志賀氏菌檢驗(yàn)

1、志賀氏菌的檢驗(yàn)志賀氏菌的檢驗(yàn) 一、流行病學(xué)簡(jiǎn)介 一種古老的腸道傳染性腹瀉。19世紀(jì)曾出現(xiàn)全世界菌痢的大流行。 1899年，日本人志賀氏首先發(fā)現(xiàn)菌痢是由痢疾桿菌引起。 第一次世界大戰(zhàn)期間（1914-1918年），德國(guó)死于痢疾者約4萬余人，并進(jìn)一步證實(shí)痢疾桿菌是菌痢流行的病原。 細(xì)菌性痢疾歷年來一直是我國(guó)夏秋季發(fā)病率最高的腸道傳染病。 近年來報(bào)道非洲及中美洲流行的痢疾志賀菌病死率達(dá)5%-15%。 我國(guó)屬發(fā)展中國(guó)家，人民的生活條件雖然在不斷改善，但由于部分地區(qū)衛(wèi)生知識(shí)普及不夠，食品衛(wèi)生管理、監(jiān)督不力，使得志賀菌的感染在我國(guó)傳染病中多年來一直處于較高的地位。 每年均有志賀菌感染暴發(fā)的報(bào)告，每次暴發(fā)的發(fā)

2、病人數(shù)在數(shù)十人到上千人不等。多數(shù)由于食物和飲水污染引起。 1994年5月11日，江蘇省無錫市發(fā)生一起26所小學(xué)的學(xué)生因課間餐食用豆奶導(dǎo)致1345人食物中毒的事故，后經(jīng)調(diào)查是一起志賀菌和致病性大腸桿菌混合感染引起的食物中毒，此次爆發(fā)波及范圍之大，發(fā)病人數(shù)之多，在我國(guó)歷史上頗為少見。 志賀菌致病力強(qiáng)，少量細(xì)菌進(jìn)入人體即可引起發(fā)病。是否發(fā)病，取決于細(xì)菌數(shù)量、致病力（粘附、侵襲力、毒素）和人體的抵抗力。 各種志賀菌都可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的內(nèi)毒素，是引起全身毒血癥的主要因素。志賀菌還可產(chǎn)生外毒素（志賀毒素），具有神經(jīng)毒、細(xì)胞毒和腸毒性作用，能引起更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)如溶血性尿毒綜合癥等。二、生物學(xué)特性二、生物學(xué)特性

3、 （一）、形態(tài)與染色（一）、形態(tài)與染色 革蘭氏陰性短桿菌、無莢膜，無芽胞，無革蘭氏陰性短桿菌、無莢膜，無芽胞，無鞭毛鞭毛 23um*0.50.7um （二）、培養(yǎng)特性（二）、培養(yǎng)特性1 、 需 氧 或 兼 氧 性 厭 氧 ， 最 適 溫 度、 需 氧 或 兼 氧 性 厭 氧 ， 最 適 溫 度 3 7 ，PH7.27.42、在普通瓊脂和、在普通瓊脂和SS平板上，能形成圓形、微凸、平板上，能形成圓形、微凸、光滑濕潤(rùn)、無色半透明、邊緣整齊、在中等大小光滑濕潤(rùn)、無色半透明、邊緣整齊、在中等大小的菌落的菌落3、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁、宋氏志賀氏菌菌落較大，較不透明，粗糙而扁平，在平，

4、在SS平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。平板上可遲發(fā)酵乳糖，菌落呈玫瑰紅色。4、在肉湯中呈均勻混濁生長(zhǎng)，無菌膜。、在肉湯中呈均勻混濁生長(zhǎng)，無菌膜。 （三）、生化反應(yīng)（三）、生化反應(yīng)1、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀、發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，除宋氏志賀氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。氏菌外，均不發(fā)酵乳糖。2、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。、不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、肌醇、水楊苷。3、不產(chǎn)生、不產(chǎn)生H2S，不分解尿素，不分解尿素，V-P試驗(yàn)陰性，試驗(yàn)陰性，不能利用檸檬酸鹽。不能利用檸檬酸鹽。4、甲基紅陽性。、甲基紅陽性。（四）、抗原結(jié)構(gòu)四）、抗原結(jié)構(gòu)1、抗原構(gòu)成：、抗原構(gòu)成：O抗原：抗原： 群特異性抗原：群

