實(shí)驗(yàn)三植物染色體畸變的觀察

1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 植物染色體畸變觀察植物染色體畸變觀察實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：6學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)類型：設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)類型：設(shè)計(jì)性每組人數(shù)：每組人數(shù)： 4 人組人組實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)分2部分進(jìn)行部分進(jìn)行1學(xué)生自行設(shè)計(jì)處理方案，用秋水仙素誘發(fā)植物學(xué)生自行設(shè)計(jì)處理方案，用秋水仙素誘發(fā)植物產(chǎn)生多倍體；產(chǎn)生多倍體；2通過(guò)取材、固定、解離、孚爾根染色法制片、通過(guò)取材、固定、解離、孚爾根染色法制片、鏡檢觀察；鏡檢觀察； 3. 找出根尖細(xì)胞中期分裂相，確定誘發(fā)成功的細(xì)胞，找出根尖細(xì)胞中期分裂相，確定誘發(fā)成功的細(xì)胞，觀察加倍根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目。觀察加倍根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目。4學(xué)生自行設(shè)計(jì)處理方案，用化學(xué)藥劑或

2、特定污學(xué)生自行設(shè)計(jì)處理方案，用化學(xué)藥劑或特定污染物處理洋蔥或蠶豆根尖細(xì)胞，觀察細(xì)胞有絲分染物處理洋蔥或蠶豆根尖細(xì)胞，觀察細(xì)胞有絲分裂時(shí)染色體畸變（微核、粘連、聚結(jié)、斷裂等）。裂時(shí)染色體畸變（微核、粘連、聚結(jié)、斷裂等）。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解人工誘導(dǎo)植物多倍體的原理、方法及其在植了解人工誘導(dǎo)植物多倍體的原理、方法及其在植物育種上的意義，并用秋水仙素誘發(fā)植物產(chǎn)生多物育種上的意義，并用秋水仙素誘發(fā)植物產(chǎn)生多倍體；倍體；2. 學(xué)會(huì)利用學(xué)會(huì)利用feulgen染色方法鑒定細(xì)胞中染色方法鑒定細(xì)胞中DNA分布分布及鑒別人工誘導(dǎo)后植物染色體數(shù)目的變化；為學(xué)及鑒別人工誘導(dǎo)后植物染色體數(shù)目的變化；為學(xué)習(xí)

3、植物遺傳育種學(xué)和從事有關(guān)農(nóng)作物育種工作奠習(xí)植物遺傳育種學(xué)和從事有關(guān)農(nóng)作物育種工作奠定基礎(chǔ)。定基礎(chǔ)。3. 通過(guò)觀察染色體壓片，找出根尖細(xì)胞中期分裂相，通過(guò)觀察染色體壓片，找出根尖細(xì)胞中期分裂相，確定誘發(fā)成功的細(xì)胞，觀察加倍根尖細(xì)胞的染色確定誘發(fā)成功的細(xì)胞，觀察加倍根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目。體數(shù)目。4學(xué)會(huì)通過(guò)檢查染色體畸變情況評(píng)價(jià)環(huán)境污染的學(xué)會(huì)通過(guò)檢查染色體畸變情況評(píng)價(jià)環(huán)境污染的細(xì)胞遺傳學(xué)簡(jiǎn)易方法。細(xì)胞遺傳學(xué)簡(jiǎn)易方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理一）、一）、植物多倍體人工誘發(fā)原理植物多倍體人工誘發(fā)原理 生物的染色體數(shù)目一般是相當(dāng)穩(wěn)定的，這是物種遺生物的染色體數(shù)目一般是相當(dāng)穩(wěn)定的，這是物種遺傳穩(wěn)定性的重要

