紅外輔助提取白芨多糖(BSP)

1、紅外輔助提取白芨多糖（BSP）的優(yōu)化基于響應(yīng)面法及BSP的抗氧化活性201440302105趙穎摘要 BSP由于其潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，而吸引了廣泛的研究興趣。這里，首次采用紅外輔助技術(shù)從白芨塊莖中提取BSP。基于Box-Behnken設(shè)計(jì)（BBD）和響應(yīng)面（RSM）方法，在最佳提取條件下：75C提取溫度，2.5 h提取時間;和水料比（53ml / g）（水的體積與藥材質(zhì)量比），獲得43.950.26的粗BSP產(chǎn)率。隨后，將粗BSP進(jìn)一步脫色，脫蛋白，冷凍干燥，并通過DEAE-52纖維素柱純化。 此外，對BSP的微結(jié)構(gòu)和的三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。傅里葉變換紅外光譜也證實(shí)了其通過典型峰的多糖表征。還通過

2、超氧化物陰離子自由基清除測定，羥基自由基清除測定，DPPH自由基清除活性和亞鐵離子的螯合證明了BSP的顯著的體外抗氧化活性?？傊@項(xiàng)研究提供了一種有效的提取BSP（作為有希望的天然抗氧化劑）的技術(shù)。介紹 白芨可以用于促進(jìn)傷口愈合和治療消化道粘膜損傷，潰瘍，出血，瘀傷和燒傷 近年來，天然多糖已被用于各種生物材料，其中它們表現(xiàn)出生物相容性，低毒性和制藥生物醫(yī)學(xué)活性。而由于白芨多糖抗菌、抗炎、抗衰老、抗癌（癌癥免疫治療）和保護(hù)作用（針對腎纖維化）等，使白芨多糖備受關(guān)注。 此外，在用于藥物應(yīng)用的生物活性材料中，已經(jīng)報道BSP成功地用作藥物和基因的受控遞送和組織工程的賦形劑。 BSP優(yōu)異的可紡性，機(jī)械

3、性能和生物相容性使生物纖維的生產(chǎn)成為可能，其潛在應(yīng)用包括作為組織工程支架和傷口敷料的理想材料。 白芨的組分、分子量和生物活性已被廣泛研究。然而，BSP的提取及其抗氧化活性卻很少被關(guān)注。介紹 提取方法的研究 目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于提取多糖的新技術(shù)，包括超臨界流體提取，微波輔助提取，酶輔助提取和超聲波輔助提取。每種提取方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。如，這些方法需要使用精密設(shè)備（微波爐或超臨界流體提取系統(tǒng)），并且涉及高成本。同時，它揭示了超聲輔助提取方法可能會導(dǎo)致水溶性多糖的一些降解。因此，仍然需要開發(fā)簡單且低成本的提取方法。 與這些方法相比，紅外輔助提?。↖RAE）越來越多地應(yīng)用于從藥用植物提取活性成分，

4、具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括較短的提取時間，低提取溫度和高提取商;此外，紅外輔助提取更容易使用，更廉價和無輻射。本研究集中于BSP的IRAE，使用可商購的紅外燈泡作為紅外輻射源，以開發(fā)有效和經(jīng)濟(jì)的提取方法。介紹 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化基于RSM響應(yīng)面法 RSM已被廣泛用于優(yōu)化許多研究中的過程，包括多糖的提取。基于Box-Behnken Design（BBD）的統(tǒng)計(jì)建模旨在用于實(shí)現(xiàn)最大多糖產(chǎn)率的響應(yīng)表面設(shè)計(jì)。 與其他方法相比，BBD有助于實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和解釋，具有廣泛的應(yīng)用范圍。而且，據(jù)我們所知，在RSM的基礎(chǔ)上使用IRAE提取BSP還沒有被描述。 因此，在本研究中，通過IRAE（紅外輔助）提取BSP，用BBD來優(yōu)化提取變

5、量以獲得最大多糖產(chǎn)率。 響應(yīng)面分析也是一種最優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)（如萃取化學(xué)中的萃取率）作為一個或多個因素（如萃取劑濃度、酸度等）的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，以供我們憑借直覺的觀察來選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件。實(shí)驗(yàn)流程白芨塊根粉碎石油醚脫脂95%乙醇回流過濾殘?jiān)稍镉盟崛「稍镅心悠冯x心取得上清液用苯酚-硫酸法在紅外光照射下測得BSP的最大吸收帶在490nm實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)單因素設(shè)計(jì)溫度：40、50、60、70、80、90度時間：0.5、1、2、3、4、5h水料比：30、40、50、0、70ml/g得到的結(jié)果是提取溫度6080佳提取時間13h為佳水料比應(yīng)在4060ml/g為

6、佳實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)BSP凍干技術(shù) 凍干可用于保留樣品的天然結(jié)構(gòu)和特征。因此，該方法廣泛用于干燥多糖樣品。 為了便于比較，在本研究中，BSP使用凍干和風(fēng)干進(jìn)行干燥。 與以前的報道一致，真空干燥和凍干后BSP的外觀差異很大。就本研究中所發(fā)現(xiàn)的，BSP的粘度隨著濃度增加而增加，使得其容易粘附到容器上并形成干燥的真空薄膜。在高濃度下BSP凍干形成膠狀團(tuán)塊，表明BSP具有良好的成膜性質(zhì)。然而，隨著干燥時間的要求，這些團(tuán)塊難以再溶解。而且，凍干的BSP表面結(jié)構(gòu)不同于真空干燥BSP的表面結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)相對薄和松散，并且有一些小碎片粘黏在上面。 因此，為了保證冷凍干燥樣品的質(zhì)量，減少干燥時間和提高效率，在此使用冷凍

