Kit無(wú)義突變致W_3Bao_小鼠生殖腺異常及純合子貧血死亡_吳培林

1、1 期 吳培林等：Kit 無(wú)義突變致 W-3Bao 小鼠生殖腺異常及純合子貧血死亡 53 動(dòng) 物 學(xué) 研 究 2009，F(xiàn)eb. 30(1)：4552 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research DOI：10.3724/SP.J.1141.2009.01045 Kit無(wú)義突變致W-3Bao小鼠生殖腺異常及純合子貧血死亡 吳培林1，尹洪萍1，殷黎靜2，朱 潔2，曾詠梅2，劉桂杰1，亢曉冬1，俞利平1，顧美兒1，袁 紅1，吳寶金1,2,*（1杭州師范大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036；2揚(yáng)州大學(xué) 比較醫(yī)學(xué)中心，江蘇 揚(yáng)州 2250

2、01） 摘要：W-3Bao是本研究組通過(guò)誘變獲得、Kit無(wú)義突變的白斑小鼠。突變基因雜合子小鼠腹部、四肢肢端及尾尖白化，其部分精曲小管內(nèi)無(wú)精原細(xì)胞。突變純合子小鼠在胚胎后期色澤蒼白、個(gè)體矮小，于出生前后死亡；血液學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)純合子小鼠血色素極低且紅細(xì)胞變大；18.5天胚胎的連續(xù)切片可見(jiàn)精曲小管輪廓欠清晰，精原細(xì)胞分散分布于睪丸間質(zhì)，未遷入精曲小管；卵巢結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)明顯的原始卵泡結(jié)構(gòu)；骨髓等器官組織未見(jiàn)顯著異常。結(jié)論：Kit無(wú)義突變不僅導(dǎo)致了W-3Bao雜合子小鼠白斑形成及純合子小鼠貧血死亡，同時(shí)影響生殖腺發(fā)育。 關(guān)鍵詞：W-3Bao 小鼠；Kit 基因；死亡；大紅細(xì)胞貧血；生殖腺異常 中圖分類號(hào)

3、：Q959.837; Q954.4; Q344 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0254-5953-(2009)01-0045-08 Gonadial Abnormality and Homozygous Decease from the Nonsense Mutation of Kit in W-3Bao Mouse WU Pei-lin1, YIN Hong-ping1, YIN Li-jing2, ZHU Jie2, ZENG Yong-mei2, LIU Gui-jie1, KANG Xiao-dong1, YU Li-ping1, GU Mei-er1, YUAN Hong1, WU Ba

4、o-jin1,2,*(1. Laboratory of Experimental Animal Science，Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036; 2. Comparative Medicine Center of Yangzhou University , Yangzhou 225009) Abstract：The W-3Bao mouse, which was obtained in previous ENU mutagenesis project, is a new mutant caused by the nonsense muta

5、tion of Kit gene. Mating and gross observing combining with PCR and sequencing were used for determining the genotypes of the W-3Bao mice. Embryonic development, hematological detection and histopathologic section methods were used for their phenotype analysis. The results showed that the W-3Bao/+ m

6、ouse was white belly, white limb terminals and white tail tip. However, there was no difference of the external appearance among the W-3Bao/+, W-3Bao/3Bao and wild type mice for the embryo of 12.5 days. The W-3Bao/3Bao embryos looked pale since pregnant 14.5 days and dwarf since pregnant 16.5 days.

7、The extremely low level of haematochrome and big red blood cells of W-3Bao/3Bao 18.5-day-embryos were found in the inspections of blood routine items and blood smear, which resulted in death of W-3Bao/3Bao homozygous mouse around being born, and no live postnatal W-3Bao/3Bao mouse was found in this

8、study. No spermatogonium at different developmental stages was found in some contorted seminiferous tubules in adult W-3Bao/+ mouse. At the age of 18.5-day embryo, the spermatogonium of W-3Bao/3Bao mice only lied in interstitial tissue and no one lied in contorted seminiferous tubules, while the spe

9、rmatogonium of W-3Bao/+ or W+/+ mice lied in interstitial tissue and in contorted seminiferous tubules in the same time. At the age of 18.5-day embryo, cells arranged irregularly and primordial follicles were not seen in the W-3Bao/3Bao ovaries, while primordial follicles appeared clearly in the ova

