QPCR技術(shù)細(xì)節(jié)

1、程濤程濤中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)節(jié)決定成敗QPCRQPCR的技術(shù)細(xì)節(jié)對實驗結(jié)果的影響的技術(shù)細(xì)節(jié)對實驗結(jié)果的影響內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實驗流程及注意事項實驗流程及注意事項 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法實時定量實時定量PCR技術(shù)：技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析與常規(guī)與常規(guī) PCR技術(shù)比較：技術(shù)比較：對PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析，無法對起始

2、模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反應(yīng)實時檢測熒光定量熒光定量PCR原理原理 擴增曲線擴增曲線 熒光閾值熒光閾值 Ct值值熒光定量熒光定量PCR原理原理 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNA擴增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。擴增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。 反應(yīng)初期反應(yīng)初期，目的，目的DNA片段呈片段呈指數(shù)擴增指數(shù)擴增。隨著目的。隨著目的DNA產(chǎn)產(chǎn)物逐漸積累，在引物一模板與物逐漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達到一定比例時，聚合酶達到一定比例時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時擴增酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時擴增DNA片段的增加減慢進入片段的增加減慢進入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)停滯效應(yīng)”，

3、又稱，又稱“平臺期平臺期”。到。到達平臺期所需達平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴增效率、擴增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等因素。到達平臺期前，競爭等因素。到達平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進行聚合酶一般要進行25次次以上以上PCR循環(huán)。循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺期在多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應(yīng)中不可避免。反應(yīng)中不可避免。 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律產(chǎn)物的積累規(guī)律 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖熒光定量熒光定量PCR定量原理定量原理擴增曲線熒光定量熒光定量PCR定量原

4、理定量原理為什么終點定量不準(zhǔn)確呢？為什么終點定量不準(zhǔn)確呢？熒光定量熒光定量PCR定量原理定量原理 盡管終點產(chǎn)物的量不恒定，但人們發(fā)現(xiàn)盡管終點產(chǎn)物的量不恒定，但人們發(fā)現(xiàn)CtCt（cycle thresholdcycle threshold）與模板起始濃度有密切聯(lián)系。與模板起始濃度有密切聯(lián)系。Ct值的定義：值的定義： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)CycleCycle（循環(huán)數(shù)）（循環(huán)數(shù)）RnRn（熒光強度）（熒光強度）Ct value 熒光定量熒光定量PCR原理原理CtCt值值1 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline）1 熒光閾值的缺省設(shè)置是

5、315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍1 手動設(shè)置：大于熒光背景值和陰性對照的熒光最高值；進入指數(shù)期的最初階段1 真正的信號:熒光信號超過閾值熒光定量熒光定量PCR原理原理熒光閾值熒光閾值定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理定量定量PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理Cycle numberCycle numberCk 104Ck 102SampleLog of DNA concentration1 模板DNA量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。1 Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系。線性關(guān)系、擴增效率確認(rèn)線性關(guān)系、擴增效

6、率確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)檢測靈敏度確認(rèn)No Template Control(NTC)No Template Control(NTC)確認(rèn)確認(rèn)PCRPCR擴增效率（擴增效率（E E）:0.9-1.1:0.9-1.135Cycles35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果內(nèi)可得到好的定量結(jié)果如果采用如果采用SYBRSYBR檢測方法，檢測方法，30Cycles30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增35 Cycles35 Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（r r2 2）：大于）：大于0.980.98熒光定量熒光定量PCR反應(yīng)性的確認(rèn)反應(yīng)性的確認(rèn)內(nèi)容概要內(nèi)容

7、概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實驗流程及注意事項實驗流程及注意事項 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法非特異性熒光標(biāo)記非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I特異性熒光標(biāo)記特異性熒光標(biāo)記 TaqMan Probe常用熒光標(biāo)記方法常用熒光標(biāo)記方法SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法原理原理 SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法作用機理作用機理問題點：問題點： SYBR Green

8、ISYBR Green I與雙鏈與雙鏈DNADNA進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因進行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴增非特異性擴增或或引物二聚體引物二聚體的產(chǎn)生，的產(chǎn)生，也將也將 同時被檢測到，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。同時被檢測到，從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法問題點與關(guān)鍵點問題點與關(guān)鍵點關(guān)鍵點：關(guān)鍵點： 設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！設(shè)計合適引物，防止非特異性擴增！原始圖譜原始圖譜對數(shù)圖譜對數(shù)圖譜SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線融解曲線融解曲線分析，單一融解曲線分析，單

