南醫(yī)生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告5

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)并使用鹽析法進(jìn)行蛋白質(zhì)的初步分離純化；2.學(xué)習(xí)并使用凝膠層析法對(duì)鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行脫鹽；3.學(xué)習(xí)并使用離子交換層析法對(duì)脫鹽的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化；4.學(xué)習(xí)并使用醋酸纖維素薄膜電泳法對(duì)血清蛋白進(jìn)行純度鑒定。二、實(shí)驗(yàn)原理1.鹽析法初步提取血清蛋白 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的，以上這兩個(gè)因素中任何一個(gè)受到破壞，都會(huì)降低膠體的穩(wěn)定性，即是蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集進(jìn)而沉淀出來(lái)。由于血清中蛋白質(zhì)的顆粒大小、所帶電荷和親水程度不同，所以鹽析所需的鹽濃度也不一樣。因此，利用不同濃度的硫酸銨溶液分段鹽析，便

2、可將血清中清蛋白和球蛋白從溶液中沉淀出來(lái)。2. 凝膠層析法對(duì)鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行脫鹽用鹽析法初布分離得到的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)進(jìn)一步地純化，所以必須先將其中的中性鹽去除。本實(shí)驗(yàn)采用的是凝膠層析法，利用的是蛋白質(zhì)與無(wú)機(jī)鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過(guò)SephadeG-25凝膠柱時(shí)，分子直徑小的無(wú)機(jī)鹽會(huì)進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔中，而分子直徑大的蛋白質(zhì)不會(huì)進(jìn)入其中。因此在洗脫過(guò)程中，大分子的蛋白質(zhì)會(huì)先于小分子的中性鹽被洗脫出來(lái)，從而達(dá)到脫鹽的目的。3. 離子交換層析法對(duì)脫鹽的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化清蛋白及、球蛋白的pI6.5 ，帶負(fù)電荷；球蛋白pI6.5。、】6.5，帶正電荷。往離子交換柱中

3、加入0.02mol/LNH4Ac，pH=6.5。離子交換是指溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的交換。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑，帶負(fù)電的交換劑稱為陽(yáng)離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素帶正電荷，是一種陰離子交換劑。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液中尚有各種球蛋白，因此可以利用它們等電點(diǎn)不同進(jìn)行分離。具體原理如下：（1）清蛋白及、球蛋白被層析柱吸附；球蛋白被洗脫。清蛋白pI=4.9，帶負(fù)電荷多；、球蛋白pI為5.05.2，帶負(fù)電荷少。往離子交換柱中加入0.06mol/LNH4Ac，pH=6.5。（2）清蛋白仍被層析柱吸附；、球蛋白被洗脫。緩沖液離子強(qiáng)度增加。往離子交換柱中加入0.3mol/LNH4

4、Ac，pH=6.5。（3）清蛋白被洗脫。4. 醋酸纖維素薄膜電泳法對(duì)血清蛋白進(jìn)行純度鑒定醋酸纖維素薄膜電泳是利用醋酸纖維素做固體支持物的電泳技術(shù)。該薄膜具有均一的泡沫結(jié)構(gòu)（厚約120m），滲透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)阻力小。蛋白質(zhì)是兼性離子，在pH小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；在pH大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。血清中含有清蛋白，-球蛋白，-球蛋白，-球蛋白等蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)均具有其不同的等電點(diǎn)、氨基酸立體構(gòu)象和相對(duì)分子質(zhì)量（見(jiàn)下表），因此在同一電場(chǎng)中也具有不同的泳動(dòng)速度。據(jù)此分離后將薄膜置于染色液中使蛋白質(zhì)固定并染色，可見(jiàn)清晰的條帶。蛋白質(zhì)名

5、稱等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量（104）清蛋白4.886.91-球蛋白5.06202-球蛋白5.0630-球蛋白5.129-15-球蛋白6.85-7.5015.6-30 用此方法分離的蛋白條帶從陽(yáng)極至陰極的順序?yàn)椋呵宓鞍住?-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白。三、材料與方法：1.實(shí)驗(yàn)材料樣品：健康人血清試劑：20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、0.3mol/lpH6.5醋酸銨緩沖液、0.06mol/lpH6.5醋酸銨緩沖液、0.02mol/lpH6.5醋酸銨緩沖液、1.5mol/lNaCl-0.3mol/lNH4Ac溶液、飽和醋酸銨溶液儀器：離心機(jī)、試管、燒杯、加樣槍、層析柱、黑色反應(yīng)板、鐵固定

6、架、螺旋夾、電泳儀和電泳槽2.實(shí)驗(yàn)流程取0.8ml血清，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min。沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解。上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白）約0.8ml。將樣品過(guò)SephadeG-25凝膠柱（1cm7cm）。將樣品過(guò)SephadeG-25凝膠柱。用1ml0.02mol/L NH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁。用1ml0.02mol/L NH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁。繼續(xù)用2ml 0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml。繼續(xù)用2ml 0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩

