第二章 沉淀法

1、第一節(jié)第一節(jié) 基本原理與沉淀類型基本原理與沉淀類型第二節(jié)第二節(jié) 應用實例應用實例一、基本原理一、基本原理二、制備蛋白質(zhì)二、制備蛋白質(zhì)三、制備核酸三、制備核酸 根據(jù)各種物質(zhì)結構不同，改變?nèi)苜|(zhì)的性質(zhì)，致使根據(jù)各種物質(zhì)結構不同，改變?nèi)苜|(zhì)的性質(zhì)，致使抽提液有效成分抽提液有效成分溶解度變化。溶解度變化。 沉淀（沉淀（precipitationprecipitation）：在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)的溶解：在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)的溶解度降低，形成固相從溶液中析出，從而達到分離的一種技術度降低，形成固相從溶液中析出，從而達到分離的一種技術。 沉淀法沉淀法也稱溶解度法。其也稱溶解度法。其基本原理基本原理是是：

2、根據(jù)各種物根據(jù)各種物質(zhì)的結構差異（如蛋白質(zhì)分子表面疏水基團與親水基質(zhì)的結構差異（如蛋白質(zhì)分子表面疏水基團與親水基團之間比例的差異）來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)團之間比例的差異）來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)( (如如pHpH、極、極性、離子強度、金屬離子等性、離子強度、金屬離子等) )，就能使抽提液中的有效，就能使抽提液中的有效成分的溶解度發(fā)生變化。成分的溶解度發(fā)生變化。1. 1. 鹽析法鹽析法2. 2. 有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法3. 3. 蛋白質(zhì)沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法4. 4. 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法5. 5. 選擇性沉淀法選擇性沉淀法6. 6. 結晶沉淀法結晶沉淀法原理原理高濃度中性鹽存在下，使生物分

3、子在水溶液中溶解高濃度中性鹽存在下，使生物分子在水溶液中溶解的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀的方法，多用于蛋白質(zhì)（酶）的的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀的方法，多用于蛋白質(zhì)（酶）的分離。分離。常用的鹽類是常用的鹽類是硫酸銨硫酸銨。 成本低，不需要特別昂貴的設備。成本低，不需要特別昂貴的設備。 操作簡單、安全。操作簡單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。鹽溶：鹽溶： 鹽鹽 低時，低時，S S（蛋白質(zhì)的溶解度）隨（蛋白質(zhì)的溶解度）隨 鹽鹽 增加而增加而增加；增加；鹽析：鹽析： 鹽鹽 高時，高時，S S（蛋白質(zhì)的溶解度）隨（蛋白質(zhì)的溶解度）隨 鹽鹽 增加而增加而降低；降低；(1) (

4、1) 鹽分級沉淀鹽分級沉淀(2) (2) 鹽析曲線制作鹽析曲線制作(3) (3) 鹽析的影響因子鹽析的影響因子(4) (4) 脫鹽脫鹽a a. .溶解度大，對溫度不敏感溶解度大，對溫度不敏感.(.(水的溫度水的溫度= =2525，硫酸銨的飽和溶解度，硫酸銨的飽和溶解度= =769g769g, ,當水的當水的溫度溫度= =00時，其飽和溶解度高時，其飽和溶解度高= =679g679g, ,這是其他鹽類所不具備的。這是其他鹽類所不具備的。) )b.b.分級效果好分級效果好. .有些抽提液經(jīng)過加適量硫酸銨的一步分級沉淀處理后，就可除去雜有些抽提液經(jīng)過加適量硫酸銨的一步分級沉淀處理后，就可除去雜蛋白蛋

5、白7575以上；以上；c.c.有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結構的作用有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結構的作用. .將將2-3 mol2-3 molL L硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)置低溫下保存一年，硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)置低溫下保存一年，其性質(zhì)沒有變化；其性質(zhì)沒有變化；d.d.價格低廉，廢液可以肥田價格低廉，廢液可以肥田。 但是用硫酸銨或其他鹽類進行分級沉淀都有一個共同的但是用硫酸銨或其他鹽類進行分級沉淀都有一個共同的缺點缺點，即得到，即得到的樣品欲繼續(xù)純化時，需花一定時間的樣品欲繼續(xù)純化時，需花一定時間脫鹽脫鹽。 。 鹽的選擇：常選用硫酸銨鹽的選擇：常選用硫酸銨, ,其優(yōu)點其優(yōu)點：(1)(1)鹽分級沉淀鹽分級沉淀 A. A.固體法固體法：