9、一峰無非特異性熒光峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)性熒光，因此定量不準(zhǔn)確確SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法融解曲線融解曲線% 對對DNA模板沒有選擇性模板沒有選擇性% 使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜探針使用方便，不必設(shè)計復(fù)雜探針% 具有價格優(yōu)勢具有價格優(yōu)勢優(yōu)優(yōu) 點點% 容易產(chǎn)生假陽性容易產(chǎn)生假陽性 % 對引物特異性要求較高對引物特異性要求較高% 不能進行多重定量不能進行多重定量缺缺 點點SYBR Green ISYBR Green I染料法染料法優(yōu)缺點優(yōu)缺點TaqmanTaq

10、man探針法探針法原理原理 5端標(biāo)記有報告基團(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) 探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收 ，無熒光， R與Q分開，發(fā)熒光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針TaqmanTaqman探針法探針法工作機理工作機理1 1、引物、探針的設(shè)計：、引物、探針的設(shè)計： 探針Tm為68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴增片段400 bp，引物Tm為59-60 2 2、反應(yīng)參數(shù)的確定：、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶5

11、3外切核酸酶活性在60 最高），也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 3 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小CtCt值，最大信號值，最大信號/ /背景比值背景比值 引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4 4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)PCRPCR相同相同TaqmanTaqman探針法探針法PCRPCR體系的建立體系的建立TaqmanTaqman探針法探針法熒光標(biāo)記物的選擇熒光標(biāo)記物的選擇% 高度特異性高度特異性% 重復(fù)性好重復(fù)性好% 可進行多重定量可進行多重定量優(yōu)優(yōu) 點點% 只適合一個特定的目標(biāo)只適合一個特定的目標(biāo)% 委托公司標(biāo)記，價格較高委托公司標(biāo)記，價格較

12、高% 不易找到本底低的探針不易找到本底低的探針缺缺 點點TaqmanTaqman探針法探針法優(yōu)缺點優(yōu)缺點不同定量方法的比較不同定量方法的比較方法方法優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點適用范圍適用范圍SYBR Green I SYBR Green I 方法方法適用性廣適用性廣靈敏靈敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現(xiàn)非特異性易出現(xiàn)非特異性帶帶不能進行多重定不能進行多重定量量適合科研中對各種目的適合科研中對各種目的基因定量分析，基因表基因定量分析，基因表達量的研究，轉(zhuǎn)基因重達量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物的研究組動植物的研究TaqMan TaqMan 方法方法特異性高特異性高重復(fù)性好重復(fù)性好多重定量多重定量價格

13、高價格高只適合特定目標(biāo)只適合特定目標(biāo)病原體檢測，疾病耐藥病原體檢測，疾病耐藥基因研究基因研究, ,藥物療效考藥物療效考核核遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實驗流程及注意事項實驗流程及注意事項 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計引物設(shè)計反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化濃度確定濃度確定技能要求技能要求環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析儀器軟件儀器軟件RTRT上機上機反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇分析方法分析方法樣品制備樣品制備環(huán)境要求環(huán)境要求模

14、板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RTRT上機上機濃度確定濃度確定無RNase環(huán)境使用無RNase耗材專用RNase-free工具分光光度計檢測電泳檢測RTRT反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化試劑選擇試劑選擇樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機上機AMVM-MLVQuantSuper下游反應(yīng)數(shù)確定反轉(zhuǎn)錄體積選擇應(yīng)用引物模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備引物設(shè)計引物設(shè)計濃度確定濃度確定環(huán)境要求環(huán)境要求誤差控制誤差控制RTRT樣品制備樣品制備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析上機上機核酸制備區(qū)反應(yīng)液制備區(qū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)定濃度區(qū)間評價引物使用mix降低系統(tǒng)誤差設(shè)置重復(fù)（3次）設(shè)置空白和陰性對照GC：5060Tm：5560單個堿基重

15、復(fù)4個無二級結(jié)構(gòu)擴增長度：50150bp引物位置反應(yīng)體系優(yōu)化反應(yīng)體系優(yōu)化上機上機反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化RTRT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析反應(yīng)體積5ul，推薦2050ulMg2調(diào)節(jié)，酶活調(diào)節(jié)引物濃度優(yōu)化，模板量優(yōu)化退火溫度優(yōu)化：梯度PCR延伸時間：產(chǎn)物長度決定擴增效率：90110重復(fù)性：std0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線：R0.99或R2 0.98標(biāo)準(zhǔn)品待測樣本陽性對照陰性對照技能要求技能要求誤差控制誤差控制上機上機試劑選擇試劑選擇RTRT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析自配DBI Real mastermixRoche-Lightcycler seriesROTOGE

16、N-RG seriesBIO-RAD Opticon seriesABI-7seriesBioerLinegene series分裝控制內(nèi)參控制機器校正控制45oC55oC65oC溶解曲線溶解曲線擴增曲線擴增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to line 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, reade

