海洋生物技術(shù)整理

1、v 第一章 海洋生物技術(shù)概論v 本章思考題v 1 什么是生物技術(shù)？生物技術(shù)的重要性體現(xiàn)在哪些方面？v 2 什么是海洋生物技術(shù)？海洋生物技術(shù)的研究重點都有哪些？ v 本章重點提示：生物技術(shù)的概念、內(nèi)容；生物技術(shù)的特點和重要性；海洋生物技術(shù)的定義及其研究內(nèi)容1. 生物技術(shù)(Biotechnology, BT), 又稱為生物工程（bioengineering), 現(xiàn)統(tǒng)一稱: 生物技術(shù)。1) 生物技術(shù)定義 i. 傳統(tǒng)定義：應(yīng)用生物科學(xué)及工程學(xué)原理，依靠生物體系作為反應(yīng)器，將物料進行加工改造，獲得人類所需產(chǎn)品的技術(shù)。ii. 現(xiàn)代生物技術(shù)定義： 以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ), 把生物體系與工程學(xué)技術(shù)有機結(jié)合在一起

2、，按照預(yù)先的設(shè)計，定向地在不同水平上改造生物遺傳性狀或加工生物原料, 產(chǎn)生對人類有用的新產(chǎn)品(或達到某種目的)的綜合性科學(xué)技術(shù)。2) 要點: 對象是具遺傳特性的生命類物質(zhì):包括病毒、細(xì)菌、植物、動物以及人類。 生物體系多個不同水平研究: 從大分子(DNA，RNA，蛋白質(zhì)，酶)、亞細(xì)胞、細(xì)胞、組織、器官到整個機體。 應(yīng)用工程學(xué)原理: 經(jīng)人類思維, 設(shè)計方案、定向修飾、加工制作過程、經(jīng)過體外環(huán)節(jié)。 有目的產(chǎn)品: 目的產(chǎn)品有三新特征: 新遺傳功能、新遺傳性狀、新物種。要有合乎人類所需的工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療和食品產(chǎn)品。 高新技術(shù)起重要作用。3) 生物技術(shù)的發(fā)展（包括傳統(tǒng)生物技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)）i. 傳統(tǒng)生

3、物技術(shù) l 傳統(tǒng)生物技術(shù)的特點： 主要通過微生物初級發(fā)酵獲得產(chǎn)品，局限在微生物發(fā)酵和化學(xué)工程領(lǐng)域。沒有改變微生物的遺傳物質(zhì)，也沒有產(chǎn)生新的遺傳性狀。生產(chǎn)過程簡單，上游主要是微生物的發(fā)酵培養(yǎng)及產(chǎn)品轉(zhuǎn)化，通過誘變選育良種；下游主要對產(chǎn)品進行純化。生產(chǎn)周期長，費用高，產(chǎn)量低，效率差。ii. 現(xiàn)代生物技術(shù) l 現(xiàn)代生物技術(shù)的四大支柱l 基因工程 （核心和關(guān)鍵、主導(dǎo)技術(shù)）、 細(xì)胞工程 （基礎(chǔ)）、 酶工程 （條件）、 發(fā)酵工程 （產(chǎn)品獲得手段）、生化工程 (分離、純化、衍生 )4）生物技術(shù)的特點 (八高一低) a) 高水平：即學(xué)科具有先進性，是知識、技術(shù)密集型產(chǎn)業(yè), 處分子水平、新技術(shù)前沿。b) 高綜合：

4、跨學(xué)科專業(yè), 位多學(xué)科發(fā)展的交叉點上，涉及的行業(yè)多、范圍廣。c) 高投入：與其他技術(shù)比較, 在資金、人員、設(shè)備、試劑及研發(fā)上投資大。d) 高競爭：各國、各行業(yè)、個單位之間，在技術(shù)、時效性、知識及人才上競爭激烈。e) 高風(fēng)險：上述原因造成一定風(fēng)險，加上技術(shù)風(fēng)險帶來高風(fēng)險。f) 高效益, 應(yīng)用性強, 有目的產(chǎn)品, 易商業(yè)化。 如干擾素的投入雖然高達數(shù)百萬美元,但產(chǎn)值數(shù)年達30億美元, 用于治病將產(chǎn)生巨大經(jīng)濟和社會效益。生物技術(shù)在解決人類面臨眾多難題上是沒有任何產(chǎn)業(yè)可比的。 g）高智力： 具有創(chuàng)新性和突破性, 可按人類需要定向改變和創(chuàng)造生物的遺傳特性，要求在人才、計劃、設(shè)計、工藝和產(chǎn)品上都要與眾不同

5、。從認(rèn)識、利用、再造階段上升到改造和創(chuàng)造階段。 h) 高控性：采用工程學(xué)手段，易自動化、程控化及連續(xù)化生產(chǎn) I ) 低污染：生物技術(shù)以生物資源為對象, 生物資源具有再生性, 是再生資源。具有不受限制、污染小、周期短的優(yōu)點。 5）生物技術(shù)的內(nèi)容醫(yī)學(xué)生物技術(shù)；藥學(xué)生物技術(shù)；動物生物技術(shù)；農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；海洋生物技術(shù)；微生物生物技術(shù) v 生物技術(shù)的上、中、下游l 上游工程：實驗室研究和開發(fā)階段，包括基因、細(xì)胞、干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因生物、組織工程等獲得優(yōu)良菌株、細(xì)胞系或固定化的菌體等。l 中游工程：中游加工以生物反應(yīng)器為中心，優(yōu)化和放大生產(chǎn)工藝。l 下游工程：從反應(yīng)液中提取目的產(chǎn)物，加工精制成合格產(chǎn)品。v 生