7、干燥法制備BSP。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)粗BSP的制備和純化將多次離心所得上清液合并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將體積濃縮至1/3用sevag（氯仿：丁醇，4:1）試劑除去蛋白質(zhì)加入脫水醇至最終濃度為80%，并濃縮得到沉淀，過夜再離心，得到沉淀物BSPBSP與100ml水以10mg/ml比例配制通過DEAE-52纖維柱，使用去離子水洗脫得到洗脫液再用苯酚-硫酸檢測其在490nm處的吸光度當(dāng)無吸光度后停止洗脫將洗脫液再減壓濃縮在去離子水中透析72h所得樣品凍干，最終得到白色粉末最后用苯酚-硫酸法測定多糖的總碳水化合物含量BSP的微結(jié)構(gòu)表征結(jié)果凍干BSP的SEM觀察如圖，所有樣品表現(xiàn)出松散的絲狀網(wǎng)絡(luò)，盡管根據(jù)濃度存在大的

8、差異。顯微組織如圖。 圖A表示，出了大的絮狀結(jié)構(gòu)。 在圖B中，看到帶和寬絲。 圖C所示，觀察到片狀結(jié)構(gòu)。 隨著薄片結(jié)構(gòu)增加（圖D）BSP幾乎形成薄膜層。 然而，隨著膜層數(shù)量的增加，形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖E） 圖F中，網(wǎng)格數(shù)增加，網(wǎng)格的尺寸減小。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的規(guī)則性和密度說明凍干的BSP在無水狀態(tài)下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相互作用。在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中觀察到一些角度不規(guī)則的空隙，這些空隙可能代表在冷凍干燥過程中冰晶升華后殘留的空間。BSP的多糖結(jié)構(gòu)表征結(jié)果 BSP的FT-IR光譜BSP的多糖構(gòu)象表征結(jié)果剛果紅法剛果紅與三螺旋多糖反應(yīng)，將溶液的紫外最大吸收峰移向較長波長處。從三螺旋構(gòu)象到單線圈構(gòu)象的轉(zhuǎn)變降低了剛果紅多糖溶液的

9、最大吸收峰。在0-0.5mol / l（摩爾/升）的NaOH濃度下BSP的螺旋 - 線圈過渡分析如圖所示。 BSP在蒸餾水中的最大吸收波長從 503 轉(zhuǎn)移到 512 nm，比在沒有 BSP剛果紅溶液中測量的值從487到498 nm大，表示三螺旋多糖-剛果紅絡(luò)合物已經(jīng)形成。在較高濃度的NaOH下螺旋構(gòu)象被破壞，最大吸收波長也降低。這些結(jié)果表明BSP具有三螺旋構(gòu)象。BSP的體外抗氧化活性的表征 人體衰老和多種疾病均與自由基有關(guān)，尋找天然抗氧化劑具有重要意義。黃酮、多糖、多肽、酚類等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的篩選方法可分為體外和體內(nèi)2種測試體系。 體外：通過樣品對檢測體系中自由基的清

10、除能力、抗油脂過氧化能力及樣品的還原能力、總抗氧化能力等來衡量和表征。 常用的方法有羥基自由基（OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽（ABTS法）、超氧陰離子自由基法（O2-）、鄰苯三酚自氧化法、-胡蘿卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、鐵離子還原能力測定（FRAP法）、總酚測定法、ORAC法等方法。體外抗氧化活性研究通過測定 對超氧化物陰離子自由基的清除活性 對DPPH自由基的清除活性 對亞鐵離子螯合的作用 對羥基自由基的清除活性同時與抗壞血酸作對比體外抗氧化活性的表征結(jié)果超氧自由基清除活性純化的BSP的超氧自由基清除活性

11、與增加的濃度從0.25至5mg / ml呈正相關(guān)，但活性小于抗壞血酸。在5mg / ml時，純化的BSP的清除活性為43.70，抗壞血酸的清除活性為93.46。體外抗氧化活性的表征結(jié)果對羥基自由基的清除活性羥基對生物體是危險的，因?yàn)樗鹕锓肿樱ɡ缰|(zhì)，蛋白質(zhì)，碳水化合物和DNA）的氧化損傷;因此，這種自由基可以很容易地?fù)p壞，甚至殺死細(xì)胞;多糖可以作為電子或氫供體來清除羥基自由基。因此，去除羥基自由基對于保護(hù)身體免受氧化相關(guān)損傷是非常重要的。 OH-的清除活性是有濃度依賴性的。在5mg / ml的濃度下，純化的BSP和抗壞血酸對羥基自由基的清除活性分別為35.97和93.37。這些結(jié)果表明

12、BSP具有清除羥基自由基的能力。體外抗氧化活性的表征結(jié)果DPPH自由基清除活性DPPH基是相對穩(wěn)定的自由基并且可以接受電子或氫原子以形成穩(wěn)定的抗磁分子;因此，DPPH被廣泛用于評價自由基清除活性。 DPPH自由基清除活性是有濃度依賴性的。在5mg / ml時，純化的BSP和抗壞血酸的DPPH自由基清除活性分別為42.20和94.01。這些發(fā)現(xiàn)意味著BSP可以捐贈電子或氫原子以清除DPPH自由基。體外抗氧化活性的表征結(jié)果純化的BSP螯合金屬離子，如Fe 2+的能力金屬螯合能力被認(rèn)為與抗氧化活性相關(guān)。幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明了多糖的金屬離子螯合能力可能是由于糖醛酸中的羧基和二價離子之間形成交聯(lián)橋。純化的BSP的亞鐵離子螯合作用是有濃度依賴性的。我們