10、ries of W-3Bao/+ or W+/+ mice. We concluded that because of the nonsense mutation of Kit gene, the W-3Bao/+ mice show white spot and abnormal development of some contorted seminiferous tubules. The W-3Bao/3Bao mice die around birth resulting from severe macrocytic anemia and show abnormal genital gl

11、ands of both genders. Key words：W-3Bao mouse; Kit gene; Decease; Macrocytic anemia; Gonadial abnormality 收稿日期：2008-10-14；接受日期：2008-12-22 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30670231）資助 *通訊作者 (Corresponding author)，Tel: E-mail: baojinwu 第一作者簡(jiǎn)介：吳培林，52 歲，碩士學(xué)位，副教授，研究方向?yàn)槿祟惣膊?dòng)物模型 功能基因研究的策略之一是獲得某一基因的眾多突變體，通過(guò)對(duì)

12、該基因突變?nèi)后w內(nèi)表現(xiàn)型及基因型的比較分析，推導(dǎo)出特定基因的生物學(xué)作用 (Balling, 2001; Fu, 2003)。Kit是一個(gè)著名的與發(fā)育相關(guān)的基因，其編碼的蛋白質(zhì)是位于細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶受體，控制著血細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞、聽(tīng)毛細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及小腸Cajal細(xì)胞等的發(fā)育（Geissler et al, 1988; Chabot et al，1988；Cable et al, 1994; Huizinga et al, 1995; Broudy, 1997; Rajaraman et al, 2003; Magnol et al, 2007）。至2008 年10月，小鼠（M

13、us musculus）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Mouse Genomic Informatics，MGI）中已經(jīng)收錄97種不同的Kit突變體，這些眾多的Kit突變系小鼠對(duì)Kit的功能研究發(fā)揮了重要作用。W-3Bao是本研究組通過(guò) ENU（乙?；鶃喯趸澹┱T變獲得的呈單基因顯性遺傳的白斑突變系小鼠；通過(guò)連鎖分析法，以微衛(wèi)星為標(biāo)記把白斑突變基因定位于第5號(hào)染色體距著絲粒41.5742.91 cM之間(Wu et al，2003)，確定Kit 為白斑候選基因；在此基礎(chǔ)上，已經(jīng)鑒定出W-3BaoKit 基因編碼區(qū)第441堿基T顛換為A，使得第147位密碼子由UAU變?yōu)榻K止密碼子UAA，這一無(wú)義突變導(dǎo)致 Kit

14、編碼蛋白提前終止（Xue et al，2007）。根據(jù)國(guó)際通用命名規(guī)則，該小鼠被命名為W-3Bao，收錄在MGI 數(shù)據(jù)庫(kù)中(/javawi2/ servlet/WIFetch?page=alleleDetail&key=27699) 。盡管有關(guān)W-3Bao小鼠的研究工作已經(jīng)不少，但是一直未能獲得突變基因純合子小鼠，更不知道純合子小鼠的表型特征。本文以W-3Bao小鼠為研究對(duì)象，研究其表型特征以及胚胎發(fā)育過(guò)程，發(fā)現(xiàn)突變雜合子小鼠部分精曲小管發(fā)育異常，純合子小鼠因?yàn)榇蠹t細(xì)胞性貧血在出生前后死亡、生殖腺發(fā)育異常。該小鼠不僅僅是Kit基因功能研

15、究的好材料，也是研究生殖細(xì)胞發(fā)育、胚胎造血機(jī)制的理想模型。 1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件 W-3Bao突變雜合子小鼠及其背景品系C57BL/6J(B6)小鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心及杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（浙）20050020，使用許可證：SCXK（浙）20050071。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境的動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼喂浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心小鼠全價(jià)飼料，自由采食和飲水，室內(nèi)溫度控制在（232），濕度控制在（555）%，室內(nèi)照明采用 1212 h明暗交替。 1.1.2 主要試劑、引物及儀器 LA Taq polymerase、PyrobestT