6、物技術(shù)涉及的具體技術(shù)包括: 1. DNA 重組技術(shù), 細(xì)胞培養(yǎng)及融合技術(shù), 抗體制備技術(shù),2. 干細(xì)胞培養(yǎng)及定向分化, 顯微注射技術(shù), 動物飼養(yǎng)技術(shù),3. 轉(zhuǎn)基因技術(shù), 胚胎克隆, 細(xì)胞及酶的固定化技術(shù),發(fā)酵技術(shù),4. 生物反應(yīng)器, 蛋白質(zhì)分離純化, 生物大分子合成及純化,5. 生物大分子修飾, 生物物理、生物信息及其他相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)。v 生物技術(shù)諸工程的內(nèi)容及種類( 十大工程 ) (一) 基因工程 (Gene engineering)（見幻燈片P46）1.對象: 在核酸分子 (DNA或RNA) 或基因上操作。2. 定義: 在體外對DNA進行切割、拼接, 使遺傳物質(zhì)重新組合, 經(jīng)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中

7、擴增表達, 獲得人類所需產(chǎn)品, 或組建新生物類型的技術(shù)。 文獻上常見到DNA重組、分子克隆、基因克隆、 遺傳工程等名詞與基因工程混用, 事實上主要內(nèi)容相似, 不同之處在于所突出的內(nèi)容有異。(二)細(xì)胞工程 (cell engineering) 1.對象: 細(xì)胞, 在細(xì)胞水平上實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移或改變生物學(xué)性狀。2. 定義: (1)廣義（細(xì)胞融合技術(shù)）：在特定的條件下 (環(huán)境、融合技術(shù)), 使不同的細(xì)胞融合, 獲得具有來自雙親代基因的雜交細(xì)胞, 雜交細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變, 達到改造物種、創(chuàng)建新種的目的。 (2) 狹義（淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)）：骨髓瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞融合(制備單克隆抗體，McAb)。 (3)

8、現(xiàn)代概念: 將廣義的概念延展, 指在體外條件對細(xì)胞進行培養(yǎng)、繁殖，按人們的意愿改變細(xì)胞某些生物學(xué)特性，獲得有用的產(chǎn)品或達到改良生物品種的技術(shù)。 細(xì)胞工程包括： 細(xì)胞融合技術(shù)； 工程細(xì)胞移植, 即有目的地改造細(xì)胞遺傳特性后, 植入機體； 細(xì)胞拆合； 染色體導(dǎo)入及細(xì)胞器導(dǎo)入技術(shù)； 胚胎細(xì)胞植入。3. 分類: 微生物細(xì)胞工程, 如原生質(zhì)體融合, 試管菌。 植物細(xì)胞工程，如1978年培育出土豆西紅柿新物種。 動物細(xì)胞工程, 單克隆抗體制備技術(shù)。 4. 應(yīng)用: 單克隆抗體制備成績突出, 診斷、治療?；脽羝琍51(三) 蛋白質(zhì)工程 (Protein engineering)1.對象:基因序列DNA分子中改

9、造, 最終導(dǎo)致蛋白分子氨基酸序列改變。2. 定義: 在利用X衍射和晶體分析技術(shù)了解蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系基礎(chǔ)上, 借用計算機和分子設(shè)計輔助技術(shù), 在DNA分子水平上操作更換或改變其序列, 達到改變蛋白質(zhì)分子氨基酸序列, 從而改變蛋白質(zhì)分子形狀及功能, 使之具有新遺傳學(xué)特性。 (四）抗體工程 （Antibody engineering ） 1.對象：免疫球蛋白（Ig） 基因 2.定義： 通過對抗體分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，有計劃地對抗體基因序列進行改造，改善抗體的某些功能的技術(shù)。如基因工程抗體技術(shù)。 在80年代初，抗體基因結(jié)構(gòu)和功能的研究成果與重組DNA技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了基因工程抗體技術(shù)。

10、v 基因工程抗體即將抗體的基因按不同需要進行加工、改造和重新裝配，然后導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中進行表達的抗體分子。 3.抗體工程的內(nèi)容v 完整抗體，及抗體的人源化 v 完整抗體與抗體片段的藥代動力學(xué)比較 v 改造抗體片段的多種特異性 v 雙功能抗體 v 抗體庫的構(gòu)建、展示和篩選 v 噬菌體展示技術(shù) v mRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物庫 v 細(xì)胞表面庫 v 轉(zhuǎn)基因鼠 v 抗體的生產(chǎn)、穩(wěn)定性和表達水平 v 親和力成熟 v 骨架替換 臨床應(yīng)用 v 中和病原體及抗病毒治療 v 細(xì)胞內(nèi)抗體 v 腫瘤治療與細(xì)胞補充療法 v 疫苗應(yīng)用 v 用于未來診斷的生物傳感器和微矩陣技術(shù) (五) 組織工程 (Tissue engi

11、neering) 1. 對象：干細(xì)胞、組織和器官。 2.定義：運用工程學(xué)和生命科學(xué)原理和方法， 在了解正常和病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系和生長機理的基礎(chǔ)上，研制生物學(xué)組織器官替代品，通過移植，達到重建、恢復(fù)、維持和改進組織功能學(xué)科。3.要點： 依據(jù)正常組織結(jié)構(gòu)、功能設(shè)計方案； 選擇種子細(xì)胞培養(yǎng)； 選擇細(xì)胞外基質(zhì)、生物支架材料； 體外構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)替代品； 植入機體，替代病理組織。4.應(yīng)用： 組織器官移植。(六)干細(xì)胞工程 (stem cell engineering)u 干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，可以分化成多種功能細(xì)胞。u 根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞和成體干