5、特異性抗原：A、B、C、D K抗原：除抗原：除B群外，一般有群外，一般有K抗原抗原2、志賀氏菌的分群與血清型、志賀氏菌的分群與血清型志賀氏菌分為四群：志賀氏菌分為四群：A群（痢疾志賀氏菌）：群（痢疾志賀氏菌）：110型型 B群（福氏志賀氏菌）：群（福氏志賀氏菌）：16型型+X、Y兩個(gè)變種，兩個(gè)變種，C群（鮑氏志賀氏菌群（鮑氏志賀氏菌 ）：）：115型型D群（宋內(nèi)氏志賀氏菌）群（宋內(nèi)氏志賀氏菌） ：1個(gè)型個(gè)型三、志賀氏菌檢驗(yàn)GB 4789.5-20121.1.以原國(guó)標(biāo)為基礎(chǔ)，保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性以原國(guó)標(biāo)為基礎(chǔ)，保持與原標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)性 考慮基層單位方法的可操作性，對(duì)增菌步驟、培養(yǎng)條件盡可能簡(jiǎn)化；生化

6、反應(yīng)方面亦盡量沿用原標(biāo)準(zhǔn)中的方法2.2.與國(guó)際接軌的原則與國(guó)際接軌的原則 該標(biāo)準(zhǔn)的起草內(nèi)容主要參考了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)組織ISO標(biāo)準(zhǔn) ，部分參考采用了美國(guó)FDA、NMKL等標(biāo)準(zhǔn)3.3.與現(xiàn)有已頒布的新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)與現(xiàn)有已頒布的新版國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)統(tǒng)一統(tǒng)一 參考了已頒布的2008版國(guó)標(biāo)，在樣品的前處理步驟，培養(yǎng)條件的選擇，文字描述等方面盡量 保持一致。 GB/T 4789.5-2003標(biāo)準(zhǔn)不足處1. 采用GN增菌肉湯,37需氧培養(yǎng),4小時(shí)后大腸菌的生長(zhǎng)速度大大超過志賀氏菌, 檢測(cè)效果較差2. 使用的分離平板SS對(duì)志賀1型有抑制3. 檢驗(yàn)方法與現(xiàn)行的其它國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)存在差異增菌：用增菌：用GN增菌液使增菌液使處

7、于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力恢復(fù)活力選擇性平板分離培養(yǎng)：選擇性平板分離培養(yǎng)：XLD+MAC/顯色培顯色培養(yǎng)基養(yǎng)基生化試驗(yàn)：可采用生化試驗(yàn)：可采用API 20E或或VITEK2血清學(xué)鑒定：特異性血清學(xué)鑒定：特異性診斷血清鑒定到種。診斷血清鑒定到種。 志賀氏菌操作流程修 改 的 內(nèi) 容 增菌部分增菌部分志賀氏菌增菌液（新生霉素志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL0.5 g/mL ） 原國(guó)標(biāo)：GN ISO ：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL ） FDA：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL 和3 g/mL ） NMKL：志賀氏菌增菌液（新生霉素0.5 g/mL ）培養(yǎng)條

8、件培養(yǎng)條件：41.541.51 1 厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng) 原國(guó)標(biāo)： 37需氧培養(yǎng) ISO： 41.5厭氧培養(yǎng) FDA： 42（除宋內(nèi)其他志賀菌) 和44（宋內(nèi)）厭氧培養(yǎng) NMKL： 42厭氧培養(yǎng) 分離用平板分離用平板 原國(guó)標(biāo)：HE或SS; MAC或EMB ISO： MAC、 XLD 、 HE FDA： MAC NMKL： MAC、 XLD 、 HE（一）增（一）增 菌菌 培培 養(yǎng)養(yǎng)用志賀氏菌增菌液增菌, 41.5 ，16 h20 h厭氧培養(yǎng)。智能厭氧微需氧培養(yǎng)系統(tǒng)（二）分 離 培 養(yǎng) 取增菌后的GN增菌液或志賀氏增菌肉湯分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或R&F志賀氏菌顯色培養(yǎng)基