4、特征之一。遺傳學(xué)上把二倍體生物的傳穩(wěn)定性的重要特征之一。遺傳學(xué)上把二倍體生物的一個(gè)配子的染色體數(shù)，稱為染色體組。具有兩個(gè)完整一個(gè)配子的染色體數(shù)，稱為染色體組。具有兩個(gè)完整染色體組的生物體或細(xì)胞稱為二倍體，自然存在的生染色體組的生物體或細(xì)胞稱為二倍體，自然存在的生物多屬于二倍體，核內(nèi)多于兩個(gè)染色體組的生物體則物多屬于二倍體，核內(nèi)多于兩個(gè)染色體組的生物體則稱為多倍體。其中增加的染色體組來(lái)自同一物種或者稱為多倍體。其中增加的染色體組來(lái)自同一物種或者是源于染色體組加倍，稱為同源多倍體。是源于染色體組加倍，稱為同源多倍體。 自然界存在多倍體物種，此外可通過(guò)人工誘導(dǎo)產(chǎn)生自然界存在多倍體物種，此外可通過(guò)人工

5、誘導(dǎo)產(chǎn)生多倍體植物。如秋水仙素、對(duì)二氯苯等都可用于誘發(fā)多倍體植物。如秋水仙素、對(duì)二氯苯等都可用于誘發(fā)多倍體，其中以秋水仙素效果最好，使用最為廣泛。多倍體，其中以秋水仙素效果最好，使用最為廣泛。其主要作用原理是抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成，使其主要作用原理是抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成，使染色體不能移向兩極而被阻止在分裂中期，這樣細(xì)胞染色體不能移向兩極而被阻止在分裂中期，這樣細(xì)胞不能繼續(xù)分裂，從而產(chǎn)生染色體數(shù)目加倍的核。不能繼續(xù)分裂，從而產(chǎn)生染色體數(shù)目加倍的核。 二）、孚爾根二）、孚爾根(Feulgen)核染色法原理核染色法原理 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNA在在1mol/L HCl 60水解時(shí)部分地破水解

6、時(shí)部分地破壞了脫氧核糖與嘌呤堿基之間的糖苷鍵而使嘌呤堿壞了脫氧核糖與嘌呤堿基之間的糖苷鍵而使嘌呤堿基脫掉，從而使脫氧核糖的第一個(gè)碳原子上潛在的基脫掉，從而使脫氧核糖的第一個(gè)碳原子上潛在的醛基暴露。醛基暴露。 無(wú)色的亞硫酸品紅（無(wú)色的亞硫酸品紅（Schiff試劑）是由偏重亞硫酸試劑）是由偏重亞硫酸鈉、鹽酸和堿性品紅配制成的。偏重亞硫酸鈉與鹽鈉、鹽酸和堿性品紅配制成的。偏重亞硫酸鈉與鹽酸能產(chǎn)生亞硫酸根，當(dāng)具有醌式結(jié)構(gòu)的堿性品紅分酸能產(chǎn)生亞硫酸根，當(dāng)具有醌式結(jié)構(gòu)的堿性品紅分子與亞硫酸根結(jié)合后，醌式結(jié)構(gòu)的共軛雙鍵被打開(kāi)，子與亞硫酸根結(jié)合后，醌式結(jié)構(gòu)的共軛雙鍵被打開(kāi)，堿性品紅變?yōu)闊o(wú)色。當(dāng)用這種無(wú)色的亞硫

7、酸品紅去堿性品紅變?yōu)闊o(wú)色。當(dāng)用這種無(wú)色的亞硫酸品紅去染色經(jīng)酸解的細(xì)胞時(shí)，就會(huì)與染色體染色經(jīng)酸解的細(xì)胞時(shí)，就會(huì)與染色體DNA上游離的上游離的醛基結(jié)合，又出現(xiàn)了醌式結(jié)構(gòu)，從而使醛基結(jié)合，又出現(xiàn)了醌式結(jié)構(gòu)，從而使DNA著色，著色，使染色體呈現(xiàn)出紅色。使染色體呈現(xiàn)出紅色。* 孚爾根染色法的優(yōu)點(diǎn)是制片清潔，染色體清晰，孚爾根染色法的優(yōu)點(diǎn)是制片清潔，染色體清晰，組織軟化好，易于壓片。其缺點(diǎn)是，染色體較軟，組織軟化好，易于壓片。其缺點(diǎn)是，染色體較軟，容易纏繞，不易分散，在加強(qiáng)前處理使染色體縮短容易纏繞，不易分散，在加強(qiáng)前處理使染色體縮短的情況下，可獲得較好的效果。的情況下，可獲得較好的效果。 三）、細(xì)胞微核

