從動物細(xì)胞培養(yǎng)到組織工程

1、 從動物細(xì)胞培養(yǎng)到組織工程 施秀惠國立臺灣大學(xué)生命科學(xué)系嚴(yán)重急性呼吸道癥候群SARS(severe acute respiratory syndrome)病原體究竟是冠狀病毒? 副黏液病毒? 或其他?臺灣與香港的研究進(jìn)展有落差! 重要關(guān)鍵:是否尋獲有感受性的細(xì)胞株? 何謂動物細(xì)胞培養(yǎng)？ 植物組織培養(yǎng)(plant tissue culture)金線蓮非洲菫生物組成之階層(The hierarchy of biological order)分子 (molecule)細(xì)胞 (cell)組織 (tissue)器官 (organ)系統(tǒng) (system)個體 (organism)族群 (populatio

2、n)群聚(community)生態(tài)系(ecosystem)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)動物細(xì)胞或動物組織培養(yǎng)通稱的動物組織培養(yǎng)(ATC - Animal tissue culture) 究竟在培養(yǎng)什麼? 蛙胚延髓組織培養(yǎng)在青蛙淋巴凝塊內(nèi)動物細(xì)胞培養(yǎng)之創(chuàng)始通稱的動物組織培養(yǎng)培養(yǎng)對象為(動物)細(xì)胞層級增殖基礎(chǔ)為有絲分裂, 不涉及 減數(shù)分裂獲得初級培養(yǎng)(primary culture)或 細(xì)胞株(cell line)Clone- 株,克隆in vitro culture (體外培養(yǎng)) vs. in vivo(活體)如何培養(yǎng)動物細(xì)胞？ 兩種根本策略 初級組織塊培養(yǎng)法 (primary explant cultu

3、re) 分散細(xì)胞培養(yǎng)法 (dispersed cell culture) 草蝦淋巴器官組織塊細(xì)胞培養(yǎng)吳郭魚生殖腺單層細(xì)胞培養(yǎng)根本設(shè)備無菌操作檯- 配備 HEPA filter倒立顯微鏡倒立顯微鏡和25T培養(yǎng)瓶培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)器材:培養(yǎng)皿、盤、瓶等 培養(yǎng)基:amino acids, vitamins, coenzymes 添加物:血清、生長激素等 培養(yǎng)條件: 氣相、溫度等利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之優(yōu)勢和限制 優(yōu) 勢 控制下的環(huán)境 性質(zhì)且均質(zhì)化的標(biāo)本 經(jīng)濟(jì)性限 制 經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)之需求度高量產(chǎn)之困難 細(xì)胞株之穩(wěn)定性最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)-污染(contamination) -自始至今皆然污染物的種類與特徵偵測方法與操作

4、原則交叉污染 預(yù)防污染方法 消毒(Sterilization) 物理法、化學(xué)法、機(jī)械法無菌操作(Aseptic technique) 學(xué)習(xí)之宗旨與精髓動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之成就與貢獻(xiàn) 病毒學(xué)研究體外(in vitro)培養(yǎng)病毒 1937:黃熱病毒 1949:小兒麻痺病毒.製備疫苗 1954諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎: Enders, Weller，Robbins 試想:如果開發(fā)出SARS,(禽)流感或 AIDS疫苗?!HPV疫苗-子宮頸癌新剋星HPV- 人類乳突病毒,經(jīng)由性行為傳染,引起子宮頸癌HPV16型疫苗之人體試驗(yàn)(2002/11新英格蘭醫(yī)學(xué)雜誌刊登)全美16個醫(yī)學(xué)中心, 2392位1623歲女性,同