12、細(xì)胞。u 根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。 干細(xì)胞的主要特征：v 未分化的早期細(xì)胞；v 具有分化成各種特定細(xì)胞的能力；v 可無限地分裂增值，產(chǎn)生大量后裔;v 其子細(xì)胞有兩種命運，保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。v 克隆技術(shù)見幻燈片P65 (七) 轉(zhuǎn)基因動物(亦稱: 胚胎工程 Transgenetic animal） 1.對象: 胚胎早期細(xì)胞上實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。 2. 定義: 把新的遺傳信息 (DNA序列) 用特定技術(shù)導(dǎo)入胚胎早期受精卵, 經(jīng)發(fā)育后, 外源遺傳信息分布到所有體細(xì)胞生殖細(xì)胞中去, 這種使動物帶有新遺傳信息的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)稱胚胎工程。所得動物稱轉(zhuǎn)基因動物。3

13、. 過程: 提取人所需要蛋白質(zhì)基因、cDNA； 基因重組 (cDNA控制基因載體)； 分離、培養(yǎng)人工受精的卵細(xì)胞(如牛)； 把重組體轉(zhuǎn)入到受精的卵細(xì)胞； 植入子宮 ,使之發(fā)育為個體(每一個體細(xì)胞均含有新的基因)； 活化植入新基因,使之表達 (如在乳腺中表達)； 提取目的基因表達產(chǎn)物,進行驗證(定性、定量)； 進行安全性及臨床試驗。4. 要點: 必須有外源新基因轉(zhuǎn)移； 在早期生殖細(xì)胞整合； 發(fā)育成新個體中有外源基因正常表達； 可遺傳后代。(八) 生物醫(yī)學(xué)工程 ( Biomedical engineering) 1 對象: 人體 2 定義: 從工程學(xué)角度研究人體結(jié)構(gòu)、功能及生命現(xiàn)象, 為防治疾病提

14、供新技術(shù)、 新方法、新儀器和新材料的科學(xué)。 3 內(nèi)容: 生物材料( 人造器官、起搏器的材料)、康復(fù)工程、醫(yī)學(xué)成像( 超聲、CT、 核磁)、生物傳感、監(jiān)護系統(tǒng)等。(九) 生物制藥化學(xué)制藥工程 (Biochemical pharmaceutical engineering) 1生產(chǎn)對象: 藥物( 活性多肽、酶、抗生素等)2定義 利用現(xiàn)代生物技術(shù), 以生物反應(yīng)器（微生物、動物細(xì)胞、植物及動物個體）， 大規(guī)模地制備高純度的藥物。 如基因工程藥物、同份異構(gòu)體的拆分（利用抗體酶特異結(jié)合、特異地進行酶消化來完成）等。(十) 酶工程 (Enzyme engineering)1.對象: 酶分子修飾、生產(chǎn)應(yīng)用和酶

15、的固定化2. 定義: 在給定的生產(chǎn)工藝和生物反應(yīng)器中, 利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的特異催化功能，或?qū)γ高M行修飾改造提高酶的轉(zhuǎn)化率, 把對應(yīng)的原料高效地轉(zhuǎn)化成所需有用的物質(zhì)。3. 要點: 固定化酶、酶分子修飾和酶反應(yīng)器的設(shè)計是當(dāng)前酶工程的重點。 近年把酶電極生物傳感器也歸到酶工程范圍內(nèi)。如: 底物固定化酶化學(xué)信號電信號人視覺控制反應(yīng)。 (十一) 發(fā)酵工程 (Fermentation engineering)1.對象: 微生物。在常規(guī)發(fā)酵工藝上發(fā)展而成。有時也稱微生物工程。2. 定義: 利用微生物的特點（生長快、培養(yǎng)簡單和代謝過程特殊等）, 通過現(xiàn)代化工程技術(shù), 快速、連續(xù)生產(chǎn)人類所需物質(zhì)的技術(shù)

16、。3. 要點: 核心是提高產(chǎn)率。 過程包括: 菌種選育、生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物的利用。 所用技術(shù)包括大規(guī)模懸浮培養(yǎng),細(xì)胞固定化, 產(chǎn)物分離提取。 4應(yīng)用: 藥物生產(chǎn)( 活性多肽、抗生素)、單細(xì)胞蛋白生產(chǎn)、環(huán)境保護、微生物冶金技術(shù)。 (十二) 生化工程 (Biochemistry engineering) 1 對象: 生化反應(yīng)器(反應(yīng)環(huán)境與裝置)， 產(chǎn)品的分離提純技術(shù) 2.定義: 為活細(xì)胞和酶提供適宜反應(yīng)環(huán)境, 能大規(guī)模自動化生產(chǎn)、分離、精制出所需產(chǎn)品的技術(shù)。 3.內(nèi)容包括:生物反應(yīng)器的設(shè)計、傳感器的制造、電泳、離心、層折、免疫層析等。這是下游工程的關(guān)鍵一環(huán)。注：1.十二大工程相互聯(lián)系, 相輔相成。6）

17、生物技術(shù)的重要性v 有助于解決全球的重大難題：資源（能源）、人口、糧食、生態(tài)環(huán)境、健康與疾病和戰(zhàn)爭與災(zāi)害；v 促進傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)改造和新產(chǎn)業(yè)的形成，對人類社會生活產(chǎn)生深遠(yuǎn)的革命性影響；v 生物技術(shù)正迅速走向老百姓日常生活各個方面, 將對人類的發(fā)展做出貢獻。2. 海洋生物技術(shù)1）. 定義：海洋生物技術(shù)是運用海洋生物學(xué)與工程學(xué)的原理和方法，利用海洋生物或生物代謝過程生產(chǎn)有用的生物制品或定向改良海洋生物遺傳特性的綜合性科學(xué)技術(shù)。 2）. 海洋生物技術(shù)的研究內(nèi)容：主要以海洋生物為對象，綜合應(yīng)用基因工程、細(xì)胞操作技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)等手段，對海洋生物資源進行研究、開發(fā)利用和保護。 開發(fā)、生產(chǎn)和改造海洋生物