8、測(cè)試原理三）、細(xì)胞微核測(cè)試原理 微核微核(micronuclei, MCN) 是真核類生物細(xì)胞中的是真核類生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生的不可逆遺傳損傷。作用而產(chǎn)生的不可逆遺傳損傷。 一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，整條染色體或幾條染色體也能形成微片產(chǎn)生的，整條染色體或幾條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細(xì)胞分裂末期被兩個(gè)子核。這些斷片或染色體在細(xì)胞分裂末期被兩個(gè)子細(xì)胞核所排斥便形成第三個(gè)核塊。即在間期細(xì)胞細(xì)胞核所排斥便形成第三個(gè)核塊。即在間期細(xì)胞形成

9、時(shí)，核附近出現(xiàn)的一到幾個(gè)很小的圓形結(jié)構(gòu)，形成時(shí)，核附近出現(xiàn)的一到幾個(gè)很小的圓形結(jié)構(gòu)，直徑大約是主核直徑大約是主核1/3以下呈圓形、橢圓形或不規(guī)則以下呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，這就是微核（形，這就是微核（micronucleus） 微核測(cè)試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、微核測(cè)試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面方面,是一種比較理想的方法。是一種比較理想的方法。三、材料及用品三、材料及用品1、材料、材料洋蔥洋蔥/大蒜（大蒜（2n=16），刮去老根，放在小燒杯上，），刮去老根，放在小燒杯上，加水至剛與根部

10、接觸為止，室內(nèi)培養(yǎng)至新根長(zhǎng)出加水至剛與根部接觸為止，室內(nèi)培養(yǎng)至新根長(zhǎng)出0.51.0cm左右。分左右。分2組分別用于多倍體誘發(fā)和微組分別用于多倍體誘發(fā)和微核測(cè)試。核測(cè)試。2、器具及藥品、器具及藥品(1) 器具器具恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水浴槽，顯微鏡，磨口帶恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水浴槽，顯微鏡，磨口帶塞試管，鑷子，刀片，載玻片，蓋玻片，吸水紙。塞試管，鑷子，刀片，載玻片，蓋玻片，吸水紙。 (2) 藥品藥品0.01%0.05%的秋水仙素水溶液，卡諾氏固定的秋水仙素水溶液，卡諾氏固定液，液，1mol/L HCL，希夫（，希夫（Schiff）試劑，）試劑，10%偏重偏重亞硫酸鈉，亞硫酸鈉，1%醋酸洋紅等醋酸

11、洋紅等四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟（一）、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一：（一）、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一：1.用秋水仙素誘發(fā)植物產(chǎn)生多倍體；用秋水仙素誘發(fā)植物產(chǎn)生多倍體；2.通過(guò)取材、固定、解離、孚爾根染色法制片、通過(guò)取材、固定、解離、孚爾根染色法制片、鏡檢觀察。以室溫酸解洋蔥根尖材料與鏡檢觀察。以室溫酸解洋蔥根尖材料與60 C酸酸解做對(duì)照，用醋酸洋紅解做對(duì)照，用醋酸洋紅/改良石碳酸品紅染色方改良石碳酸品紅染色方法與孚爾根染色法作對(duì)照；法與孚爾根染色法作對(duì)照；3.找出根尖細(xì)胞中期分裂相，確定誘發(fā)成功的細(xì)找出根尖細(xì)胞中期分裂相，確定誘發(fā)成功的細(xì)胞，觀察加倍根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目。胞，觀察加倍根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目。 實(shí)