17、very 0.2oC, hold 1 sec.同一cDNA樣品的三個重復(fù)如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴增曲線上的如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴增曲線上的CTCT值之差，應(yīng)該相等，但值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品是后邊幾個濃度低的樣品CTCT值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。1. 1. 模板濃度越低，染料法的誤差越大模板濃度越低，染料法的誤差越大2. 2. 某一孔熒光信號特別強某一孔熒光信號特別強原因：原因： 試劑配制時反應(yīng)液沒完全溶化，導(dǎo)致探針量

18、在一管中增多；試劑配制時反應(yīng)液沒完全溶化，導(dǎo)致探針量在一管中增多； 試劑配制時沒有充分混勻致各管中各成分的量不同；試劑配制時沒有充分混勻致各管中各成分的量不同； 也可能是也可能是PCRPCR儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，這時就要清除熱槽中的污染；儀熱槽被熒光物質(zhì)污染，這時就要清除熱槽中的污染；3.3.樣品濃度跨度過大樣品濃度跨度過大樣品濃度過高，至陽性樣品擴增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，樣品濃度過高，至陽性樣品擴增曲線在后面循環(huán)中呈一向下的直線，4. 部分樣本擴增效率過低部分樣本擴增效率過低原因：原因： 提取液殘留，一定程度抑制了提取液殘留，一定程度抑制了PCRPCR反應(yīng)；反應(yīng)； 反應(yīng)液未嚴(yán)格取量

19、混勻或分裝不反應(yīng)液未嚴(yán)格取量混勻或分裝不均勻；試劑失效；均勻；試劑失效；5.5. 陰性對照或空白對照翹尾陰性對照或空白對照翹尾原因：模板提取環(huán)境有污染；模板提取操作有污染；試劑配制過程存在污染；原因：模板提取環(huán)境有污染；模板提取操作有污染；試劑配制過程存在污染；6. 6. 直線型擴增曲線直線型擴增曲線原因：探針部分降解（探針降解原因：原因：探針部分降解（探針降解原因：a.a.探針反復(fù)凍融探針反復(fù)凍融稀釋的探針可在稀釋的探針可在44保存保存至少至少3 3個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融；個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融；b.b.探針在光線下暴露時間太長）；反應(yīng)液中有探針在光線下暴露時間太長）；反應(yīng)液中有PCRPCR抑制

20、抑制物；物；7. 7.山坡形曲線山坡形曲線原因：常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。原因：常因反應(yīng)管封口不嚴(yán)，至反應(yīng)液蒸發(fā)所致。8.8.擴增曲線斷裂擴增曲線斷裂原因：基線選取范圍不對，基線終點大于原因：基線選取范圍不對，基線終點大于CtCt值，這通常是由于模板值，這通常是由于模板DNADNA濃度過高所致，濃度過高所致，因因CtCt值值1515，而基線范圍仍取，而基線范圍仍取3 31515，其中包含部分?jǐn)U增信號，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過，其中包含部分?jǐn)U增信號，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)差偏大，閾值過高，解決辦法：減少基線終點至高，解決辦法：減少基線終點至CtCt值前值前4 4個循環(huán)，重新分析數(shù)據(jù)個循環(huán)，重新分析數(shù)

21、據(jù)9.9.基線下滑基線下滑原因：基線選取范圍不對，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質(zhì)量所致；原因：基線選取范圍不對，可試著將基線范圍改大一些，這一問題常因試劑質(zhì)量所致；10.10.沒有擴增曲線沒有擴增曲線原因：原因：PCRPCR參數(shù)設(shè)置錯誤，在設(shè)計循環(huán)參數(shù)時將熒光信號讀取時間設(shè)在反應(yīng)的第一步，參數(shù)設(shè)置錯誤，在設(shè)計循環(huán)參數(shù)時將熒光信號讀取時間設(shè)在反應(yīng)的第一步，即即stage 1stage 1階段；電腦設(shè)定了自動休眠；階段；電腦設(shè)定了自動休眠；11. 擴增曲線有一向上或向下的尖峰擴增曲線有一向上或向下的尖峰原因原因： 反應(yīng)過程中電壓不穩(wěn)定；可能在反應(yīng)過程中電壓不穩(wěn)定；可能在2020循環(huán)左