6、逐步加入固體硫酸銨，當加到一定：逐步加入固體硫酸銨，當加到一定 的飽和度時，蛋白質(zhì)便可沉淀出來。的飽和度時，蛋白質(zhì)便可沉淀出來。 B. B.飽和溶液法：飽和溶液法：逐步加入預先調(diào)好逐步加入預先調(diào)好pHpH值的飽和硫酸銨，值的飽和硫酸銨， 蛋白質(zhì)便可沉淀出來。蛋白質(zhì)便可沉淀出來。 C. C.透析法透析法：透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，通過：透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，通過 透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，沉淀蛋白質(zhì)透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，沉淀蛋白質(zhì) 。 A.A.固體法固體法 鹽析后要在冰浴中放置一段時間，待沉淀鹽析后要在冰浴中放置一段時間，待沉淀完全后再離心與過濾。在完

7、全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中低濃度硫酸銨中鹽析可采用鹽析可采用離心分離心分離離，高濃度硫酸銨常用過濾方法高濃度硫酸銨常用過濾方法。各種飽和度下需加固體硫。各種飽和度下需加固體硫酸銨的量。酸銨的量。 （1 1）計算法）計算法X=GX=G（p p2 2-p-p1 1）/1-Ap/1-Ap2 2 G G為經(jīng)驗常數(shù)，為經(jīng)驗常數(shù)，0 5150 515，20 51320 513 A A為常數(shù)為常數(shù) 0 0.27 20 0.29 0 0.27 20 0.29P P2 2、P P1 1為初始和最終溶液的飽和度為初始和最終溶液的飽和度 X X為為1L1L溶液所需加入的硫酸銨的克數(shù)溶液所需加入的硫酸銨的克數(shù)

8、 （2 2）查表法）查表法 B.B.飽和溶液法飽和溶液法 這是一種這是一種使蛋白質(zhì)脫水沉淀比較溫使蛋白質(zhì)脫水沉淀比較溫和的力法和的力法。其操作是在蛋白質(zhì)溶液中逐步加人預先調(diào)好。其操作是在蛋白質(zhì)溶液中逐步加人預先調(diào)好pHpH的的飽和硫酸銨溶液，不同飽和硫酸銨溶液，不同飽和度所需的飽和硫酸銨溶液，不同飽和硫酸銨溶液，不同飽和度所需的硫酸銨的量可用下列公式表示：硫酸銨的量可用下列公式表示：V V表示需要加入硫酸銨溶液的體積表示需要加入硫酸銨溶液的體積(ml)(ml)；V V0 0表示原來溶劑的體積表示原來溶劑的體積(m1)(m1)；S1S1和和S2S2含義同上；含義同上；S3S3表示需要加入硫酸銨溶

9、液的飽和度表示需要加入硫酸銨溶液的飽和度( (一般用百分之百一般用百分之百) )。 此法比加入固體硫酸銨沉淀法此法比加入固體硫酸銨沉淀法溫和溫和，但是對，但是對于于大體積樣品不適用大體積樣品不適用。因為硫酸銨溶液的大量加。因為硫酸銨溶液的大量加入，將導致樣品溶液體積增加。例如，當樣品達入，將導致樣品溶液體積增加。例如，當樣品達到到5050硫酸銨飽和度時，其體積增加一倍硫酸銨飽和度時，其體積增加一倍。C.C.透析法：透析法：透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，透析袋放入一定濃度的大體積溶液中，通過透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，通過透析作用來改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度，沉淀蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)。 此

10、法僅在要求較精確、樣品體積小的試驗使用。此法僅在要求較精確、樣品體積小的試驗使用。 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，則應先確定沉淀該如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，則應先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下具體操作方法如下： 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力或酶活力 硫銨飽和度硫銨飽和度 （2 2）鹽析曲線的制作）鹽析曲線的制作 l鹽的種類：影響鹽的種類：影響KS，KS越大，效果越好越大，效果越好l 溶質(zhì)的起始濃度溶質(zhì)的起始濃度l 鹽析劑用量鹽析劑用量l溫度和溫度和pH：影響：影響值而影響值而影響S。尤其是