12、驗(yàn)內(nèi)容之二：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之二：1.學(xué)生自行設(shè)計(jì)處理方案，用化學(xué)藥劑或特定污學(xué)生自行設(shè)計(jì)處理方案，用化學(xué)藥劑或特定污染物處理洋蔥或大蒜根尖細(xì)胞，觀察細(xì)胞有絲染物處理洋蔥或大蒜根尖細(xì)胞，觀察細(xì)胞有絲分裂時(shí)染色體畸變（微核、粘連、聚結(jié)、斷裂分裂時(shí)染色體畸變（微核、粘連、聚結(jié)、斷裂等）。等）。（二）、（二）、 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟內(nèi)容之一內(nèi)容之一 植物多倍體人工誘發(fā)及鑒定植物多倍體人工誘發(fā)及鑒定1根尖培養(yǎng)根尖培養(yǎng)將洋蔥或大蒜刮去老根，室內(nèi)水培養(yǎng)至新根長(zhǎng)出將洋蔥或大蒜刮去老根，室內(nèi)水培養(yǎng)至新根長(zhǎng)出0.51.0cm左右。左右。2多倍體誘導(dǎo)多倍體誘導(dǎo)當(dāng)洋蔥或大蒜新根長(zhǎng)至當(dāng)洋蔥或大蒜新根長(zhǎng)至0.51.0cm左右時(shí)，用

13、含左右時(shí)，用含0.010.05%秋水仙素的水溶液，置陰暗處培養(yǎng)秋水仙素的水溶液，置陰暗處培養(yǎng)4h2d，及時(shí)觀察，至根尖膨大為止，再恢復(fù)生長(zhǎng)，及時(shí)觀察，至根尖膨大為止，再恢復(fù)生長(zhǎng)（學(xué)生查閱資料，自主設(shè)計(jì)秋水仙素濃度梯度和時(shí)（學(xué)生查閱資料，自主設(shè)計(jì)秋水仙素濃度梯度和時(shí)間梯度處理洋蔥根尖）。間梯度處理洋蔥根尖）。3固定固定恢復(fù)生長(zhǎng)的根尖用蒸餾水沖洗并用卡諾氏固定液恢復(fù)生長(zhǎng)的根尖用蒸餾水沖洗并用卡諾氏固定液(無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇:冰醋酸冰醋酸=3:1) 固定固定224h備用。備用。4解離解離固定好的根尖，加入適量預(yù)熱的固定好的根尖，加入適量預(yù)熱的1 mol/L鹽酸，鹽酸，60 C水浴水浴8-10分鐘。分鐘

14、。同時(shí)以室溫下的鹽酸解離根尖同時(shí)以室溫下的鹽酸解離根尖作對(duì)照。作對(duì)照。5染色染色將解離過(guò)的材料水洗將解離過(guò)的材料水洗3次，吸凈水分，加入希夫次，吸凈水分，加入希夫試劑，蓋好磨口試管塞，染色試劑，蓋好磨口試管塞，染色10分鐘（在黑暗條件分鐘（在黑暗條件下處理）。下處理）。以室溫下酸解和以室溫下酸解和1%醋酸洋紅染色作對(duì)照。醋酸洋紅染色作對(duì)照。6 漂洗漂洗希夫試劑染色后，先用蒸餾水沖洗，再用漂洗液希夫試劑染色后，先用蒸餾水沖洗，再用漂洗液密封漂洗密封漂洗3次，每次次，每次25分鐘，再水洗分鐘，再水洗23次。次。7 壓片壓片取根尖置于載玻片上，取分取根尖置于載玻片上，取分生區(qū)組織長(zhǎng)約生區(qū)組織長(zhǎng)約0.

15、5mm，壓碎，壓碎，加蓋玻片，覆以吸水紙壓片；加蓋玻片，覆以吸水紙壓片；必要時(shí)敲擊蓋玻片以利分散。必要時(shí)敲擊蓋玻片以利分散。8觀察觀察低倍鏡下尋找染色體分散良低倍鏡下尋找染色體分散良好的分裂相，換高倍鏡觀察并好的分裂相，換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，鑒別染色體計(jì)數(shù)染色體數(shù)目，鑒別染色體加倍的細(xì)胞和未加倍的細(xì)胞。加倍的細(xì)胞和未加倍的細(xì)胞。內(nèi)容之二內(nèi)容之二 植物細(xì)胞的微核檢測(cè)植物細(xì)胞的微核檢測(cè) 1、根尖培養(yǎng)：將洋蔥或大蒜刮去老根，室內(nèi)水培養(yǎng)至、根尖培養(yǎng)：將洋蔥或大蒜刮去老根，室內(nèi)水培養(yǎng)至新根長(zhǎng)出新根長(zhǎng)出0.51.0cm左右。左右。2、處理根尖：陽(yáng)性檢測(cè)采用、處理根尖：陽(yáng)性檢測(cè)采用 CrO3/ Na