18、天然產(chǎn)物，以便用作藥物、食品、新材料； 定向改良海洋動物、植物遺傳特性，為海水養(yǎng)殖業(yè)提供具有生長快、品質(zhì)高和抗病害的優(yōu)良品種； 培養(yǎng)具有特殊用途的“超級細(xì)菌”，用來清除海洋環(huán)境的污染，或者生產(chǎn)具有特定生物治理的物質(zhì)。 主攻方向：利用生物技術(shù)，改良具有重要經(jīng)濟價值的海水養(yǎng)殖生物遺傳特性 。3海洋生物技術(shù)研究的新發(fā)展 探索有價值的海洋生物種群； 利用生物技術(shù)開發(fā)新的海洋動植物優(yōu)良品種，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)； 利用海洋生物技術(shù)從天然生物中提取加工各種化工產(chǎn)品； 從基因工程理論上闡明生物的特殊功能，并在可能的范圍內(nèi)加以利用； 用基因工程理論闡明海洋生態(tài)系統(tǒng)存在與發(fā)展的規(guī)律，并對其進行人為的控制； 建立海洋生

19、物利用系統(tǒng)，包括海水養(yǎng)殖新技術(shù)和海洋生物生產(chǎn)系統(tǒng)v 第 二 章海洋動物細(xì)胞工程思考題v 1 名詞解釋：細(xì)胞工程、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、細(xì)胞株、細(xì)胞系、細(xì)胞融合、連續(xù)細(xì)胞系、組織工程、無限細(xì)胞系、有限細(xì)胞系v 2 簡述tPA的制備過程。v 3 簡述動物細(xì)胞培養(yǎng)方式和操作方式。v 4 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器必須具備哪些要求？有哪些類型？特點是什么？一、1. 細(xì)胞工程的概念應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計和需要，通過細(xì)胞融合、核質(zhì)移植、染色體或基因移植，以及組織、細(xì)胞培養(yǎng)等方法，在細(xì)胞整體水平或細(xì)胞器水平改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品，甚至培養(yǎng)出新物種的一門綜

20、合性生物工程技術(shù)科學(xué)。2. 細(xì)胞融合技術(shù)：細(xì)胞融合，又稱細(xì)胞雜交，是指兩個或兩個以上的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的現(xiàn)象。v 體外用人工方法使兩種細(xì)胞融合，制成一種新品系的雜交細(xì)胞，篩選出的雜交細(xì)胞有很強的生命力，增殖也很旺盛。常用的細(xì)胞融合誘導(dǎo)物是仙臺病毒和聚乙烯丙醇（PEG）。l 思考討論：為什么使用的病毒需要滅活？不滅活不行嗎？答：因為滅活的病毒能使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。3、原代培養(yǎng)：從機體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。4、傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出

21、，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。5、細(xì)胞株：原代細(xì)胞一般傳至10代左右細(xì)胞生長停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡，少數(shù)細(xì)胞存活到4050代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞株。6細(xì)胞系：細(xì)胞株傳代至50代后又出現(xiàn)細(xì)胞生長停滯狀態(tài)，只有部分細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)的改變，使其在培養(yǎng)條件下可以無限制傳代，這種傳代細(xì)胞為細(xì)胞系。細(xì)胞株和細(xì)胞系的區(qū)別： 細(xì)胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細(xì)胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)。 7、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系）： 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的或人工的，從腫瘤組織中分離。

22、8、原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系， 由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。如果不能繼續(xù)傳代，或傳代次數(shù)有限， 可稱為有限細(xì)胞系， 如可以連續(xù)培養(yǎng)， 則稱為連續(xù)細(xì)胞系(無限細(xì)胞系)， 培養(yǎng)50代以上并無限培養(yǎng)下去。二、1、組織纖溶酶原激活劑（tPA）生產(chǎn)工藝： 組織纖溶酶原激活劑是一種絲氨酸蛋白酶，與纖維蛋白結(jié)合后形成的復(fù)合物可使纖溶酶原活化為纖溶酶。 纖溶酶可水解纖維蛋白，導(dǎo)致血栓溶解，故對血栓性疾病有較好療效。 人黑色素瘤細(xì)胞株培養(yǎng)后可產(chǎn)生大量的tPA，其培養(yǎng)液中tPA濃度可達到1毫克/升。1）工藝流程 細(xì)胞單層 、細(xì)胞懸液、 細(xì)胞培養(yǎng)物、 培養(yǎng)液、提取液、 層析液、 濃縮液、

23、層析液、 tPA成品2）工藝過程A 培養(yǎng)基配制；B tPA抗體制備；C 抗tPA親和吸附劑制備；D 細(xì)胞培養(yǎng)；E tPA的分離；F 精制。 （1）t-PA抗體的制備 v 取人t-PA、或者豬心t-PA按每只家兔200-300ug的計量，t-PA采用福氏完全佐劑充分乳化，注射入家兔皮下。每隔2周再用t-PA100ug進行加強免疫，共加強2次取家兔血清用50%硫酸銨鹽析沉淀物于0下，用生理鹽水透析經(jīng)過Sephadex 75柱層析得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG備用 （2）抗t-PA的親和吸附劑的制備 A、Sepharose 4B的活化B、抗t-PA的親和吸附劑（t-PA-IgG-Sepharoes

