續(xù)時間。（三）消毒方法的選擇：應選擇中效或高效消毒劑如含氯（溴）消毒劑、碘伏、過氧乙酸、過氧化氫、二氧化氯、戊二醛和甲醛等進行消毒，并盡量避免破壞消毒對象的使用價值和造成環(huán)境的污染。（四）注意與其他傳染病控制措施配合：搞好飲用水、污水、食品的消毒及衛(wèi)生管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生及糞便無害化管理。必要時滅蠅、滅蚤、滅蟑螂后再消毒處理。加強易感人群的保護。二、消毒措施（一）隨時消毒。1隨時消毒是指對患兒污染的物品和場所及時進行的消毒處理?；純壕蛹抑委煹?，不可在傳染期前往托幼機構或學校，也不可與其他兒童接觸，患病期間應做好病家的隨時消毒。醫(yī)療機構應設立手足口病專門病區(qū)，患兒住院期間，做好隨時消毒。隨時消毒特別要注意下列物品和場所：分泌物或排泄物（糞便、皰疹液等）及其污染的場所和物品、生活用具、手、衣服、被褥、生活污水、污物。2醫(yī)護