22、右儀器有停下或者儀器有開蓋，循環(huán)左右儀器有停下或者儀器有開蓋，使得光線突然增強；使得光線突然增強； 如果尖峰向下，也可能是鹵素?zé)衾匣?，這時應(yīng)更換；如果尖峰向下，也可能是鹵素?zé)衾匣?，這時應(yīng)更換；數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)軟件系統(tǒng)分析方法分析方法上機上機RT樣品制備樣品制備模板準(zhǔn)備模板準(zhǔn)備相對定量：2Ct法絕對定量：標(biāo)準(zhǔn)曲線法內(nèi)容概要內(nèi)容概要 熒光定量熒光定量PCRPCR的原理的原理 熒光定量熒光定量PCRPCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 實驗流程及注意事項實驗流程及注意事項 熒光定量熒光定量PCRPCR解析方法解析方法 絕對定量解析方法絕對定量解析方法Sample25絕對定量的定義絕對定量的定義

23、0 Log（起始濃度）與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品 可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得到該擴增反應(yīng)存在的線性關(guān)系0 根據(jù)樣品Ct值，就可以計算出樣品中所含的模板量PCRPCR目的基因克隆目的基因克隆質(zhì)粒質(zhì)?；蚪M基因組DNADNA質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備拷貝數(shù)的計算：拷貝數(shù)的計算：待測樣本濃度（ng/ul）OD26040稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)324待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量61014倍比梯度稀釋方法倍比梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩

24、沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法與拷貝數(shù)計算q 方方 法：法：從組織中提取RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，以SYBR法進行熒光定量檢測q 試試 劑：劑：DBIDBI公司SYBR realtime PCR試劑q 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為106、105 、104 、 103 ；2個重復(fù)；設(shè)陰性空白對照q 實驗步驟：實驗步驟：提取RNA并反轉(zhuǎn)錄； 設(shè)計特異引物； 熒光定量擴增； 結(jié)果分析：獲取樣品中目的基因的精確copy數(shù)。絕對定量實驗例絕對定量實驗例SampleSamplecopies/mlcopies/mlCt1Ct1Ct

25、2Ct2Mean CtMean CtSTDSTD標(biāo)準(zhǔn)品510328.1828.6428.410.16標(biāo)準(zhǔn)品510425.2525.1425.190.04標(biāo)準(zhǔn)品510522.1122.4622.280.12標(biāo)準(zhǔn)品510618.6318.9218.770.10未知樣品? ?20.5620.4520.50.05空白對照NoneNone實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)絕對定量實驗例絕對定量實驗例擴增效率（擴增效率（E E）計算）計算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：利用利用Mean Ct Mean Ct 作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲作圖可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線y =

26、 -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988絕對定量實驗例絕對定量實驗例未知樣品拷貝數(shù)的計算未知樣品拷貝數(shù)的計算將Ct值帶入線性方程：20.5= -3.1726 X + 37.52QuantityUnknown=105.36 =229087 copies 絕對定量實驗例絕對定量實驗例X=20.5-37.52-3.1726=5.36 相對定量解析方法相對定量解析方法相對定量的必要性相對定量的必要性管家基因篩選管家基因篩選P P P P P P O O 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 2 -Ct法法 兩種常用的分析方法兩種常用的分析方法 通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管通過標(biāo)準(zhǔn)曲

27、線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即家基因進行定量，然后根據(jù)計算公式求得相對值即為相對表達量。為相對表達量。 相對值相對值= =校正值校正值= =目的基因定量結(jié)果目的基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果管家基因定量結(jié)果待測樣品的校正值待測樣品的校正值對照樣品的校正值對照樣品的校正值雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法公式：公式：優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單優(yōu)點：分析簡單，實驗優(yōu)化相對簡單缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：對每一個基因，每一輪實驗都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與

28、公認(rèn)的兩種相對定量方法之一雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測樣品檢測樣品管家基因管家基因H H目的基因目的基因X X定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)果定量結(jié)果校正值校正值相對量相對量對照樣品對照樣品6391.56391.5343.4343.40.05370.05371.0001.000待測樣品待測樣品1 18589.78589.717.317.30.00200.00200.0370.037待測樣品待測樣品2 27432.97432.91946.11946.10.26180.26184.8744.874實驗數(shù)據(jù)實驗數(shù)據(jù)公式：公式：F =F = 2 22 2 - -CtCt法法優(yōu)點：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)點：無需作標(biāo)準(zhǔn)曲線缺點：假定擴增效率為缺點：假定擴增效率為 100 %100 %； 假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致；假定標(biāo)準(zhǔn)曲線及每次擴增之際間的效率都保持一致； 實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜實驗條件優(yōu)化較為復(fù)雜應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一應(yīng)用：基因表達調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一 待測組目的基因平均Ct值待測組管家基因平均Ct值對照組目的基因平均Ct值對照組管家基因平均Ct值實驗數(shù)據(jù)：實驗數(shù)據(jù)：Sample 處理前 處理后 Jun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)E18161717.4