24、-4B親和吸附劑）的制備v A、Sepharose 4B的活化 v Sepharose 4B用10倍體積的蒸餾水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽濾取20克Sepharose 4B濕凝膠放入500ml的三頸燒瓶中，加蒸餾水30ml，攪均勻后，用2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH=11，降溫至18在通風(fēng)櫥中，另取溴化氰1.5g于乳缽中，加入30-40ml蒸餾水分多次研磨溶解將溴化氰溶液倒入三頸燒瓶中，升溫至20-22，同時滴加2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH=11-12等反應(yīng)液PH值不變時，繼續(xù)反應(yīng)5分鐘，取出燒瓶，向其中投入小冰塊降溫，用3號垂熔漏斗抽濾用300ml、4、0.1mol/L的NaH

25、CO3溶液洗滌。然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸緩沖液分3-4次抽濾洗滌最后轉(zhuǎn)移至250ml的燒瓶中，加入50-60ml的硼酸緩沖液，即得活化的Sepharose 4B，備用 v B、抗t-PA的親和吸附劑（t-PA-IgG-Sepharoes-4B親和吸附劑）的制備 v 取步驟-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸緩沖液中、過濾。濾液加入到已經(jīng)活化的Sepharose 4B中，10下攪拌反應(yīng)16-18小時第二天裝柱，用10倍柱床體積（V/V）、PH=10.2的硼酸緩沖液，以5-6ml/min的流速洗滌柱床。收集流出液，測定其A280用

26、5倍柱床體積（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗滌柱床用5倍柱床體積（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸緩沖液洗滌柱床用5倍柱床體積（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸緩沖液洗滌平衡。直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的親和吸附劑。將其轉(zhuǎn)移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖液中，于4下貯存，備用。 （3）細(xì)胞培養(yǎng) v 取5L玻璃轉(zhuǎn)瓶，按每平方米表面積2.5L的比例加入細(xì)胞培養(yǎng)液。 將人黑色素瘤細(xì)胞按常規(guī)方法消化分散、洗滌、計數(shù)、稀釋成細(xì)胞懸液。 將細(xì)胞懸

27、浮液接種到轉(zhuǎn)瓶之中，接種濃度為1033×103個/ml 置于CO2培養(yǎng)箱中，37下培養(yǎng)、通入含5%CO2的無菌空氣 等到長成致密單層之后，棄去培養(yǎng)液，用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞單層23次。 換入無血清Eagle培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 每隔3 4天收獲一次培養(yǎng)液，用于制備t-PA。同時向轉(zhuǎn)瓶中加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 如此反復(fù)，可獲得大量t-PA。（4）t-PA的分離 v 步驟-4中所收集到的培養(yǎng)液中，加入蛋白酶抑制劑aprotinin至5萬單位/ml。加吐溫-80至于0.01%、過濾、除去沉淀.濾液稀釋3倍 稀釋液上柱，以5ml/min的流速進入t-PA-IgG-Se

28、pharoes-4B親和柱（直徑4cm*長度40cm）。 用含0.01%的吐溫-80 + 2.5萬單位/ml的蛋白酶抑制劑aprotinin +0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖液以同樣的流速洗滌親和柱，以除去雜蛋白 最后用3mol/L的KSCN溶液洗脫親和柱，以每管10-15ml的體積進行分區(qū)收集合并t-PA的洗脫峰， 裝入透析袋內(nèi)，埋入到PEG20000中濃縮至原體積的1/10-1/5。 各t-PA粗提物 （5）t-PA的精制 v t-PA粗提物進Sephadex-G-150柱（直徑2cm*長度100cm）用含0.01%的吐溫-80的1mol/L的NH4

29、HCO3溶液以2-3ml/min的流速進行洗脫以每管10-15ml的體積進行分區(qū)收集合并t-PA的洗脫峰，于凍干機中進行凍干得t-PA精品 2、動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法（細(xì)胞培養(yǎng)方式） 按照實際生產(chǎn)可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁-懸浮培養(yǎng)。1）、懸浮培養(yǎng)v 優(yōu)點：操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗。v 缺點：體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。常用反應(yīng)器為攪拌和氣升式。2）、貼壁培養(yǎng)v 優(yōu)點：適用的細(xì)胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達到高密度細(xì)胞。v 缺點：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3）、貼壁-懸浮培養(yǎng)(固

30、定化培養(yǎng))v （1）微載體培養(yǎng)，優(yōu)點：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積，載體體積較小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的特長。理想的微載體應(yīng)具備：生物相容性、無毒性、表面惰性、比重適當(dāng)（1.0301.045g/ml）、粒徑均一，在60250 mm之間（溶脹后）、光學(xué)透明、柔軟、耐高壓滅菌溫度、反復(fù)多次使用、制備簡單、原料充分。v （2）包埋和微囊培養(yǎng)，包埋或包裹在凝膠載體和微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；可以獲得較高的細(xì)胞密度；通過控制微囊膜的孔徑可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)有利于下游處理；可采用多種生物反應(yīng)器進行大規(guī)模培養(yǎng)。v （3）結(jié)團培養(yǎng)，利用細(xì)胞本身作為基

31、質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法進行培養(yǎng)。優(yōu)點是操作簡單、節(jié)省微載體用量。3、動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式v 分批式、流加式、半連續(xù)、連續(xù)式、灌注式、細(xì)胞工廠培養(yǎng)，見發(fā)酵工程相關(guān)內(nèi)容。4、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器必須具備哪些要求？有哪些類型？特點是什么？v 必須具備的基本要求：材料是無毒性的；結(jié)構(gòu)性能良好；密封性能良好；理化參數(shù)能自動檢測；能長期運作；容器無死角；維修方便；設(shè)備成本低。 v 反應(yīng)器類型及特點： 1)攪拌罐式生物反應(yīng)器：主要用于是懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，微囊和巨載體培養(yǎng)以及結(jié)團培養(yǎng) 2)氣升式生物反應(yīng)器：氣體通過裝在罐底的噴管進入 反應(yīng)器的導(dǎo)流管，致使