16、M DNA Polymerase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；QIA quick Gel Exaction Kit購(gòu)自QIAgen 公司；測(cè)序委托上海生工生物工程公司進(jìn)行。依據(jù)前期對(duì)突變基因鑒定的研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)針對(duì) W-3Bao突變位點(diǎn)在基因組上的位置設(shè)計(jì)覆蓋突變位點(diǎn)的PCR引物：上游引物為 5-GAATGCTGGTAT- GTTGGAGG-3；下游引物為 5-ACAGGATGG- AAGAAAGAGGC-3，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)為 750 bp （Xue et al，2007）。PCR儀為BIO-RAD的PTC-200；血常規(guī)檢測(cè)儀為日本 SYSMEX 公司 SYSMEX KX-21。 1.2

17、 方 法 1.2.1 突變小鼠的繁殖方法與表型特征觀察 首先將W-3Bao突變雜合子小鼠互交，觀察后代小鼠的表型變化，再將帶有白斑的后代小鼠與正常B6 小鼠交配，根據(jù)后代是否有正常小鼠判斷親代小鼠是否為突變基因純合子。隨后，將W-3Bao突變雜合子小鼠互交，每日行陰道栓檢查，見(jiàn)栓者記為孕 0.5 天，分別在孕 10.5、12.5、14.5、16.5 及 18.5 天剖檢母鼠，肉眼觀察胎鼠及初生小鼠的表型特征，對(duì)可疑的異常小鼠進(jìn)行編號(hào)、基因型鑒定、血液學(xué)及組織病理切片檢查。 1.2.2 血液學(xué)檢查 將 2 月齡W-3Bao突變雜合子小鼠與背景B6 小鼠公母各 20 只，眶靜脈采血用于血涂片及血常

18、規(guī)檢測(cè)。將胚胎 18.5 天小鼠斷頭采血20 L，經(jīng) 0.5 mL抗凝稀釋液稀釋后用SYSMEX KX-21 血細(xì)胞自動(dòng)分析器檢測(cè)，待基因型鑒定后分組。純合子小鼠 4 只為觀察組，雜合子和野生型共 4 只設(shè)為對(duì)照組。采血同時(shí)，取適量血液做血涂片，瑞氏后染色后鏡檢。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)。 1.2.3 組織病理學(xué)檢查 2 月齡正常B6 小鼠及W-3Bao雜合子小鼠各 6 只，每種小鼠雌雄各 3 只，脫頸椎處死，取腦、心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腎上腺、小腸組織、小腸淋巴結(jié)和生殖腺等主要臟器，用 4%甲醛固定。取 18.5 天胎齡的正常及蒼白的整體胎鼠各 6 只，經(jīng)Bouin液固定。整體胚胎或組織塊適

19、當(dāng)修剪后，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、6 m 厚度切片（整體胚胎行連續(xù)切片，每 10 片取 1 片）、HE染色和鏡檢。 1.2.4 突變小鼠的基因型鑒定 樣本基因組DNA 的準(zhǔn)備：將有待基因型鑒定的突變系小鼠編號(hào)并剪取 0.5 cm鼠尾，參考分子克隆手冊(cè)，采用蛋白酶K 消化、酚氯仿法提取基因組DNA (Sambrook et al 2002）。PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為 50 L，其中基因組DNA模板 2 L，上游引物 0.5 L(50 pmol/L)，下游引物 0.5 L(50 pmol/L),10Reaction buffer(含Mg2+)5 L, dNTP(10 mmol/L) 1 L, L

20、A Taq polymerase (5 U/L) 0.5 L，補(bǔ)滅菌超純水至總體積 50 L。PCR反應(yīng)條件：94預(yù)變性 3 min；94 35 s，54 35 s，72 80 s，35 個(gè)循環(huán)； 后在 72延伸 10 min。測(cè)序及基因型鑒定：PCR產(chǎn)物膠回收后送上海生工測(cè)序部測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar比對(duì)尋找突變部位后，再用Chromas軟件觀察測(cè)序峰圖，依據(jù)先前研究結(jié)果，Kit基因編碼區(qū)第 441 位堿基處出現(xiàn)明顯重疊波（T與A）為雜合子，出現(xiàn)單一T波為野生型，出現(xiàn)單一A波為突變純合子小鼠（Xue et al，2007）。 2 結(jié) 果 2.1 W-3Bao白斑小鼠的遺傳實(shí)驗(yàn) 將W-3