7、沖液洗脫，流出液量約1ml?；腔畻钏釞z測(cè)蛋白質(zhì)至呈陽(yáng)性反應(yīng)，收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d?；腔畻钏釞z測(cè)蛋白質(zhì)至呈陽(yáng)性反應(yīng)，收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d。層析柱所剩溶液可能磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)同時(shí)呈陽(yáng)性，故繼續(xù)用0.02mol/L NH4Ac緩沖液洗滌約2ml，直至BaCl2檢測(cè)SO42-呈陰性。層析柱所剩溶液可能同時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)呈陽(yáng)性，故繼續(xù)用0.02mol/L NH4Ac緩沖液洗滌約2ml，直至BaCl2檢測(cè)SO42-呈陰性。用2-3ml0.02mol/L NH4Ac緩沖液再生平衡。用2-3ml0.02mol/L NH4Ac緩沖液再生平衡。離子交換柱層析純化。除鹽后收集的

8、清蛋白。除鹽后收集的球蛋白。過(guò)DEAE-纖維素層析柱。過(guò)DEAE-纖維素層析柱。用1ml 0.06mol/L NH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁。用1ml 0.02mol/L NH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁。用約5mL 0.06mol/L NH4Ac緩沖液流洗，除去-球蛋白和-球蛋白。繼續(xù)用3ml 0.02mol/L pH6.5 NH4Ac緩沖液洗脫，流出液量約2ml。用3ml 0.3mol/L NH4Ac緩沖液洗脫，流出液量約2.5ml?；腔畻钏釞z測(cè)蛋白質(zhì)至呈陽(yáng)性反應(yīng)，收集含有蛋白質(zhì)的峰液10d?；腔畻钏釞z測(cè)蛋白質(zhì)至呈陽(yáng)性反應(yīng)，收集含有蛋白質(zhì)的峰液10d。DEAE-纖維素柱無(wú)需再生，可直接用

9、于純化清蛋白。純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）。DEAE-纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4Ac溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4Ac緩沖液流洗再生平衡。四、結(jié)果與討論：1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果如下圖：2. 結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：所分離提純的-球蛋白和清蛋白較純，醋酸纖維素薄膜電泳分離情況良好。經(jīng)查閱資料與和同學(xué)討論得以下影響因素及注意事項(xiàng)：（1）取上清液時(shí)盡量全部吸出，但不得吸出沉淀物；（2）當(dāng)層析柱上的緩沖液面或樣品液面剛好下降到凝膠床表面時(shí)，注意不要使液面低于凝膠床表面以下，以免空氣進(jìn)入凝膠床；（3）往層析柱加樣品

10、或用緩沖液洗脫時(shí)，要小心緩慢地加，注意不要講凝膠粒沖起或破壞凝膠床表面的平整；（4）一定要注意區(qū)別檢測(cè)蛋白質(zhì)的磺基水楊酸和檢測(cè)SO42-的BaCl2，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色；（5）洗脫時(shí)要注意及時(shí)收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰流失；（6）葡聚凝膠價(jià)格昂貴，要回收再生，避免損耗，嚴(yán)禁倒掉；（7）點(diǎn)樣時(shí)切勿用力按壓，以免破壞醋酸纖維薄膜的內(nèi)部網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)；（8）點(diǎn)樣時(shí)要注意不要蘸取過(guò)多的樣品，以免蛋白質(zhì)含量過(guò)高，染色之后著色淺，且蛋白質(zhì)分離不佳；（9）點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，

11、影響分離效果；（10）電泳過(guò)程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，電流強(qiáng)度高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白質(zhì)變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過(guò)低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散；（11）本次實(shí)驗(yàn)所用的試管較多，應(yīng)做好標(biāo)記和記錄。3.討論總結(jié)（1）硫酸銨鹽析一步,為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸銨? 因?yàn)榍宓鞍缀颓虻鞍椎柠}析濃度不一樣，使用半飽和硫酸銨溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml飽和硫酸銨混合可以形成半飽和硫酸銨溶液從而達(dá)到分離的目的。（2） 為什么實(shí)驗(yàn)中DEAE纖維素柱分離-球蛋白后不用再生,可直接用于純化清蛋白? 因?yàn)镈

12、EAE纖維素帶正電荷，是一種陰離子交換劑，而-球蛋白帶正電荷，不與DEAE纖維素結(jié)合，會(huì)從層析柱中首先洗脫出來(lái)。所以DEAE纖維素柱分離-球蛋白后可直接用于純化清蛋白。（3） 應(yīng)用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定分離純化后的血清清蛋白和-球蛋白的純度,根據(jù)什么來(lái)確定它是清蛋白還是-球蛋白?判定它們純度的依據(jù)是什么?蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量（104）清蛋白4.886.91-球蛋白5.06202-球蛋白5.0630-球蛋白5.129-15-球蛋白6.85-7.5015.6-30血清中含有清蛋白，-球蛋白，-球蛋白，-球蛋白等蛋白質(zhì)，每種蛋白質(zhì)均具有其不同的等電點(diǎn)、氨基酸立體構(gòu)象和相對(duì)分子質(zhì)量（見(jiàn)下表），因此在同一電場(chǎng)中也具有不同的泳動(dòng)速度。據(jù)此分