32、該部液體的密度小于導(dǎo)流管外部的液體形成循環(huán)流。3)中空纖維式生物反應(yīng)器：占地空間小，產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量高，生產(chǎn)成本低，不能重復(fù)使用，不能耐高壓蒸汽滅菌，需用環(huán)氧乙烷或其它消毒劑滅菌，難以取樣檢測。4)透析袋或膜式生物反應(yīng)器：可使細(xì)胞達到高密度 ，又可隨意組合進行操作，對產(chǎn)品進行濃縮純化。5)固定床或流化床生物反應(yīng)器：結(jié)構(gòu)簡單，裝填材料易得。第三章抗體工程v 復(fù)習(xí)題 v 1名詞解釋：抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、基因工程抗體v 2 什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？v 3 雜交瘤細(xì)胞的克隆方法有哪些？v 4 大量制備單克隆抗體的方法有哪些，各有哪些優(yōu)缺點？v 5單

33、克隆抗體的性質(zhì)鑒定的方法有哪些？v 6 簡述單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用。v 7 什么是免疫球蛋白？與抗體的區(qū)別是什么？一、1. 抗體：是指機體受抗原刺激后產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。v 抗體的產(chǎn)生：機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。B淋巴細(xì)胞與抗體的關(guān)系： Ø B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可產(chǎn)生抗體。Ø 動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。Ø 每一個B淋巴細(xì)胞只能分泌一種特異性抗體。2. 抗原通常是由多個抗原決定簇組成的，所以常規(guī)抗體是多個不同

34、抗原決定簇抗體的混合物。因而，常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonal antibody），簡稱多抗。3. 單克隆抗體（Monoclonal Antibody，McAb）即單個B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體。是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。4. 克隆化是指單個細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團的整個培養(yǎng)過程。這種群體細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能完全相同。5. 基因工程抗體(Genetic engineering antibody) ：根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或

35、修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體等。二、1. 什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗體有何異同？答： 單克隆抗體（Monoclonal Antibody，McAb）即單個B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體。是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。 l 優(yōu)點 ：a) 在體外“永久”地存活并傳代；b) 用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體；c) 適用于以標(biāo)記抗體為特點的免疫學(xué)分析方法；d) 可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。l

36、局限性 ：a) 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍；b) 反應(yīng)強度不如多克隆抗體；c) 制備技術(shù)復(fù)雜、費時費工、價格較高。l 與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。2. 雜交瘤細(xì)胞的克隆方法有哪些？答：有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法（1）有限稀釋法材料：a、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板等；b、HT培養(yǎng)基；c、活力強的雜交瘤細(xì)胞；d、小鼠腹腔細(xì)胞。方法：a、制備小鼠腹腔細(xì)胞。同“細(xì)胞融合”一節(jié)中的方法。b、制備待克隆的雜交瘤細(xì)胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細(xì)胞三種不同的稀釋度。c、按每毫升加入5×104-1×105細(xì)

37、胞的比例，在上述雜交瘤細(xì)胞懸液中分別加入腹腔巨噬細(xì)胞。d、每種雜交瘤細(xì)胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細(xì)胞數(shù)分別為0.5、3和10。e、37、7.5% CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現(xiàn)肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標(biāo)出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。f、取抗體檢測陽性孔的細(xì)胞擴大培養(yǎng)，并凍存。g、本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數(shù)后的雜交瘤細(xì)胞準(zhǔn)確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細(xì)胞，按每孔接種0.1ml細(xì)胞懸液，即每孔含1個細(xì)胞。（2）、軟瓊脂培養(yǎng)法材料：a、HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。b、用0.15mol/L NaCl配

38、制的2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細(xì)胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4保存。c、小鼠腹腔細(xì)胞。d、滅菌平皿。e、45水浴。f、活力很好的雜交瘤細(xì)胞。方法：a、在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層。b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45水浴中溫育。c、吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。d、取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。e、37、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細(xì)吸管吸出克隆

39、，直接轉(zhuǎn)種于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板，擴大培養(yǎng)。f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。3. 大量制備單克隆抗體的方法有哪些，各有哪些優(yōu)缺點？答：目前制備的方法主要有兩種：動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。（1） 體內(nèi)誘生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。優(yōu)點：該法操作簡便、經(jīng)濟。缺點：腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜種蛋白質(zhì)，因此很多情況下要提純后才能使用，而且有污染動物病毒的危險。（2）

40、體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。優(yōu)點：抗體單一，比較純?nèi)秉c：制備單抗量極為有限，不適用于單抗的大規(guī)模生產(chǎn)，要想體外大量生產(chǎn)就必須進行雜交瘤細(xì)胞的大量培養(yǎng)。單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞存活時間越長，單抗?jié)舛染驮礁?，產(chǎn)量就越大。4. 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定的方法有哪些？答：1. 雜交瘤細(xì)胞鑒定：染色體分析、抗體穩(wěn)定性分析、外原因子檢查。2.單抗進行Ig的類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA鑒定。3.親和力鑒定 常用

41、方法：相對親和力測定和親和常數(shù)測定4.純度含量測定 純度一般用SDS-PAGE 或?qū)游龇y定5.活性測定 測效價6.識別抗原位點測定 7.特異性、交叉反應(yīng)性測定5. 簡述單克隆抗體的制備流程和應(yīng)用。答：（1）、流程：動物免疫細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選單抗的檢測雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存單抗的鑒定（2）、應(yīng)用：用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標(biāo)記 單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫鑒定；用于臨床治療，如針對T淋巴細(xì)胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。作為體制備導(dǎo)向藥物。但是要解決以下兩個問題：鼠源性單克隆抗體的免疫原性；完整的