21、Bao白斑雜合子（圖 1）互交繁殖了 30 只小鼠，在子代小鼠中均未出現(xiàn)新的表型或見(jiàn)到白斑區(qū)域顯著擴(kuò)大。將 30 只雜合子互交后代（有白斑）與正常B6 配種，每一窩后代均見(jiàn)到正常毛色的子代小鼠，故推測(cè)這 30 只雜合子互交后代白斑小鼠均為雜合子，而純合子小鼠可能在胚胎期死亡。 2.2 W-3Bao小鼠的胚胎發(fā)育 圖 1 W-3Bao突變小鼠 Fig. 1 The W-3Bao mutant mouse 突變基因雜合子表型為腹部、四肢末端及尾部末端白化，右側(cè)為 Kit 突變位點(diǎn)（A/T 雜合子）。 The heterozygous shows white belly, limb terminal

22、s and tail tip. Right picture shows the mutation, site of Kit, which is the heterozygous of A and T. 將W-3Bao雜合子小鼠配種檢栓，在孕 10.5、12.5 天剖檢母鼠各 5 只，肉眼未見(jiàn)胎鼠異常；至孕 14.5 天，部分胎鼠身體稍白，大小形狀基本正常；孕 16.5 天，可見(jiàn)所有胎鼠存活、活動(dòng)，部分胎鼠明顯蒼白、個(gè)體略??；孕 18.5 天，胎鼠全部存活、活動(dòng)正常，部分胎鼠明顯蒼白，個(gè)體矮??；初生小鼠中常見(jiàn)死胎，存活小鼠外觀正常，未見(jiàn)色澤蒼白小鼠。結(jié)合基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)蒼白胎鼠及出生死亡小鼠為突

23、變基因純合子小鼠，突變雜合子胎鼠與野生型小鼠外觀無(wú)區(qū)別（圖 2，3）。本實(shí)驗(yàn)一共解剖 10 只孕 18.5 天母鼠，獲得胎鼠 56 只，其中色澤蒼白小鼠 12 只，色澤蒼白小鼠與全部胎鼠的比例與理論上純合子小鼠數(shù)量相近，說(shuō)明純合子小鼠可以存活至孕 18.5 天至出生前后。 2.3 血涂片及血常規(guī)檢測(cè) 對(duì) 2 月齡左右的W-3Bao白斑小鼠與B6 背景小鼠血涂片觀察及血液常規(guī)分析未發(fā)現(xiàn)存在差異（結(jié) 圖 2 部分標(biāo)本 Kit 基因突變區(qū)基因組局部的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 Fig. 2 PCR Product of local genome 第 1 泳道為 DL2000 DNA marker，第 2、3

24、 泳道為 Kit 基因組擴(kuò)增產(chǎn)物。 Lane 1 was DL2000 DNA marker; Lane 2 and 3 were PCR products of local genome. 圖 3 孕 18.5 天胎鼠外觀及基因型鑒定 Fig. 3 External appearance and genotypes of mouse embryos of 18.5-day old 下列為 18.5 天胎鼠，上列為對(duì)應(yīng)基因型；中間兩只胎鼠外觀蒼白，個(gè)體矮小，為突變純合子小鼠；左側(cè)兩只為野生型胎鼠，右側(cè)兩只為雜合型胎鼠；野生型及雜合型色澤紅潤(rùn)、形態(tài)大小正常，外觀無(wú)明顯區(qū)別。 Lower: 18.

25、5-day-embryos; Upper: the genotypes of corresponding mice. The two mice in the middle are homozygous, they look pale and dwarf. The right two mice are heterozygous and the left two mice are wild type, all of them look ruddy and normal. 果未顯示）。胚齡 18.5 天的野生型或突變雜合子小鼠血液色澤深紅，鏡下血細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞大小形態(tài)正常。與野生型相比，胚齡 18