9、平板上 于36 1 培養(yǎng)20 h24 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài) 若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h再進(jìn)行觀察。菌 落 特 征 MAC瓊脂 ：無色至淺粉紅色，半透明、光滑、 濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑23 mm XLD瓊脂 ：粉紅色至無色，半透明、光滑、 濕潤(rùn)、圓形、邊緣整齊或不齊，直徑1 2 mm R&F志賀氏菌顯色瓊脂 ：白色，不透明、圓形、邊緣不整齊，直徑1 mm3 mm，菌落周圍瓊脂顏色變?yōu)樽霞t色志志 顯顯1 1 宋內(nèi)氏典型菌落宋內(nèi)氏典型菌落XLD2 2 福氏典型菌落福氏典型菌落志顯志顯XLDXLD3 3 鮑氏典型菌落鮑氏典型菌落志顯志顯XL

10、D4 4 痢疾典型菌落痢疾典型菌落志顯志顯5 5 熟肉制品中宋內(nèi)的分離效果熟肉制品中宋內(nèi)的分離效果R&F志顯志顯XLD志顯志顯6 6 蔬菜制品中宋內(nèi)分離效果蔬菜制品中宋內(nèi)分離效果XLD志顯志顯7 7 鮑氏在生肉中的分離效果鮑氏在生肉中的分離效果XLD8 8 熟肉制品中福氏的分離效果熟肉制品中福氏的分離效果志志 顯顯（四）初（四）初 步步 生生 化化 選取平板上5個(gè)或5個(gè)以上可疑菌落接種TSI、葡萄糖半固體、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，36 1 培養(yǎng)20 h24 h， 觀察結(jié)果。 培養(yǎng)物中出現(xiàn)以下情況可以棄去 a.在三糖鐵瓊脂斜面上蔓延生長(zhǎng) b.發(fā)酵乳糖或蔗糖 c.不分解葡萄糖和只生長(zhǎng)在半固體表面的

11、d.產(chǎn)氣的 e.產(chǎn)生硫化氫 f.有動(dòng)力的培養(yǎng)物初步生化初步生化: :三糖鐵（三糖鐵（TSITSI）現(xiàn)象現(xiàn)象說說 明明底層底層黃色黃色葡萄糖陽性葡萄糖陽性紅色或紅色或不變色不變色葡萄糖陰性葡萄糖陰性黑色黑色產(chǎn)產(chǎn)H2S氣泡氣泡產(chǎn)氣產(chǎn)氣斜面斜面黃色黃色乳糖和（或）蔗糖陽性乳糖和（或）蔗糖陽性紅色或紅色或不變色不變色乳糖和（或）蔗糖陰性乳糖和（或）蔗糖陰性志賀氏菌都能分解葡萄糖，志賀氏菌都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，大多不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)生乳糖，不產(chǎn)生H H2 2S S。 如圖如圖中中2 2號(hào)管的反應(yīng)號(hào)管的反應(yīng). .生化反應(yīng)A群：痢疾志賀氏菌B群：福氏志賀氏菌C群：鮑氏志賀氏菌D群：

12、宋內(nèi)氏志賀氏菌-半乳糖苷酶cc尿素賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶a水楊苷七葉苷靛基質(zhì)/()/甘露醇b棉子糖甘油()()d注：+陽性；-陰性；-/+多數(shù)陰性；+/-多數(shù)陽性；（+）遲緩陽性；d有不同生化型。a 鮑氏13型為鳥氨酸陽性。b福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。c痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽性。志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特征志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特征附加生化實(shí)驗(yàn) 由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集；因此前面生化實(shí)驗(yàn)符合志賀氏