11、影響相對溶解度。尤其是影響相對溶解度l雜質(zhì)雜質(zhì) 透析法注意事項透析法注意事項 透析帶處理：用蒸餾水洗凈，檢查無漏洞透析帶處理：用蒸餾水洗凈，檢查無漏洞 透析液選擇：一般為低離子強度中性緩沖液透析液選擇：一般為低離子強度中性緩沖液 掌握透析時間：攪拌，樣品液與透析液體積掌握透析時間：攪拌，樣品液與透析液體積 比為比為1 1：1010，3h.3h. (4)(4)脫鹽：凝膠過濾法和透析法脫鹽：凝膠過濾法和透析法 降低水溶液的介電常數(shù)降低水溶液的介電常數(shù)。向溶液中加入有機溶劑能降低溶向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱

12、了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。質(zhì)分子間的相互作用力，導致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。 2 2 . .有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法基本原理基本原理常用有機溶劑：常用有機溶劑：乙醇、甲醇、丙酮乙醇、甲醇、丙酮等。等。缺點缺點：容易引起蛋白質(zhì)變性失活，并且有機溶劑易燃、易爆，容易引起蛋白質(zhì)變性失活，并且有機溶劑

13、易燃、易爆，對安全要求較高。對安全要求較高。 優(yōu)點：優(yōu)點：分辨能力比鹽析法高，一種溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶分辨能力比鹽析法高，一種溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑范圍內(nèi)沉淀；劑范圍內(nèi)沉淀；沉淀不需脫鹽；沉淀不需脫鹽；有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，容易進行固液分離；有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，容易進行固液分離；有機溶劑容易蒸發(fā)，不會在成品中殘留，適用于食品、藥有機溶劑容易蒸發(fā)，不會在成品中殘留，適用于食品、藥品的制備。品的制備。注意事項注意事項 (1) (1)低溫下操作低溫下操作 防止有機溶劑的放熱使蛋白變性防止有機溶劑的放熱使蛋白變性 (2) (2)中性鹽作用中性鹽作用 增加蛋白質(zhì)溶解

14、度，防變性增加蛋白質(zhì)溶解度，防變性 (3) (3)多價陽離子作用多價陽離子作用 結合蛋白質(zhì)，致其溶解度降低結合蛋白質(zhì)，致其溶解度降低 蛋白質(zhì)沉淀法所用的試劑則僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起蛋白質(zhì)沉淀法所用的試劑則僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。(1)(1)堿性蛋白質(zhì)堿性蛋白質(zhì)：如魚精蛋白，除能有效地沉淀核酸物質(zhì)外，：如魚精蛋白，除能有效地沉淀核酸物質(zhì)外，還能沉淀某些蛋白質(zhì)。當把魚精蛋白加入部分純化的酵母磷還能沉淀某些蛋白質(zhì)。當把魚精蛋白加入部分純化的酵母磷酸果糖激酶溶液時，溶液中的酶蛋白便吸附到魚精蛋白核酸酸果糖激酶溶

15、液時，溶液中的酶蛋白便吸附到魚精蛋白核酸沉淀物上。沉淀物用磷酸緩沖液洗脫后，收得的磷酸果糖激沉淀物上。沉淀物用磷酸緩沖液洗脫后，收得的磷酸果糖激酶的純度比原來提高了酶的純度比原來提高了9 9倍。倍。 (2)(2)凝集素凝集素：為一種特殊的蛋白質(zhì)，對糖蛋白中糖鏈的末端序：為一種特殊的蛋白質(zhì)，對糖蛋白中糖鏈的末端序列具有明顯、特異的凝集力。列具有明顯、特異的凝集力。如如伴刀豆球蛋白與含有葡萄糖、伴刀豆球蛋白與含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)生特異的凝集沉淀作用，通過離心甘露糖等分子的糖蛋白能發(fā)生特異的凝集沉淀作用，通過離心操作可把糖蛋白和一般蛋白質(zhì)分開，再用單糖作抑制劑就能使操作可把糖蛋白和一