26、.5 天的突變純合子小鼠血液顏色明顯淺淡，血涂片中細(xì)胞數(shù)量較少，紅細(xì)胞形狀正常、直徑顯著增大（圖 4）。血常規(guī)檢測(cè)見(jiàn)突變純合子小鼠的紅細(xì)胞（RBC）數(shù)量、血紅蛋白量（HGB），紅細(xì)胞壓積（HCT）顯著低于野生型或雜合子； 突變純合子小鼠的平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均血紅蛋白含量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）顯著高于野生型；突變純合子小鼠的血小板（PLT）數(shù)量低于野生型或雜合子；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，上述數(shù)據(jù)均有顯著差異性。結(jié)合血涂片觀察，突變純合子小鼠被診斷為大紅細(xì)胞性貧血。具體數(shù)值見(jiàn)表 1。 2.4 組織病理學(xué)觀察 W-3Bao雜合子小鼠腦、心、肝、脾、肺、腎、 圖 4 本研究中小鼠的血

27、涂片 Fig. 4 Pictures of blood film for the mice studied a：突變基因純合子小鼠W-3Bao/3Bao；b：野生型小鼠B6+/+。瑞氏染色400。 a: From the homozygous mouse W-3Bao/3Bao; b: From wild type mouse B6+/+. Wrights staining 400. 表 1 本研究中小鼠的血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果 Tab. 1 Detection results of blood routine items for the mice studied 野生型及突變雜合子小鼠 (XS) W

28、ild type and heterozygous mice W-3Bao突變純合子小鼠 (XS) W-3Bao/-3Bao homozygous mice P 值 （t 檢驗(yàn)）)P value (t test) 白細(xì)胞數(shù)量(WBC)(109) 51.14 3.950.57 0.100.20 紅細(xì)胞數(shù)量(RBC)(1012) 3.120.69 0.210.09 0.001 血紅蛋白量(HGB)(g/L) 107.5018.43 20.55.26 0.001 紅細(xì)胞壓積(HCT)(L/L) 0.3410.069 0.0340.015 0.01-0.02 平均紅細(xì)胞體積(MCV)(f/L) 109

29、.856.68 154.257.69 0.001 平均血紅蛋白含量(MCH)(pg) 34.752.21 100.2516.23 0.001 平均血紅蛋白濃度(MCHC)(g/L) 316.509.47 653.5130.47 0.0020.005 血小板數(shù)量(PLT)(109) 422127.24 112.597.12 0.010.005 胸腺、腎上腺、小腸組織、小腸淋巴結(jié)和卵巢等主要臟器的石蠟切片均未發(fā)現(xiàn)顯著異常；睪丸大小基本正常，大多數(shù)生精小管發(fā)育正常，其內(nèi)可見(jiàn)處于不同發(fā)育階段的各級(jí)生精細(xì)胞；少數(shù)生精小管內(nèi)無(wú)生精細(xì)胞，只見(jiàn)支持細(xì)胞，管腔內(nèi)含有分泌物，HE 染色呈粉紅色泡沫狀（圖 5）。1

30、8.5 日齡整體胎鼠的連續(xù)石蠟切片中，生殖腺結(jié)構(gòu)明顯異常：野生型雄鼠睪丸中精曲小管結(jié)構(gòu)清晰，精原細(xì)胞位于精曲小管內(nèi)及睪丸間質(zhì)中（圖 6a,b）；W-3Bao/3Bao雄鼠精曲小管輪廓不清，部分有形成精曲小管趨勢(shì)，精原細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)與野生型相當(dāng)，但這些細(xì)胞全部位于睪丸間質(zhì)中，尚未遷入精曲小管（圖 6c，d）。野生型母鼠卵巢，細(xì)胞排列呈團(tuán)塊狀或條索狀，卵原細(xì)胞深染，周圍呈空泡狀，形成原始卵泡結(jié)構(gòu)（圖 6e,f）；W-3Bao/3Bao卵巢內(nèi)細(xì)胞密集，彌散片狀排列，未形成原始卵泡基本結(jié)構(gòu)（圖 6g, h）。骨髓、肝、脾等造血器官及其他器官未見(jiàn)顯著異常（骨髓切片見(jiàn)圖 7）。 圖 5 HE染色示W(wǎng)-3B