13、菌屬生化特性的培養(yǎng)物還需另加葡萄糖胺、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(yàn)(36 培養(yǎng)24 h48 h)。志賀氏菌屬和不活潑大腸埃希氏菌、A-D菌的生化特性區(qū)別見表3 （五）生化鑒定 增加了增加了API 20EAPI 20E診斷試劑條和全自動(dòng)細(xì)菌生診斷試劑條和全自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定儀化鑒定儀VITEKVITEK；（六）血清學(xué)鑒定1.抗原的準(zhǔn)備抗原的準(zhǔn)備 志賀氏菌屬?zèng)]有動(dòng)力，所以沒有鞭毛抗原。 抗原構(gòu)造與分型：志賀氏菌屬細(xì)菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。 O抗原為糖脂蛋白復(fù)合物，可分為型特異性抗原和群特異性抗原。志賀氏菌分為4個(gè)群，48個(gè)血清型（包括亞型及變種）。K抗原在志賀菌屬分類上無意

14、義。菌體（菌體（0）抗原）抗原 1.型特異性抗原：化學(xué)組成為多糖，是光滑型菌株所含有的重要抗原。當(dāng)菌株變?yōu)榇植谛蜁r(shí)，此抗原也常隨之消失，根據(jù)所含的型抗原不同，可將志賀菌屬分為A、B、C、D四個(gè)群及39個(gè)抗原型。 2.群特異性抗原：為光滑型菌株的次要抗原，也是菌體抗原的一種。特異性較低，主要存在于B群。根據(jù)所含的群抗原不同，可將一些菌型分為多種亞型。表面抗原（表面抗原（K抗原）抗原） 在新分離的某些菌株菌體表面含有此種抗原。不耐熱，加熱1001小時(shí)即被破壞。具有此種抗原的菌株，可阻止菌體抗原與相應(yīng)免疫血清發(fā)生凝集。2.2.凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)3.3.血清學(xué)分型（選做項(xiàng)目）血清學(xué)分型（選做項(xiàng)目） 先用

15、四種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，如果呈現(xiàn)凝集，則再用相應(yīng)各群多價(jià)血清分別試驗(yàn)。先用B群福氏志賀氏菌多價(jià)血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如呈現(xiàn)凝集，再用其群和型因子血清分別檢查，福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原鑒別見表4。如果B群多價(jià)血清不凝集，則用D群宋內(nèi)氏志賀氏菌血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如呈現(xiàn)凝集，則用其相和相血清檢查；如果B、D群多價(jià)血清都不凝集，則用A群痢疾志賀氏菌多價(jià)血清及112各型因子血清檢查，如果上述三種多價(jià)血清都不凝集，可用C群鮑氏志賀氏菌多價(jià)檢查，并進(jìn)一步用118各型因子血清檢查。 志賀氏菌的志賀氏菌的O抗原抗原 人們?cè)瓉淼恼J(rèn)識(shí)認(rèn)為血清學(xué)試驗(yàn)是特異性人們?cè)瓉淼恼J(rèn)識(shí)認(rèn)為血清學(xué)試驗(yàn)是特異性的，但是志賀氏菌的的

16、，但是志賀氏菌的 O抗原和大腸埃希氏抗原和大腸埃希氏菌屬關(guān)系密切，有半數(shù)的菌型與大腸埃希菌屬關(guān)系密切，有半數(shù)的菌型與大腸埃希氏菌的某些氏菌的某些O抗原完全相同。相同抗原菌屬抗原完全相同。相同抗原菌屬間存在血清交叉凝集反應(yīng)。因此，生化試間存在血清交叉凝集反應(yīng)。因此，生化試驗(yàn)對(duì)于屬的鑒定是非常重要的。驗(yàn)對(duì)于屬的鑒定是非常重要的。志賀氏菌屬與大腸埃希氏菌的志賀氏菌屬與大腸埃希氏菌的O抗原關(guān)系抗原關(guān)系 O抗原完全相同的抗原完全相同的： O抗原部分相同的抗原部分相同的: : 志賀氏菌屬 大腸埃希氏菌 志賀氏菌屬 大腸埃希氏菌 A2 。112ac A1 1, 120. A3 。124 A2 149 A4 3588-51 A3 164. A5 58 A4 88，159. A12 (3341-55) 152 A6 130 B2b 147ab A7 121 B3a 5444-80 A8 38, 23 B4b 135 A10 . 144 B5 129 A11 29 C1 149 A12