42、抗體分子分子量過大，難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度?；蚬こ碳夹g(shù)為解決這兩個問題提供了可能。6. 什么是免疫球蛋白？與抗體的區(qū)別是什么？答：20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)與抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白， 統(tǒng)稱為免疫球蛋（immunoglobulin，Ig）。區(qū)別：1964年，世界衛(wèi)生組織舉行專門會議，將具有抗體活性以及與抗體相關(guān)的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白(Ig)。因而免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念。可以說，所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都是抗體。第四章海洋藻類細(xì)胞工程復(fù)習(xí)題v 1.名詞解釋：細(xì)胞的全能性

43、、外植體、愈傷組織、二步培養(yǎng)法 v 2. 植物細(xì)胞培養(yǎng)基組成成分都有哪些？v 3. 簡述植物組織培養(yǎng)過程。v 4. 簡述植物細(xì)胞雜交的過程。v 5. 影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素都有哪些？一、1、植物細(xì)胞工程：以植物細(xì)胞為基本單位，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，在離體條件下進行培養(yǎng)、繁殖或人為的精細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種、創(chuàng)造新物種、加速繁殖植物個體或獲得有用物質(zhì)的過程。2、植物細(xì)胞的全能：生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個體的潛能的特性。即植物體活細(xì)胞在一定條件下具有發(fā)育成完整植株的能力。3、外植體v 用于植物組織（細(xì)胞）培養(yǎng)的器官或組織

44、（的切段）。v 植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進行組織培養(yǎng)。4、愈傷組織：指從植物受傷部位或組織培養(yǎng)物產(chǎn)生的由分化和未分化細(xì)胞組成的一類薄壁組織。多為淡黃色或白色，易于再生芽。 在離體培養(yǎng)條件下，外植體中的活細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)脫分化，恢復(fù)其全能性，轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚?xì)胞，繼而分化為薄壁組織而形成愈傷組織。 5、二步培養(yǎng)法：使用生長培養(yǎng)基使細(xì)胞大量增殖，達到了一定的細(xì)胞密度，然后再改用適合細(xì)胞產(chǎn)物積累的培養(yǎng)基，促進細(xì)胞啟動 次級代謝途徑并提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。6、植物細(xì)胞工程以植物細(xì)胞為基本單位，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，在離體條件下進行培養(yǎng)、繁殖或人為的精

45、細(xì)操作，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變，從而改良品種、創(chuàng)造新物種、加速繁殖植物個體或獲得有用物質(zhì)的過程。7、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)v 植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)（培養(yǎng)基）及環(huán)境條件（光照、溫度）下，研究植物的細(xì)胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術(shù)。8、細(xì)胞分化細(xì)胞分化是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。9、細(xì)胞分化細(xì)胞分化是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。是相同基因型的細(xì)胞所具有的各個不同的表現(xiàn)型。它包括：時間上的分化、空間上的分化。10、脫分化已經(jīng)分化的細(xì)胞、組織、器官在人工培養(yǎng)的條件下又變成未分化的細(xì)胞和

46、組織的過程。11、再分化通過脫分化誘導(dǎo)形成的愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下可再分化稱為胚狀體或直接分化出器官。12、細(xì)胞培養(yǎng)v 利用單個細(xì)胞（愈傷組織）進行液體或固體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其增殖及分化。v 目的是得到大量單細(xì)胞無性繁殖系。v 通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成，愈傷組織在傳代培養(yǎng)后，產(chǎn)生能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞群，從而建立穩(wěn)定的懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞系。13、分生組織培養(yǎng)v 又稱生長錐培養(yǎng)，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細(xì)胞。14、器官形成指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成。15、無性繁殖v 即克隆，指使用母體培養(yǎng)物反復(fù)進行繼代培養(yǎng)時，通過同種外植體而獲得越來越多的無性繁殖后代。12、突變體v

47、 細(xì)胞自身發(fā)生遺傳變異或通過誘變發(fā)生的遺傳變異產(chǎn)生的新細(xì)胞。13、繼代培養(yǎng)v 由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)就稱為繼代培養(yǎng)。14、次級代謝和次級代謝產(chǎn)物v 定義：次級代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。生物堿、黃酮體、萜類、有機酸、木質(zhì)素等。v 次級代謝產(chǎn)物的特征：有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限；其合成需在特定的條件下才能發(fā)生；缺乏明確的生理功能；是生命的多余成分。二、1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基組成成分都有哪些？答：植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基主要含有無機鹽、碳源、有機氮源、植物生長激素、維生素等化學(xué)成分。1、無機鹽v 基本培養(yǎng)基是由

48、各種濃度的無機鹽溶液組成的，這些無機鹽又有“大量元素”和“微量元素”之分。v 大量元素是指使用濃度大于30mg/L時的無機元素，包括N、S、P、K、Mg、Ca、Cl和鈉，v 微量元素是指濃度低于30mg/L的無機元素，如Fe、B、Mn、I和Mo，以及極微量的Cu和Zn。某些情況下，還可加入Ni、Co和Al。這些微量元素作為輔因子或?qū)γ负铣啥裕际潜仨毜摹?、碳源v 植物為異養(yǎng)細(xì)胞。通常使用碳水化合物、肌醇作為碳源，有時也用甘油、乳糖和半乳糖等化合物。v 有些培養(yǎng)物可通過同化二氧化碳獲得所需的能量，即光自養(yǎng)培養(yǎng)物。v 在某些情況下，培養(yǎng)基固化劑也可作為補充能量和碳源之用。v 某些天然提取物對愈