31、ao雜合子小鼠睪丸結(jié)構(gòu) Fig. 5 Testis structure of W-3Bao heterozygous mouse and control by HE staining a, b為B6 +/+小鼠; c, d為W-3Bao/+小鼠。*示發(fā)育異常精曲小管; HE染色。a, c 100，b, d分別為a, c黑框部分放大（400）。 a and b were B6+/+ mouse, c and d were W-3Bao/+ mouse. Abnormal contorted seminiferous tubules are marked with *. HE staining,

32、a and c 100, b and d 400 for the box part of a and c respectively. 圖 6 18.5 天小鼠胚胎生殖腺結(jié)構(gòu) Fig. 6 Genital gland structure of mouse embryo at the age of 18.5 day a，b為B6 +/+小鼠睪丸（以t示之），黃色箭頭示精曲小管內(nèi)精原細(xì)胞，黑色箭頭示睪丸間質(zhì)中精原細(xì)胞；c，d為W-3Bao/3Bao小鼠睪丸，黑色箭頭示睪丸間質(zhì)中精原細(xì)胞，精曲小管內(nèi)則無(wú)精原細(xì)胞；e, f為B6+/+小鼠卵巢（以O(shè)示之），黑色箭頭示原始卵泡結(jié)構(gòu)；g, h為W-3Bao/

33、3Bao小鼠卵巢，細(xì)胞排列彌散，無(wú)原始卵泡結(jié)構(gòu)。HE染色，a, c, e, g 200，b, d, f, h 1000。 a and b were the testes of B6+/+ mouse marked with t, yellow arrows show the spermatogonium in contorted seminiferous tubules, black arrows show the spermatogonium in interstitial tissue of testis; c and d were the testes of W-3Bao/3Bao mo

34、use marked by t, black arrows show the spermatogonium in interstitial tissue of testis and no spermatogonium lies in contorted seminiferous tubules; e and f were the ovary of B6+/+ mouse marked with O, black arrows show primordial follicles; g and h were the ovary of W-3Bao/3Bao mouse marked with O,

35、 the cells are irregularly arranged and primordial follicles are not seen. HE staining, a, c, e, g 200 and b, d, f, h 1000. 圖 7 18.5 天小鼠胚胎骨髓切片 Fig. 7 Paraffin sections of bone marrow for the embryos of the 18.5-day-old mice a為B6 +/+小鼠，b 為W-3Bao/ -3Bao小鼠，兩者胚胎骨髓切片無(wú)顯著差異。HE染色，1000。 There is no significa

36、nt difference of bone marrow for the 18.5-day-old embryos between the B6 +/+ mouse (a) and the W-3Bao/ -3Bao mouse (b). HE staining 1000. 3 討 論 Kit蛋白由 975 個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含 3 個(gè)主要功能區(qū)域：一個(gè)具有 5 個(gè)免疫球蛋白類似重復(fù)序列的細(xì)胞外配體結(jié)合域，一個(gè)短的疏水跨膜域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶功能域，后者被一個(gè)短的疏水片段分隔成兩個(gè)部分，其配體是干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（stem cell factor, SCF）。SCF/c-kit共同參與多種細(xì)胞信

37、號(hào)的傳導(dǎo)，如：Jak/STAT信號(hào)途徑、PL3K途徑、Src 家族、Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)途徑，從而在造血及維持肥大細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和精原細(xì)胞的存活、增殖和分化過(guò)程中起著重要作用(Xiong et al, 2001； Linnekin et al，1999; Ronnstrand et al, 2004)。W-3Bao Kit基因編碼區(qū)第 441 位堿基由T顛換為A，使得其第 147 位密碼子由UAU變?yōu)榻K止密碼子UAA，導(dǎo)致 Kit基因只能編碼由 146 個(gè)氨基酸組成的部分胞外區(qū)部分，這種蛋白短肽只包括信號(hào)肽部分而不包含任何已知的功能結(jié)構(gòu)域（Xue et al，2007），故W-

38、3Bao 盡管是通過(guò)ENU誘變獲得，但由于產(chǎn)生終止密碼導(dǎo)致了無(wú)義突變，本質(zhì)上相當(dāng)于Kit基因敲除小鼠。在小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中（MGI），Kit基因突變系小鼠一共 97 例（/ javawi2/servlet/WIFetch?page=markerDetail&key=10 603）。有表型描述的Kit基因突變系小鼠共 38 種，其中 37 種有色素變化，22 種血細(xì)胞發(fā)生異常，15 種有生殖問(wèn)題。在所有Kit突變系小鼠中，17 種被鑒定出突變堿基，除 5 種大片段的插入或缺失，其余均為錯(cuò)義突變且多位于KIT蛋白的胞內(nèi)區(qū)，與 W-3Bao的