16、般蛋白質(zhì)分開，再用單糖作抑制劑就能使其解離。該沉淀法反應條件較溫和，專一性強。其解離。該沉淀法反應條件較溫和，專一性強。 (3)(3)重金屬：重金屬：重金屬鹽重金屬鹽( (如鉛鹽、汞鹽如鉛鹽、汞鹽) )作為蛋白質(zhì)沉淀劑，也作為蛋白質(zhì)沉淀劑，也能將蛋白質(zhì)或酶得到純化。由于重金屬會使蛋白質(zhì)變性，因此能將蛋白質(zhì)或酶得到純化。由于重金屬會使蛋白質(zhì)變性，因此應用時要控制在較溫和的條件下進行，并要及時通過透析方法應用時要控制在較溫和的條件下進行，并要及時通過透析方法把蛋白質(zhì)與重金屬盡快分開。把蛋白質(zhì)與重金屬盡快分開。 “聚乙二醇聚乙二醇” )” ) ， 簡寫為簡寫為 PEG PEG ，HOCH2(CH2O

17、CH2)nCH2OH(n4）本方法的優(yōu)點是：本方法的優(yōu)點是：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，少量的沉淀效能高，少量的PEGPEG即可以沉淀相當多的生物大分子。即可以沉淀相當多的生物大分子。沉淀后有機聚合物容易去除。沉淀后有機聚合物容易去除。因此應用范圍頗廣。但是，它也受各種因子如因此應用范圍頗廣。但是，它也受各種因子如pHpH、離子強度、離子強度、蛋白質(zhì)濃度以及聚合物分子質(zhì)量的影響。蛋白質(zhì)濃度以及聚合物分子質(zhì)量的影響。如從酵母菌細胞中純化醇脫氫酶時采用了改變溫度的選如從酵母菌細胞中純化醇脫氫酶時采用了改變溫度的選擇性沉淀法，即酵母于粉中加

18、擇性沉淀法，即酵母于粉中加0.066mol0.066molL L磷酸氫二鈉溶液，磷酸氫二鈉溶液，3737水浴保溫水浴保溫2h2h，室溫攪拌，室溫攪拌3h3h，離心收集上清液，升溫至，離心收集上清液，升溫至5555，保持，保持20min20min后迅速冷卻，離心去除熱變性蛋白，上清液后迅速冷卻，離心去除熱變性蛋白，上清液即為熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液。即為熱穩(wěn)定的醇脫氫酶溶液。 案例案例l 蛋白質(zhì)沉淀可分為晶體沉淀和無定形沉淀兩類，前者分子蛋白質(zhì)沉淀可分為晶體沉淀和無定形沉淀兩類，前者分子排列有規(guī)則，后者分子排列無規(guī)則排列有規(guī)則，后者分子排列無規(guī)則l在提純階段，當某一蛋白質(zhì)濃度達到在提純階段，當某一蛋

19、白質(zhì)濃度達到5%- 30%5%- 30%水平時，只要水平時，只要條件合適，就能產(chǎn)生一定形狀的晶體條件合適，就能產(chǎn)生一定形狀的晶體。l 1 1DNPDNPRNPRNP復合物的解聚復合物的解聚 主要是采用加入去污劑、有機溶劑或蛋白水解酶等試劑來實現(xiàn)的。主要是采用加入去污劑、有機溶劑或蛋白水解酶等試劑來實現(xiàn)的。 (1)(1)去污劑去污劑 十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉(SDS)(SDS) 十二烷基肌氨酸鈉十二烷基肌氨酸鈉CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COO-Na+CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COO-Na+、 脫氧膽酸鈉脫氧膽酸鈉(DOC)(DOC)、 聚氧乙基十六烷基酚醚聚氧

20、乙基十六烷基酚醚(Triton x(Triton x一一100)100) 吐溫吐溫40(Tween40)40(Tween40) NP-40 NP-40變性劑：變性劑：苯酚、氯仿苯酚、氯仿 注意點注意點：P31P31優(yōu)點優(yōu)點： 注意點注意點： (1)(1)多糖多糖動物和植物材料為提取對象：動物和植物材料為提取對象： 前處理前處理-饑餓饑餓12h12h，置暗室培養(yǎng)數(shù)天，置暗室培養(yǎng)數(shù)天 沉淀法：異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨沉淀法：異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB(CTAB） 萃取法：等體積萃取法：等體積2 25mol5molL L磷酸緩沖液和磷酸緩沖液和等體積乙二醇甲醚等體積乙二醇甲醚鹽析法鹽