16、N3/ EMS，另外另外自我設(shè)計(jì)自我設(shè)計(jì)1-2種測(cè)試物，種測(cè)試物，對(duì)照用自來(lái)水對(duì)照用自來(lái)水/蒸餾水處理，蒸餾水處理，處理時(shí)間處理時(shí)間24h。（必要時(shí)測(cè)試物濃度需稀釋，以免根尖腐爛）（必要時(shí)測(cè)試物濃度需稀釋，以免根尖腐爛）3、恢復(fù)培養(yǎng)：處理后的根尖用自來(lái)水浸洗、恢復(fù)培養(yǎng)：處理后的根尖用自來(lái)水浸洗3次，每次次，每次2-3min，洗凈后在水中恢復(fù)培養(yǎng)，洗凈后在水中恢復(fù)培養(yǎng)24h。4、固定、固定 (8:0010:00；14:3016:30) ：用甲醇：冰醋：用甲醇：冰醋酸（酸（3：1）固定液固定）固定液固定24h后棄去固定液，或換入后棄去固定液，或換入70酒精中保存。酒精中保存。5、酸解：棄去固定液，

17、用清水漂洗、酸解：棄去固定液，用清水漂洗2-3次，吸凈水，加次，吸凈水，加入入16 mol/L鹽酸，于室溫解離鹽酸，于室溫解離10min，棄去鹽酸，棄去鹽酸，漂洗根尖漂洗根尖2-3次，徹底洗凈鹽酸。次，徹底洗凈鹽酸。6、染色：截下、染色：截下0.5-1mm長(zhǎng)的根尖，滴加石炭酸品紅染長(zhǎng)的根尖，滴加石炭酸品紅染液，染色液，染色10min，加蓋玻片，壓片觀察、統(tǒng)計(jì)。，加蓋玻片，壓片觀察、統(tǒng)計(jì)。7、統(tǒng)計(jì)計(jì)算、統(tǒng)計(jì)計(jì)算微核千分率：微核千分率：MCN=（觀察到的微核細(xì)胞（觀察到的微核細(xì)胞數(shù)數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù)）觀察的細(xì)胞總數(shù)）1000染色體畸變率：染色體畸變率：CAF=（染色體畸變細(xì)胞數(shù)（染色體畸變細(xì)胞數(shù)/

18、分裂期的染色體細(xì)胞數(shù)）分裂期的染色體細(xì)胞數(shù)）100五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 染色體記數(shù)，區(qū)分染色體加倍和未加倍的染色體記數(shù)，區(qū)分染色體加倍和未加倍的細(xì)胞；細(xì)胞；2. 繪出所觀察到的多倍體細(xì)胞的顯微觀察圖；繪出所觀察到的多倍體細(xì)胞的顯微觀察圖；3. 總結(jié)說(shuō)明秋水仙素誘導(dǎo)洋蔥根尖多倍體的總結(jié)說(shuō)明秋水仙素誘導(dǎo)洋蔥根尖多倍體的最佳濃度和時(shí)間。最佳濃度和時(shí)間。4. 繪制細(xì)胞微核實(shí)物圖；繪制細(xì)胞微核實(shí)物圖；5. 每個(gè)根尖統(tǒng)計(jì)每個(gè)根尖統(tǒng)計(jì)1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每一處理個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每一處理（3個(gè)根尖）的平均微核千分率。個(gè)根尖）的平均微核千分率。六、思考題六、思考題1秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的原理是什么秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的原理是什么? 2根尖經(jīng)秋水仙素處理之后為什么會(huì)發(fā)生膨根尖經(jīng)秋水仙素處理之后為什么會(huì)發(fā)生膨大大?3對(duì)照對(duì)照f(shuō)eulgen染色中用熱鹽酸處理與否的染色中用熱鹽酸處理與否的鏡檢結(jié)果之異同，說(shuō)明水解時(shí)間和溫度對(duì)鏡檢結(jié)果