39、突變位點(diǎn)不同；另有 12 種基因剔除小鼠，其中11種都是采用Knock in策略研究單個(gè)位點(diǎn)的功能，引入的突變位點(diǎn)也全部集中在胞內(nèi)的兩個(gè)激酶區(qū)域，只有 1 種Kit剔除小鼠WlacZ與W-3Bao為接近。研究者用lacZ酶替代Kit研究其在胚胎期表達(dá)。WlacZ/lacZ小鼠患嚴(yán)重大紅細(xì)胞貧血并于出生后死亡，但作者未報(bào)道生殖腺發(fā)育過(guò)程(Florence et al, 1996)。W-3Bao與Kit基因敲除小鼠WlacZ相比，表型特征基本一致，研究結(jié)果可比性好。 W-3Bao突變雜合子一條染色體Kit正常表達(dá)，另一條同源染色體上則表達(dá)無(wú)功能的短肽， 終正常的KIT之間能形成二聚體，但是數(shù)量減少

40、，引起c-kit 依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的“單倍體功能不足”而出現(xiàn)白斑表型及部分精曲小管的發(fā)育異常，但本文發(fā)現(xiàn)突變雜合子的血細(xì)胞發(fā)育“似乎”不受影響，只有當(dāng)突變基因純合后，Kit基因的功能完全喪失，才出現(xiàn)大紅細(xì)胞貧血并在出生前后死亡。即便是Kit基因功能完全缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的大紅細(xì)胞貧血，W-3Bao也能存活至出生前后。這說(shuō)明胚胎早期造血功能并不完全依賴Kit信號(hào)過(guò)程，而晚期造血?jiǎng)t主要來(lái)源于Kit信號(hào)。Florence et al（1996）曾經(jīng)報(bào)道，哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中卵黃囊及胎肝先后發(fā)揮Kit信號(hào)依賴的造血功能，來(lái)源于胚內(nèi)體腔中胚層的背主動(dòng)脈及尿生殖嵴附近在胚胎 9.5 天至 12.5 天間有不依賴

41、Kit信號(hào)的造血功能。胚胎期背主動(dòng)脈及尿生殖嵴附近的造血功能是Kit功能缺失后，W-3Bao/ -3Bao小鼠能夠存活至出生前后的主要原因，而獨(dú)立于Kit信號(hào)機(jī)制之外的造血功能的意義以及他們與骨髓造血的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。而讓作者十分迷惑的是，W-3Bao/ -3Bao 小鼠在嚴(yán)重貧血的情況下(血色素只有正常的 1/15)，骨髓、肝臟及脾等造血相關(guān)器官并無(wú)顯著形態(tài)學(xué)變化。 成年W-3Bao雜合子小鼠表現(xiàn)為部分精曲小管內(nèi)生精過(guò)程異常，而純合子雄鼠在胚胎 18.5 天時(shí)精原細(xì)胞的數(shù)量并無(wú)顯著減少，但位于精曲小管之外，未能正常遷徙進(jìn)入精曲小管，有理由推測(cè)：正是由于精原細(xì)胞無(wú)法遷徙到精曲小管內(nèi)，導(dǎo)致W

42、-3Bao雜合子后續(xù)發(fā)育的異常，而不是這些精曲小管內(nèi)生精過(guò)程的過(guò)早退化。先前關(guān)于Kit與生殖腺關(guān)系的報(bào)道很多，但是都是描述純合子小鼠生殖腺的異常，如 W-wds小鼠在雜合子狀態(tài)下生殖腺正常，當(dāng)突變基因純合時(shí)精原細(xì)胞在小鼠出生后發(fā)育停止(Ruan et al, 2005)。在Kit突變雜合子出現(xiàn)部分精曲小管的發(fā)育異常的現(xiàn)象為本文首次報(bào)道。另外，幾乎所有資料強(qiáng)調(diào)Kit基因突變影響原始生殖細(xì)胞在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中的遷徙、增值、分化，但本文的研究結(jié)果提示：可能就是在胚胎后期，精原細(xì)胞未能遷徙到精曲小管內(nèi)才是導(dǎo)致W-3Bao小鼠睪丸異常的關(guān)鍵步驟。雌性小鼠卵巢在出生后有生殖周期的差異，在胚胎發(fā)育過(guò)程中無(wú)位置