49、傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)也有重要意義。3、植物生長調(diào)節(jié)劑v 植物生長調(diào)節(jié)劑包括人工合成的具有生理活性的化合物，也包括一些天然的化合物以及植物激素。 v 植物激素是指植物代謝過程中形成的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（<1mM）時能調(diào)節(jié)植物的發(fā)育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運到作用部位發(fā)揮作用。v 目前已發(fā)現(xiàn)植物組織中可以形成5種植物激素，即生長素、分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯。4、有機氮源v 主要是蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（如谷氨酰胺）或各種氨基酸。v 有機氮源對細(xì)胞的早期生長有利，氨基酸的加入主要是為了代替或增加氮源的供應(yīng)。v 但應(yīng)注意的是蘇氨酸、甘氨酸和纈氨酸可通過滅活位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)上的谷氨酸合成酶而降低氮

50、的利用，而精氨酸通常具有補償此滅活作用的能力。5、維生素v 植物細(xì)胞屬維生素自養(yǎng)型，但在大多數(shù)情況下，其自身合成的量不能滿足需要。v 在培養(yǎng)基除了必需加入B族維生素（如B1、B6和泛酸）外，還需加入一定量的生物素和肌醇，后者是構(gòu)成磷酸肌醇（細(xì)胞膜脂質(zhì)部分含磷酸肌醇2%8%）極性端的部分。）2. 簡述植物組織培養(yǎng)過程。答：切取形成層無菌接種誘導(dǎo)愈傷組織的形成試管苗的形成移栽（1）植物材料的準(zhǔn)備、清洗、消毒v 用于植物組織培養(yǎng)的外植體必須無菌。 準(zhǔn)備試驗材料，即一般為植物器官的外植體； 清除材料內(nèi)部的微生物； 不能損害試驗材料。v 常用表面滅菌試劑的特點是滅菌后易于除去或容易分解的試劑。v 常用滅

51、菌試劑有次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞。v 次氯酸鈣為工業(yè)漂白粉過濾后的飽和溶液，適用于草本植物和柔軟組織的滅菌處理，時間為5-30分。氯化汞滅菌效果好，但不易除去，時間不易過長，以免殺死植物細(xì)胞。不同外植體的滅菌步驟u 種子的消毒 滅菌前處理：純酒精中浸泡10分鐘，再用無菌水漂洗； 滅菌：100g/L次氯酸鈣浸泡20-30min，再用10g/L溴水浸泡5min； 滅菌后處理：無菌水洗3次，然后在無菌水中發(fā)芽。u 果實和莖切段的消毒 滅菌前處理：純酒精漂洗； 滅菌：20g/L次氯酸鈉浸泡10min； 滅菌后處理：無菌水反復(fù)沖洗3次，然后再剖開內(nèi)部種子。u 儲藏器官和葉片的消毒 滅菌前處理：自來水洗

52、凈； 滅菌：20g/L次氯酸鈉浸泡20-30min； 滅菌后處理：無菌水反復(fù)沖洗3次、濾紙吸干。 （2）培養(yǎng)基配制 植物細(xì)胞培養(yǎng)基通常含無機營養(yǎng)物質(zhì)(大量元素和微量元素)、碳源(1%-4%蔗糖)、有機氮源、生長調(diào)節(jié)素(2,4-D或NAA、KT或6-BA)以及維生素等幾類物質(zhì)組成。（3）接種 在無菌條件下操作，把材料放進培養(yǎng)基（4）愈傷組織的培養(yǎng)和誘導(dǎo) 在生長素（高濃度）和細(xì)胞分裂素（低濃度）作用下，外植體經(jīng)誘導(dǎo)生成愈傷組織。 （5）誘導(dǎo)產(chǎn)生器官或體細(xì)胞胚 器官產(chǎn)生：愈傷組織形成細(xì)胞團器官原基形成器官（先芽后根）（6）移栽3. 簡述植物細(xì)胞雜交的過程。答：植細(xì)胞A和植物細(xì)胞B用酶解法（纖維素酶、

53、果膠酶）去除細(xì)胞壁，得到原生質(zhì)體A和原生質(zhì)體B；然后再用人工誘導(dǎo)法（物理方法：離心、震動、電刺激；化學(xué)方法：聚乙二醇）進行原生質(zhì)體融合；融合后的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁（植物細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）得到雜種細(xì)胞；再脫分化得到愈傷組織；最后經(jīng)再分化得到雜種植物。4. 影響植物次級代謝產(chǎn)物累積的因素都有哪些？答：在植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過程中，影響植物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累積的因素主要有：v 生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；v 物理條件：溫度、光（光照時間、光強、光質(zhì)）、通氣（O2）、pH和滲透壓等；v 化學(xué)條件：無機鹽（N、P、K等）、碳源、植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)、前體等

54、；v 工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方法等。第五章 海洋動物基因工程v 思考題v 1. 基因工程誕生的理論基礎(chǔ)是什么？有哪些技術(shù)促進了基因工程的發(fā)展？v 2. 外源DNA轉(zhuǎn)入動物基因組的方法都有哪些？各有什么優(yōu)缺點？v 3. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)在海洋動物中的應(yīng)用存在和需要解決的問題都有哪些？v 4. 基因工程操作的主要流程是什么？一、1、轉(zhuǎn)化 transformation指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。 2、轉(zhuǎn)導(dǎo) transduction 指以噬菌體為載體，在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過程，有時也指在真核細(xì)胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA的過程。轉(zhuǎn)染 transfection 指病毒或以它為