21、析法：在提取：在提取DNADNA時，時，RNARNA屬雜質(zhì)；反之，屬雜質(zhì)；反之，DNADNA是雜質(zhì)。根據(jù)它們在不同濃度的鹽中溶解度不同達到是雜質(zhì)。根據(jù)它們在不同濃度的鹽中溶解度不同達到分離的目的。分離的目的。 酶水解法：酶水解法：提取提取DNADNA時，可用時，可用RNaseRNase水解水解RNARNA雜質(zhì)；雜質(zhì)；在提取在提取RNARNA時，可用時，可用DNaseDNase水解水解DNADNA雜質(zhì)。雜質(zhì)。 注意點注意點l在核酸溶液中加入某些有機溶劑和非離子型聚在核酸溶液中加入某些有機溶劑和非離子型聚合物等試劑時，核酸會被有效地沉淀出來。合物等試劑時，核酸會被有效地沉淀出來。l(1)(1)有機

22、溶劑有機溶劑l 乙醇乙醇- -鹽溶液：核酸的鈉鹽或鉀鹽在多數(shù)有鹽溶液：核酸的鈉鹽或鉀鹽在多數(shù)有機溶劑機溶劑( (如乙醇、異丙醇如乙醇、異丙醇) )中是不溶解的。中是不溶解的。 在含在含DNA(DNA(或大分子或大分子rRNA)rRNA)的溶液中，加入的溶液中，加入0.3mol0.3molL NaACL NaAC和和0.540.541 1倍體積的異丙醇，放置短時間后，經(jīng)離心即可得到倍體積的異丙醇，放置短時間后，經(jīng)離心即可得到核酸沉淀物質(zhì)，而多糖及小分子核酸沉淀物質(zhì)，而多糖及小分子RNARNA則分布于上清液中。則分布于上清液中。 缺點：缺點：但異丙醇沸點高，從核酸中不易除去，蔗糖、但異丙醇沸點高，

23、從核酸中不易除去，蔗糖、 NaCl NaCl等等在低溫下易和在低溫下易和DNADNA產(chǎn)生共沉淀。產(chǎn)生共沉淀。加聚乙二醇加聚乙二醇(PEG)(PEG)一一0.5mol0.5molL NaClL NaCl溶液到核酸溶溶液到核酸溶液中，可使液中，可使2kb2kb的的DNADNA片段沉淀出來。片段沉淀出來。PEGPEG的濃度與的濃度與DNADNA片段的分子質(zhì)量成反比。接著加乙醇沉淀核酸或用氯片段的分子質(zhì)量成反比。接著加乙醇沉淀核酸或用氯仿抽提除去仿抽提除去PEGPEG。 在多糖含量較高的核酸溶液中，加入在多糖含量較高的核酸溶液中，加入1 1CTABCTAB和和0.35mol0.35molL NaClL

24、 NaCl，可得到，可得到CTA-CTA-核酸沉淀物核酸沉淀物( (多糖滯留多糖滯留在溶液中在溶液中) )。隨后用。隨后用0.lmol0.lmolL NaAC-70L NaAC-70乙酸洗滌，乙酸洗滌，就能將就能將CTACTA+ +從沉淀物中置換出來，和乙酸生成可溶性從沉淀物中置換出來，和乙酸生成可溶性十六烷基三甲基乙酸銨，離心后存在于上清液中，而十六烷基三甲基乙酸銨，離心后存在于上清液中，而核酸形成鈉鹽，在核酸形成鈉鹽，在7070乙醇中仍為沉淀物。乙醇中仍為沉淀物。3)3)十六烷基三甲基溴化銨十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(CTAB)l水稻葉片水稻葉片中中提取提取DNADNAl(1)(1)稱取稱取- -剪碎。剪碎。稱取約稱取約0.1g0.1g葉片，剪碎后放在葉片，剪碎后放在2ml2ml離心管中。離心管中。置離心管于液氮中，用竹簽將葉片搗碎。置離心管于液氮中，用竹簽將葉片搗碎。l(3)(3)進一步粉碎。進一步粉碎。每個離心管中加三粒鋼珠（使用之前最好在液氮每個離心管中加三粒鋼珠（使用之前最好在液氮里浸一下），而后置振蕩器上高速振蕩里浸一下），而后置振蕩器上高速振蕩3 3次，每次次，每次2020秒（將葉片進秒（將葉片進一步粉碎）。一步粉碎）。l(4)(4)抽提。抽提。取出離心管中的鋼珠，加取出離心管中的鋼珠，