43、變化，卵原細(xì)胞較早進(jìn)入卵巢，本文未能確定影響卵巢發(fā)育的關(guān)鍵步驟。 人類不育影響著大約 10%15%的夫婦，不育的原因男性約占 40%、女性約占 60%。男性原發(fā)性不育常伴有無(wú)精或寡精癥，遺傳因素占病因的 60% 左右。W-3Bao小鼠作為人類不育不孕的模型值得進(jìn)一步探討。盡管W-3Bao純合子小鼠生殖腺發(fā)育顯著異常，但是不能正常存活，尚無(wú)法直接作為人類不育不孕的模型進(jìn)行干預(yù)；W-3Bao雜合子睪丸發(fā)育異常，但在本實(shí)驗(yàn)中，W-3Bao雜合子小鼠互交后，解剖孕鼠 19 只，共獲得胎鼠 123 只，每窩 少 3 只、多 10 只、平均 6 只左右，這與正常背景B6 小鼠的繁殖能力并無(wú)太大差異；但考慮

44、物種差異， Kit 突變雜合子仍然可能影響生殖腺的發(fā)育，臨床工作中應(yīng)注意Kit突變雜合子與不育不孕的關(guān)系。與 W-3Bao小鼠雜合子一致，由于Kit基因突變導(dǎo)致的“花斑馬”白化?。ò唏g?。┰谌祟惒⒉缓币?jiàn)，表現(xiàn)為頭部或軀干腹側(cè)三角形白斑，多通過(guò)皮膚移植修復(fù)，Kit突變系小鼠為這類疾病的其他治療方法的開(kāi)發(fā)提供了材料（Fleischman et al, 1991）。人類由于葉酸或維生素B12 缺乏、DNA合成障礙導(dǎo)致大紅細(xì)胞性貧血。依據(jù)現(xiàn)有資料，W-3Bao純合子小鼠的大紅細(xì)胞貧血不太可能與人類的大紅細(xì)胞貧血有一致的病因，但由于十分相似的表型特征，兩者之間有可能存在部分相同的機(jī)制。另一方面，本研究也

45、提醒相關(guān)研究者，人類大紅細(xì)胞貧血也可能存在其他致病原因，尤其人類大紅細(xì)胞貧血病人經(jīng)補(bǔ)充葉酸或維生素B12 治療效果不佳的病例也應(yīng)該考慮Kit功能缺失的可能性。 本實(shí)驗(yàn)僅僅就突變基因純合子小鼠的血液學(xué)及組織病理變化進(jìn)行了初步研究，據(jù)報(bào)道，Kit基因具有顯著的“多效性”，在人類及小鼠，KIT及其配體KITL突變除了黑色素細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞及造血細(xì)胞外，還可能引起肥大細(xì)胞減少及肝細(xì)胞發(fā)育異常等（Broudy，1997; Rajaraman et al，2003；Kapur et al, 1999；Magnol，2007）。由于W-3Bao純合子小鼠能夠存活至出生前后，而且根據(jù)小鼠外觀即可識(shí)別純合子，

46、這一小鼠不僅是研究胚胎造血機(jī)制以及生殖細(xì)胞發(fā)育的極好模型，而且對(duì)研究Kit基因功能缺失導(dǎo)致的其他異常表型的發(fā)育提供了材料。 致謝：感謝杭州師范大學(xué)鐘本土教授對(duì)小鼠胚胎切片的讀片、診斷工作。 參考文獻(xiàn)： Balling R. 2001. ENU mutagenesis: analyzing gene function in mice J. Annu Rev Genomics Hum Genet, 2: 463-492. Broudy VC. 1997. Stem cell factor and hematopoiesis J. Blood, 90(4): 1345-1364. Cable J,

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