5、步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組-1194人, 對照組-1198人接種疫苗後追蹤結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組- 無人發(fā)生持續(xù)性HPV感染對照組- 9個HPV導(dǎo)致之子宮頸癌前病變遺傳學(xué)研究 核型(karyotype)分析 例如: 胎兒診斷 羊膜或絨毛膜穿刺 遺傳代謝疾病診斷 其他重要應(yīng)用基因工程 作為基因之增殖與表現(xiàn)系統(tǒng)癌癥研究 基因轉(zhuǎn)殖動物人工生殖潛力與展望組織工程學(xué) (Tissue engineering)- 2000年5月美國?時代?雜誌列為未來十大熱門工作之首主要致力於組織和器官的再生與形成在一個模仿組織與器官形狀的材料中種入細(xì)胞，使細(xì)胞依照模型長成新的組織與器官，以修復(fù)人體組織的缺損。前驅(qū): 美國麻州總醫(yī)院外科醫(yī)師韋肯逖

6、(Joseph Vacanti麻省理工學(xué)院化工系教授藍(lán)格(Robert Langer構(gòu)想:結(jié)合醫(yī)學(xué)與材料工程的知識背景，研發(fā)製造能修復(fù)人體病變組織與器官的零件，以克服器官捐贈來源短缺的困境 。組織工程的開始成果1. 體外培養(yǎng):1992年在多孔狀結(jié)構(gòu)高分子材料上培養(yǎng)出 軟骨細(xì)胞，並形成新的軟骨組織。2. 活體培養(yǎng):老鼠背上培養(yǎng)出人耳形狀的軟骨。 組織工程三大元件 - 細(xì)胞、支架、訊號 細(xì)胞 組織生成 訊號 支架 細(xì)胞 - 組織再生的關(guān)鍵 策略: 採集少量的自體細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)增殖後， 再運(yùn)用於修復(fù)體內(nèi)器官。兩種細(xì)胞類型： 已分化完全的成熟細(xì)胞， 具有分化成其他細(xì)胞能力的幹細(xì)胞。 幹細(xì)胞(stem

7、 cell)培養(yǎng) 幹細(xì)胞是身體所有組織的前身來源: 胚胎-完整潛能(totipotent)或 豐富潛能(pluripotent)細(xì)胞 成體-多重潛能或特定功能(multipotent) 細(xì)胞NIH (2000 May)完整潛能豐富潛能囊胚期細(xì)胞NIH (2000 May)骨髓神經(jīng)細(xì)胞心肌細(xì)胞胰島細(xì)胞預(yù)期將愈來愈多研究現(xiàn)況與應(yīng)用目標(biāo)疾病與受傷之治療 例如:脊髓傷害之癱瘓(大鼠) 、 帕金森氏癥、阿茲海默癥、糖尿病、 黏多糖癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等器官移植具備無限潛力但受倫理規(guī)範(fàn)胚胎幹細(xì)胞研究規(guī)範(fàn)(Science 2001)第一級: 絕對禁止(法、瑞士、西、冰島、波蘭)第二級: 現(xiàn)有細(xì)胞株, 不得再以

8、受精卵製造 新細(xì)胞株(美國)第三級: 可使用人工流產(chǎn)與人工生殖之多餘胚胎 (日本、加、澳洲、以色列) 我國 2002/2/19 公告- 胚胎幹細(xì)胞研究倫理規(guī)範(fàn)第四級: 可為研究目的製造新胚胎 (大陸、美私人經(jīng)費(fèi)贊助者)人造血管-組織工程皮膚成功的前提A collagen biopolymer (Black et al. 1998) :角質(zhì)細(xì)胞真皮纖維母細(xì)胞臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cocultureendothelialized skin equivalent (ESE)人工關(guān)節(jié)-軟骨再生1.第一次手術(shù): 從病人關(guān)節(jié)軟骨中未 受力的局部，取出一片約為葡萄乾 大小的健康軟骨組織。體外 培養(yǎng)，使細(xì)胞數(shù)增加約1020倍。3.第二次手術(shù): 清理軟骨受損的局部， 從下方骨頭部位取出一片約與傷口 大小相同的骨膜，縫